Tesi sperimentale in Chimica Analitica

38
Determinazione simultanea di FANS in Determinazione simultanea di FANS in matrici complesse mediante HPLC-DAD. matrici complesse mediante HPLC-DAD. Confronto tra materiali a base di Confronto tra materiali a base di silice e polimerici nell’estrazione silice e polimerici nell’estrazione liquido-solido (SPE) impiegati per la liquido-solido (SPE) impiegati per la preparazione del campione. preparazione del campione. Università degli studi “G. D’Annunzio” Chieti-Pescara Facoltà di farmacia Corso di Laurea in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche

description

Determinazione simultanea di FANS in matrici complesse mediante HPLC-DAD. Confronto tra materiali a base di silice e polimerici nell’estrazione Liquido-Solido (SPE) impiegati per la preparazione del campione.

Transcript of Tesi sperimentale in Chimica Analitica

Page 1: Tesi sperimentale in Chimica Analitica

Determinazione simultanea di FANS in Determinazione simultanea di FANS in matrici complesse mediante HPLC-DAD.matrici complesse mediante HPLC-DAD.Confronto tra materiali a base di silice e Confronto tra materiali a base di silice e polimerici nell’estrazione liquido-solido polimerici nell’estrazione liquido-solido (SPE) impiegati per la preparazione del (SPE) impiegati per la preparazione del campione.campione.

Università degli studi “G. D’Annunzio” Chieti-Pescara Facoltà di farmacia

Corso di Laurea in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche

Page 2: Tesi sperimentale in Chimica Analitica

Farmaci antinfiammatori non steroideiFANS

Attività farmacologica

Anti-infiammatoria Antipiretica Analgesica

Usi

Terapia del dolore Artrite reumatoide Cefalea Patologie cardiovascolari

Meccanismo d’azione

Inibizione ciclossigenasi (COX1 e COX2)

Farmacocinetica

Ben assorbiti oralmente Metabolismo epatico Escrezione renale

Page 3: Tesi sperimentale in Chimica Analitica

FANS oggetto di studio

FANS

O

COOH

O

N

O COOH

O

COOH

O

COOH

F

COOH

O

N

COOH

O

Cl

COOH

Indometacina

Furprofene

Ketoprofene

Fenbufene

Ibuprofene

FlurbiprofeneIndoprofene

Page 4: Tesi sperimentale in Chimica Analitica

Caratteristiche dei FANS impiegati

Strutture PM (Da)

LogP pKa Siti accettori dilegame

idrogeno

Siti donatori di legame idrogeno

357 3.40 3.75 5 1

273 3.80 3.19 4 1

281 2.44 3.74 4 1

O

N

COOH

O

Cl

O

COOH

O

N

O COOH

Page 5: Tesi sperimentale in Chimica Analitica

Caratteristiche dei FANS impiegati

Strutture PM (Da)

LogP pKa Siti accettori dilegame

idrogeno

Siti donatori di legame idrogeno

254 3.20 3.88 3 1

206 3.60 4.85 2 1

244 3.57 4.40 2 1

254 3.20 4.22 3 1

O

COOH

COOH

F

COOH

O

COOH

Page 7: Tesi sperimentale in Chimica Analitica

Scelta della cartuccia SPE

Chimica

Massa adsorbente

Grandezza cartuccia

Page 8: Tesi sperimentale in Chimica Analitica

Materiali silicei

Cromatografia diretta Interazioni polari

Cromatografia inversa Interazioni idrofobiche

OSi

OH

C N

HO

OH

H2N

SO3

Page 9: Tesi sperimentale in Chimica Analitica

Materiali polimerici

Idrofobici PS-DVB

Misti PVP-DVB

N

N

O

O

Page 10: Tesi sperimentale in Chimica Analitica

Confronto tra materiali

Silicei

Poco costosi Facile introduzione di

gruppi polari o scambiatori ionici

Stabili 2<pH<8

Polimerici

Elevata area superficiale specifica (m2/g)

Moltepicità di interazioni (Van der Waals, legame idrogeno, π-π)

Facilmente modificabili

Stabili 2<pH<14

Page 11: Tesi sperimentale in Chimica Analitica

Massa adsorbente

Silicei capacità ≈5% massa di adsorbentePolimerici ≈10% massa di adsorbente

Es. 60 mg 6 mg (inclusa la matrice)

Page 12: Tesi sperimentale in Chimica Analitica

Il processo SPE

1. Condizionamento - Equilibrazione

3. Lavaggio

2. Caricamento

4. Eluizione

Page 13: Tesi sperimentale in Chimica Analitica

Condizionamento-Equilibrazione

Condizionamento Equilibrazione

Solventi organici come metanolo o acetonitrile servono per tenere “bagnata” la fase stazionaria.

Con acqua o con una soluzione tampone la fase stazionaria viene solvatata e resa disponibile per l’interazione con gli analiti.

