Sintesi di Farmaci:

Riprogettazione dei Processi.

Scuola di Ingegneria Industriale e dell’Informazione

Course 096125 (095857)

Introduction to Green and Sustainable Chemistry

Prof. Attilio Citterio

Dipartimento CMIC “Giulio Natta”

https://iscamapweb.chem.polimi.it/citterio/it/education/course-topics/

Attilio Citterio

L’Industria Farmaceutica.

*Michael Bartholow, PharmD, CACP, 2012_U.S.Medicines_Report.pdf

• Importante settore commerciale in Europa

L'Italia è nota avere lunga tradizione come produttore di farmaci

• Sintesi biotecnologica e biochimica

Ingegneria Genetica / Fermentazioni

• Sintesi Organica

Reazioni Chimiche / Purificazioni

• API (Active Pharmaceutical Ingredient)

– I composti nelle pillole che trattano le malattie

• Nel 2012, $325.8 Miliardi di vendite di medicine prescritte*

– $112 Miliardi di vendite per le 5 maggiori classi.

• L'uso di energia è tra 50-300 MJ·kg-1 di API

• L'uso di solventi è circa 300 kg·kg-1 di API

Attilio Citterio

I Primi 20 Prodotti (in Dollari Totali nel 2012).

Ordine Prodotto Produttore Vendite ($) Ordine Prodotto Produttore Vendite ($)

1 Nexium AstraZeneca $5,989,000,000 11 Singulair Merck & Company $3,300,000,000

2 Abilify Otsuka America $5,870,000,000 12 Rituxan Genentech $3,197,000,000

3 Crestor AstraZeneca $5,092,000,000 13 Plavix

Bristol-Myers

Squibb/sanofi-

aventis

$2,971,000,000

4Advair

DiskusGlaxoSmithKline $4,889,000,000 14 Atripla

Bristol-Myers Squibb

Gilead$2,899,000,000

5 Cymbalta Lilly $4,720,000,000 15Spiriva

Handihaler

Boehringer

Ingelheim$2,833,000,000

6 Humira Abbvie $4,609,000,000 16 Oxycontin Purdue Pharma $2,808,000,000

7 Enbrel Amgen $4,337,000,000 17 Januvia Merck & Company $2,670,000,000

8 Remicade Centocor $3,876,000,000 18 Avastin Genentech $2,661,000,000

9 Copaxone Teva CNS $3,581,000,000 19 Lantus sanofi-aventis $2,327,000,000

10 Neulasta Amgen $3,460,000,000 20 Truvada Gilead Sciences $2,305,000,000

Michael Bartholow, PharmD, CACP, 2012_U.S.Medicines_Report.pdf

Attilio Citterio

I Farmaci più Venduti

nel Mondo.

Vendite in miliardinel 2014

http://qz.com/349929/best-selling-drugs-in-the-world/

Attilio Citterio

Velocità di Successo di un Composto

Farmaceutico a Seconda dello Stadio.

Anni

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Scoperta(2-10 Anni)

Studi preclinici(test di lab. e animali)

Fase I20-80 volontari sani usati perdeterminare l’efficacia e il dosaggio

Fase II100-300 pazienti volontari usati pervalutare l’efficacia e gli effetti collaterali

Fase III1000-5000 pazienti volontari usati per

monitorare le reazioni per usi a lungo termine

Review FDA/Approvazione

UlterioriAccertamenti post-commercializzazione

1approvato dalla FDA

250Studi preclinici

5Studi inter clinici

Velocità di successo a seconda dello stadio

5000-10.000 testati

IND Filed NDA Filed

R&D richiede

6.5 - 13.5 anni

Fino a $800MM

Attilio Citterio

Il Mutato Panorama di Conformità dello

Sviluppo.

Guida: Establishment and Operation of Clinical

Trial Data Monitoring Committees (3/06)

Guida: Using a

Centralized IRB

Process in Multicenter

Trials (3/06)

Guida Preliminare:

Exception from Informed

Consent Requirements

for Emergency Research

(9/06) Guida Prelim.: Adverse

Event Reporting –

Improving Human Subject

Protection (Out for

Comment – 4/07)

Guida

preliminare:

Approaches to

Complying with

CGMP During

Phase I (12/06)

Guida preliminare:

Supervisory

Responsibilities of

Clinical Investigators (Out

for Comment – 5/07)

Guida: Computerized

Systems Used in

Clinical Investigations

(5/07)

Guida: ICH Q8 –

Sviluppo

Farmaceutico (5/06)

Guida: Immunotoxicity

Studies for Human

Pharmaceuticals (4/06)

Guida preliminare:

ICH Q10 –

Pharmaceutical

Quality System

(7/07)

Attilio Citterio

Aspirina

Paracetamolo

Prezzo p. attivo: 5 $·kg-1

Losec

Prezzo p. attivo: 500 $·kg-1

Cambio d’Aspetto dei Farmaci.

