Tramite ELETTROFORESI

le proteine si possono separare in base a una o piu’ delle seguenti caratteristiche :

dimensione , carica o idrofobicita’ relativa.

Analisi elettroforetica delle proteine

CAPITOLO 10 nuovo testo

Capitolo 12 vecchio testo.

La separazione elettroforetica si effettua su una matrice solida poiché durante la migrazione in un campo elettrico si generano

forze convettive e di diffusione

Perché si usa una matrice solida per alcuni tipi di elettroforesi?

Da cosa sono generate queste forze?

Le proteine sono cariche ad un pH differente dal loro punto isoelettrico

 

Punto isoelettrico (pI) e’ il valore di pH al quale il numero delle cariche negative sulla molecola prodotta dalla ionizzazione del gruppo

carbossilico risulta uguale al numero delle cariche positive acquisite dal gruppo amminico

Le molecole cariche migrano in un campo elettrico in maniera dipendente dalla loro densita’ di carica.

Una proteina carica che è posta in un campo elettrico ha una distanza di migrazione proporzionale sia alla intensità di corrente (I) che al tempo (t ).

Al punto isoelettrico la molecola e’ elettroforeticamente immobile .

La corrente nella soluzione tra gli elettrodi e’ condotta principalmente dagli ioni del tampone di corsa

e solo in piccola parte dagli ioni del campione.

La legge di Ohm esprime la relazione tra corrente (I), voltaggio (V), e resistenza (R):

R = V / I

SI può quindi accellerare una separazione elettroforetica aumentando il voltaggio applicato,

MA…….

La maggior parte della potenza sviluppata durante elettroforesi

viene dissipata in calore

Durante l’elettroforesi

la potenza (W= watts) generata nel mezzo di supporto e’ data da :

W = I2 R R= resistenza

I= intensità della corrente

Aumentando il voltaggio necessariamente si genera CALORE

Problemi derivanti dallo sviluppo di calore durante elettroforesi.

2. Formazione di correnti convettive =possono

causare un miscelamento del campione

3. Instabilita’ termica dei campioni=denaturazione delle proteine sensibili al calore conseguente perdita di attivita/folding

1.Maggiore tasso di diffusione del campione e degli ioni del buffer =allargamento delle bande da

separare

4.Diminuita viscosita’ del buffer = riduzione della resistenza del mezzo

Questi pori non hanno una struttura regolare

la dimensione dei pori si controlla variando la concentrazione di agarosio:

piu’ grande e’ il numero delle eliche formate per unita’ di spazio e piu’ piccola sara’ la dimensione media dei pori

,

Gel di agarosio i pori sono formati da molecole di polisaccaridi

che partecipano alla formazione di strutture a doppia elica

Gel di poliacrilammide: miscela di bis e monoacrilammide

Una singola molecola di bis acrilammide e’ essenzialmente formata da due molecole di acrilammide unite da un gruppo metilico.

La poliacrilammide polimerizzata ha matrice molto regolare con pori di dimensioni uniformi

I monomeri di acrilammide formano catene e le molecole di bis-acrilammide danno i metili che formano

i ponti cross-lincanti

La polimerizzazione della acrilammide avviene in presenza di TEMED e AMMONIO PERSOLFATO

TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con

la produzione di un radicale libero SO4- . =R*

S2O82+ + e- SO4

2- + SO4- .

Il radicale libero (R*= SO4- . )

è una molecola con un elettrone spaiato

R* sono specie molto reattive.

Occasionalmente si procede alla degassazione della acrilammide mix poiche’ l’ ossigeno rimuove i radicali

Durante le polimerizzazione Il radicale libero

(R*= SO4- . ), che è una molecola con un elettrone spaiato,

reagisce con M (monomero di acrilammide)

R*+M RM*+M RMM*

e forma un legame singolo condividendo il suo elettrone spaiato con uno proveniente dal guscio esterno della molecola del monomero …e così via

PolyAcrylamide Gel Electrophoresis (PAGE)

Separazione dellle proteine tra 5 to 2,000 kDal

e’ stata introdotta da by Raymond and Weintraub (1959). .