Page 14: Tesi sperimentale in Chimica Analitica

Il processo SPE

= Matrice= Interferenza= Analita= Acqua/soluzione tampone= Solvente di lavaggio= Solvente d’eluizione

LavaggioCaricamento Eluizione

Page 15: Tesi sperimentale in Chimica Analitica

Polarità degli analiti+

Composizione della matrice+

Requisiti del solvente

= Meccanismo SPE

Scelta del metodo

Analita Matrice Meccanismo

Non-polare Acquosa Non polare

Polare Organica non-polare Polare

Ionico Acquosa/Organica Scambio ionico

Page 16: Tesi sperimentale in Chimica Analitica

Parte sperimentale

Pre-trattamento del campione

Estrazione liquido-solido SPE

Analisi HPLC

Page 17: Tesi sperimentale in Chimica Analitica

Preparazione e pre-trattamento

Ogni campione da 1 mL di plasma contiene:

5 µg di ketoprofene; 10 µg di furprofene, fenbufene, flurbiprofene, indoprofene; 20 µg di indometacina ed ibuprofene.

Eliminazione delle proteine plasmatiche:

1 mL plasma spiked + 2 mL di acetonitrile 2 gtt di acido ortofosforico

Centrifugazione a 2100 rpm per due volte

Separazione

Page 18: Tesi sperimentale in Chimica Analitica

Metodica SPE

1 mL MeOH 1 mL tampone fosfato

pH 7.4

1 mL di campione

1 mL di MeOH

1 mL di miscela MeOH-tampone fosfato pH 7.4

al 5%

Condizionamento - Equilibrazione

Caricamento

Lavaggio

Eluizione

Page 19: Tesi sperimentale in Chimica Analitica

Analisi HPLC

HPLC Waters ® con iniettore Rheodyne a sei vie

Rivelatore a serie di diodi (DAD)

Colonna cromatografica Hyperclone ® C18 (250 mm x 4.6 mm, 5 µm) Phenomenex®

Precolonna Pelliguard ® C18 (20 mm x 4.60 mm, 40 µm) Supelco®

Fase mobile: miscela binaria CH3CN-Tampone fosfato 20 mM , pH 2.5, 50:50 (v/v)

Velocità di flusso 1 mL/min

Colonna termostatata a 20 °C ± 1 °C

Page 20: Tesi sperimentale in Chimica Analitica

Analisi HPLC

O

N

COOH

O

Cl

O

COOH

O

COOH

COOHF

COOHO

COOH

O

N

O COOH

Page 21: Tesi sperimentale in Chimica Analitica

Linearità

[ ] µg/mL

Furprofene Indoprofene Ketoprofene Fenbufene Flurbiprofene Indometacina Ibuprofene

2.5 1,89·106

±1.76·104*

1.15·106

±5.16·103

1.40·106

±1.55·104

2.13·106

±1.56·104

1.55·106

±7.52·103

3.83·106

±1.01·104

8.39·105

±1.37·104

RSD% 0.9 0.4 1.1 0.7 0.4 0.2 1.6

25 2.24·106

±2.66·104

1.27·106

±3.97·104

1.61·106

±2.47·104

2.52·106

±8.44·104

1.83·106

±1.83·105

5.96·106

±4.13·104

1.16·106

±1.64·105

RSD% 1.2 3.2 1.5 3.3 9.9 0.69 14

50 4.46·106

±7.45·104

2.35·106

±8.28·104

3.22·106

±4.88·104

4.96·106

±4.33·104

3.86·106

±3.93·104

1.13·106

±4.35·104

2.34·106

±1.55·105

RSD% 1.6 3.5 1.5 0.8 1.0 3.8 6.6

75 6.87·106

±1.33·105

3.68·106

±1.01·105

5.03·106

±1.52·105

7.59·106

±1.63·104

5.75·106

±2.50·104

1.83·106

±4.62·104

3.52·106

±4.81·104

RSD% 1.9 2.7 3.0 2.1 0.4 2.5 1.4

100 9.27·106

±6.24·105

4.98·106

±3.87·105

6.63·106

±4.15·104

1.07·107

±7.03·105

8.14·106

±5.37·105

2.42·106

±1.52·105

4.40·106

±2.98·105

RSD% 6.7 7.7 6.2 6.7 6.6 6.3 6.7

* = DS, deviazione standard

Page 22: Tesi sperimentale in Chimica Analitica

Linearità

[ ] µg/mL

Furprofene Indoprofene Ketoprofene Fenbufene Flurbiprofene Indometacina Ibuprofene

125 1.11·107

±6.96·105

5.92·106

±7.38·105

8.05·106

±3.17·105

1.25·107

±1.14·105

9.85·106

±1.36·105

2.93·106

±4.98·105

4.50·106

±2.00·105

RSD% 6.3 12.4 3.9 0.91 13.8 19.9 4.4

150 1.31·107

±6.22·105

6.91·106

±3.32·105

1.03·107

±4.87·105

1.60·107

±8.16·105

1.13·107

±5.71·105

3.75·106

±4.69·105

7.04·106

±3.69·105

RSD% 4.7 0.48 4.7 5.1 5.0 12.5 5.2

175 1.49·107

±7.01·104

7.88·108

±3.92·105

1.16·107

±1.11·106

1.83·107

±6.99·105

1.42·107

±6.02·104

4.27·107

±1.98·105

8.00·106

±3.71·105

RSD% 4.7 4.9 9.61 3.8 4.2 4.6 4.6

200 2.30·106

±2.73·105

9.55·106

±3.99·105

1.39·107

±4.32·105

2.11·107

±1.04·106

1.71·107

±5.40·105

5.04·107

±5.44·104

1.02·106

±6.11·105

RSD% 1.2 4.2 3.1 4.9 3.1 1.1 5.9

250 2.47·107

±1.65·105

1.19·107

±1.47·104

1.60·107

±1.05·105

2.52·107

±1.11·105

1.98·107

±5.42·105

5.82·106

±9.75·104

1.20·107

±9.99·104

RSD% 0.56 0.1 0.65 0.44 2.74 1.6 0.8

* = DS, deviazione standard

Page 23: Tesi sperimentale in Chimica Analitica

Linearità

Rette ottenute per ogni analita

N

O COOH

O

COOH

Indoprofene

Ketoprofene

O

COOH

O

Furprofene

µg/mL

µg/mL

µg/mL

Page 24: Tesi sperimentale in Chimica Analitica

Linearità

O

COOH

F

COOH

Fenbufene

Flurbiprofene

µg/mL

µg/mL

Page 25: Tesi sperimentale in Chimica Analitica

O

N

COOH

O

Cl

COOH

Linearità

Indometacina

Ibuprofene

µg/mL

µg/mL

Page 26: Tesi sperimentale in Chimica Analitica

Risultati e discussione

R% = Recupero percentuale

100AreaArea

R%(standard)

(estratti)

Page 27: Tesi sperimentale in Chimica Analitica

Sep-Pak Vac ®, Waters ®

R%

Page 28: Tesi sperimentale in Chimica Analitica

Sep-Pak Vac ®, Waters ®

SiO

OO

Si

Si O

O

Si OSi

O

O

O

O

O

O

O

O O

O

Area superficiale Granulometria Porosità %C Capacità Impaccamento

325 m2/g 37-55 µm 125 Å 12 1 mL 50 mg

Page 29: Tesi sperimentale in Chimica Analitica

Oasis HLB ®, Waters ®

PVP-DVB

Page 30: Tesi sperimentale in Chimica Analitica

Oasis HLB ®, Waters ®

Area superficiale Granulometria Porosità Capacità Impaccamento

810 m2/g 25-35 µm 80 Å 1 mL 30 mg

O

N

COOH

O

Cl

N

O COOH

O

COOH

O

Oasis HLB Sep-Pak Vac

810 m2/g 325 m2/g

25-30 µm 37-55 µm

Indometacina

Furprofene

Indoprofene

Page 31: Tesi sperimentale in Chimica Analitica

StrataTM-X, Phenomenex ®

PVP-DVB

R%

Page 32: Tesi sperimentale in Chimica Analitica

StrataTM-X, Phenomenex ®

Area superficiale Granulometria Porosità Capacità Impaccamento

800 m2/g 33 µm 85 Å 1 mL 30 mg

O

N

COOH

O

Cl

Indometacina

F

COOH

COOH

Ibuprofene

Flurbiprofene

Page 33: Tesi sperimentale in Chimica Analitica

Bond-Elut TM Plexa TM, Varian ®

PS-DVB

R%

Page 34: Tesi sperimentale in Chimica Analitica

Bond-Elut TM Plexa TM, Varian ®

Area superficiale Granulometria Porosità Capacità Impaccamento

800 m2/g 40-55 µm 90 Å 1 mL 30 mg

O

COOH

Fenbufene

O

COOH

Ketoprofene

Page 35: Tesi sperimentale in Chimica Analitica

Evolute ABN ®, Argonaut®

PS-DVB

R%

Page 36: Tesi sperimentale in Chimica Analitica

Evolute ABN ®, Argonaut®

Area superficiale Granulometria Capacità Impaccamento

506 m2/g 17-50 µm 1 mL 25 mg

Evolute ABN Bond-Elut

506 m2/g 800 m2/g

17-50 µm 40-55 µm

Page 37: Tesi sperimentale in Chimica Analitica

Una visione completa…

Page 38: Tesi sperimentale in Chimica Analitica

CONCLUSIONI

Ottenimento di condizioni sperimentali all’interno delle quali tutti i FANS sono stati recuperati in percentuali ottimali.

In tempi di analisi contenuti è stato possibile separare e analizzare simultaneamente sette analiti.

Inoltre…

Questo metodo sviluppato può essere trasferito in campo clinico per il controllo sulle terapie che prevedono l’uso di FANS.