La dimensione dei pori si puo’ controllare variando la percentuale di acrilammide e/o Bis-acrilammide (da 3% a 30%),

SDS –PAGE(gel denaturante)

Il detergente anionico SDS

distrugge i legami idrogeno, blocca le interazioni idrofobiche e sostanzialmente denatura le

molecole proteiche

minimizzando così le differenze dovute alla forma molecolare

eliminando le strutture secondarie e terziarie.

Il detergente anionico SDS = CH3-(CH2)10-CH2OSO3-Na+

Le proteine possono essere completamente denaturate quando

sostanze riducenti quali DTT e’ utilizzato insieme al SDS.

http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/method/SDSPAGE/SDSPAGE.html#SDS

La maggioranza delle proteine lega

1.4g SDS per grammo di proteina

Il legame del SDS alle proteine causa

un’ efficace mascheramento delle cariche intrinseche della catena polipeptidica

e

apporta una carica netta negativa

proporzionale alla lunghezza del polipeptide

SDS-PAGE

il miscuglio proteico si separa secondo l’effettivo raggio molecolare (Mr) di ciascuna proteina, che e’ approssimativamente uguale alla dimensione molecolare di ciascun polipeptide.

http://www5.amershambiosciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/Elpho_1D_SDS+PAGE

risultato sarà la separazione delle proteine per setacciamento attraverso i pori del gel di poliacrilammide

Esistono due tipi di sistemi di buffers:

continui e discontinui

TAMPONI usati per SDS-PAGE

Buffer discontinuo di Ornstein and Davis (1964) modificato da Laemnli

Laemmli buffer E’ il piu’ comune buffer utilizzato per SDS-PAGE gels

I

Caricamento

Stacking

run

Separating

Laemmli buffer e’ costituito da

a) Stacking (o gel di impaccamento) con grandi pori

b)Separating gel (12%, 10%, 6% etc.).

Stacking gel ha pori di grandi dimensioni

(4% acrilammide) che permettono alle proteine di muoversi liberamente e di

concentrarsi sotto l’ effetto del campo elettrico.

RUNLoading

Lo scopo del gel di impaccamento è di concentrare le proteine in un banda sottile prima che ilcampione entri nel gel separatore

Una volta applicata la corrente..le bande di proteine si assottigliano a causa del fatto che gli ioni di glicinato (carichi -) presenti nel tampone elettroforetico hanno mobilità elettroforetica più bassa dei complessi proteina-SDS

ioni di glicinato<complessi proteina-SDS< ioni cloruro (Cl-)

NELLO STACKING GEL

I complessi proteina-SDS a loro volta hanno una mobilità elettroforetica, inferiore a quella degli ioni cloruro (Cl-) presenti nel tampone di caricamento (sample buffer)

Separating gel

Separazione

Raggiunto il gel di separazione, il glicinato a causa dell’ ambiente a pH maggiore diventa completamente ionizzato e cresce la sua mobilita’elettroforetica

Il gel di separazione (separating gel) ha pH 8.8 mentre quello di

impaccamento (stacking gel) ha pH 6.8.

Il risultato e’ che nel gel separante i complessi proteins_SDS (carichi negativamente)

si muovono verso il polo positivo in funzione del setaccio molecolare operato dal gel di poliacrilammide quindi in funzione del loro peso molecolare (MW=kDal)

Cioè : le proteine piu’ piccole migreranno piu’ velocemente di quelle piu’ grandi a che saranno

rallentate da resistenze frizionali

-65

-20

-180

ALTRI TIPI DI GEL DI POLIACRILAMMIDE

a) GEL NATIVOSDS è assente e le proteine non vengono denaturate prima del caricamento

Le proteine migrano in dipendenza della loro carica

b) GEL a GRADIENTE (tipicamente 5% a 25% )

Permette una maggiore separazione delle proteine con massa simile

Rilevazione delle proteine su gel

con Comassie Blue

Il colorante Comassie brilliant blue-G250 (CBB) si lega alle proteine tramite

interazioni elettrostatiche dei gruppi sulfonici del colorante.

La colorazione CBB visualizza bande con una concentrazione di circa 0.1µg di proteina.

Silver staining

Western blotting

trasferimento su membrana

di nitrocellulosa (NC) o polyvinylidene fluoride (PVDF)

delle proteine

separate tramite elettroforesi

APPARATI di traferimento

Liquido e SEMI-DRY

APPARATO DI TRASFERIMENTO Semi-dry

3MM

 

Direzione di migrazione

 Corrente applicata

Nel semi-dry si suggerisce di applicare 1mA/cm2 di membrana

in ogni caso mai piu’ di 5mA/cm2 senza refrigerazione!

Attenti alle bolle d’aria e all’essicamento della membrana

Il metanolo presente nel buffer fa :

1. decrescere la mobilita’ delle proteine durante l’ elettroforesi.

2. dissociare l’ SDS dalle proteine

3. aumentare le interazioni idrofobiche tra proteine e

membrana.

4. Denaturare le proteine ad alto peso molecolare e quindi

rende il loro passaggio dal gel alla membrana piu’

difficile. Le proteine piccole non sono invece influenzate

dalla presenza di metanolo.

BUFFER di TRASFERIMENTO :

Ruolo del metanolo e del SDS.

L’SDS da una carica negativa alla proteina

aiuta il traferimento delle proteine dal gel alla membrana NOTA CHE:

L’ SDS agisce in maniera opposta al metanolo per quel che rigurda il suo effetto sulla quantità di proteina che viene traferita dal gel alla membrana

Per migliorare il legame delle proteine con la membrana

si puo’ aumentare la concentrazione di metanolo (normalmente tra 10%-20%)

oppure

ridurre la sua concentrazione se le proteine rimangono nel gel.

Un’alta concentrazione di SDS, sebbene faciliti il trasferimento, può interferire con il legame delle proteine alla membrana

Apparato liquido

+buffer +tempo di corsa rispetto ad un semi-dry

Piu’ tempo le proteine sono a contatto con la membrana

e piu’ facilmente vi si legheranno

APPARATI di traferimento

Liquido

Quando si usa?

A) Si devono trasferire proteine ad alto peso molecolare poichè necessitano di piu’ tempo per essere trasferite e di maggiori quantita’ di buffer

B) Le proteine sono corse su gel ad alta concentrazione di acrilammide o molto spessi.

I tempi di trasferimento variano in dipendenza dalla dimensione delle proteine da trasferire, tipo di membrana e tipo di apparato per blotting utilizzato

semi-dry : max 2h

o liquido : fino a 28h

Tempi di trasferimento

Le membrane di PVDF lega le proteine principalmente attraverso interazioni

idrofobiche. sono comunemente usate per la loro i resistenza

chimica e per la stabilita’ fisiologica.

La nitrocellulosa (NC) lega le proteine primariamente tramite interazioni elettrostatiche o idrofiliche

TIPI di MEMBRANE per il trasferimento di proteine:

Membrane PVDF :

legano le proteine principalmente attraverso interazioni idrofobiche.

Esistono diversi tipi di membrane PVDF

Diversa porosità e resistenza

Membrane derivate con procedure che aggiungono cariche alla membrana PVDF in modo da permettere oltre che interazioni idrofobiche anche interazioni elettrostatiche.

Membrane PVDF derivate sono per esempio usate per legare DNA o RNA o per procedure di purificazione a scambio ionico delle proteine .

MEMBRANE DI NITROCELLULOSA (NC)

Sono meno sensibili della PVDF alle concentrazioni di SDS (eg. danno meno “background signal” ) perchè legano le proteine primariamente tramite interazioni elettrostatiche o idrofiliche. L’ SDS, coprendo le cariche delle proteine, puo’ impedire la formazioni di legami idrofobici con la PVDF ma non interferisce con la formazione deli legami elettrostatici con la NC.

Proteine che sono scarsamente trasferibili possono essere meglio trasferite poiche’ si puo’ utilizzare SDS nel buffer di traferimento (normalmente questo non e’ presente o e’ controproducente) .

La maggiore limitazione della nitrocellulasa e’ la sua scarsa capacita’ di legare proteine con basso peso molecolare e la fragilità

SVANTAGGI

PRO e contro la PVDF rispetto alla NC.

La PVDF e’ meglio per:

a) il trasferimento di proteine a basso peso molecolare perchè lega piu’ fortemente le proteine ma

1) e’ piu’ sensibile alla presenza di impurita’ presenti nel buffer (compreso SDS, glicina e Tris)

la presenza di queste sostanze sulla membrana puo’ dare origine ad

un alto “background”.

2) e’ piu’ difficile eluire le proteine da PVDF

quindi meglio NON usare PVDF in procedure che implicano la eluizione della banda proteica dalla membrana