Attilio Citterio

Scelta del Candidato:

Costruire nella “Sviluppabilità”.

Capofila

(molecola attiva )

MetabolismoSelettività

Efficacia

LO

(molecola ottimizzata)

Proprietà

fisiche

Efficacia

Selettività

Metabolismo

Miglior

capofilaProprietà

fisico / chimiche

Biofarmaceutici

Attilio Citterio

Esploso del Mercato Farmaceutico nel Mondo (vendite 2012).

Negli scambi farmaceutici la EU ha un Surplus stimato in

€ 80 Miliardi

7,067 76,438

7,067 80,000

2000

1990 2011

2012

Attilio Citterio

Il Mercato Farmaceutico Globale, 2012.

Fonte: M. Buente, S. Danner, S. Weissbäcker, C. Rammé, Booz & Company, 2013.

Attilio Citterio

Ripartizione del Portafoglio Prodotti delle

Principali Industrie Farmaceutiche.

Attraverso scambi e dismissioni, le aziende stanno razionalizzando i portafogli per concentrarsi su un minor numero di imprese. NOTA: I dati per il 2015 si basano sulle stime di vendita pro-forma, tra cui offerte annunciate nel 2014.

FONTE: Ernst & Young

Attilio Citterio

Tendenze nel Settore Farmaceutico.

ESTENSIONE DEL CICLO DI SVILUPPO DI UN NUOVO

PRODOTTO

DIMINUZIONE DEI LANCI DI NUOVI PRODOTTI

IMPENNATA DELLE SCADENZE BREVETTUALI DI PRODOTTI

RILEVANTI

ATTESE DEGLI UTENTI ANCORA ALTE

AUMENTO DEI COSTI DI PRODUZIONE ED ORA SUPERIORI A

QUELLI DI RICERCA & SVILUPPO

Attilio Citterio

Andamenti Primari nella Produzione.

MOLECOLE PIÙ COMPLESSE

PUREZZA E IGIENE

CONTAMINAZIONE INCROCIATA (FDA)

CONTROLLO AMBIENTALE (EA/HSE)

GESTIONE DEL PRODOTTO (NGO)

Aspetti Produttivi

• Processi discontinui (Batch)

• Sintesi, trasformazioni multi-stadio – intermedi

• Isolamenti (purificazioni)

• Uso estensivo di solventi e reagenti organici multipli – con vari

gradi di tossicità

• Dati limitati sulla salute/sicurezza degli intermedi.

AUMENTO

DEI COSTI

Attilio Citterio

Ulteriori Aspetti delle Produzioni del Settore.

• Processi – solido/liquido – cristallizzazione, filtrazione,

essicazione, ecc.

• Purezza e rese

• 7-11 anni tra lo sviluppo e la produzione – Stadi

Regolatori (Fase I-III)

• La frazione di successo per lo sviluppo di

nuovi farmaci è del 10%

• Fasi di processo commissionate

ad aziende esterne

• Una volta che il processo è approvato

dalla FDA, è arduo introdurre modifiche.

Attilio Citterio

Aspetti del Processo di Sviluppo di un

Farmaco: Fasi Cliniche.

Dopo studi sugli animali, si testano i composti sulle popolazioni

umane

FASE DETTAGLI

I Sicurezza e tolleranza del farmaco

Parametri farmaco-cinetici

ADME: Assorbimento, Distribuzione, Metabolismo, e Escrezione

Piccola popolazione di volontari sani, pagati

IIa Verifica della ricerca

Decisione finale sulla formulazione

Decine di pazienti

IIb Determinazione della dose attiva

Saggi a doppio cieco vs. di confronto

Centinaia di pazienti

IIIa Efficacia (1 dose) su un numero limitato di indicazioni vs. un confronto

Migliaia di pazienti (2,000 – 10,000)

IIIb Estensione delle indicazioni (p.es., qualità della vita, confronto con altri farmaci commercializzati)

IV Sicurezza a lungo-termine ed efficacia del prodotto lanciato

Attilio Citterio

Dettagli del Processo di Sviluppo di

Farmaci: 5-7 Anni tra l’Avvio e il Lancio.

Fase I

Approvaz.

*FDA Lancio

Fase IIa

*NCE

CLINICOPRE-CLINICO

Fase IIb

Fase III

48 mesi

8 mesi 9 mesi 23 mesi 15 mesi9 mesi 8 mesiTotale

72 mesi

*IND: Indagine di Nuovi Farmaci

*NCE: Nuova Entità Chimica

*FDA: Federal Drug Administration

*NDA: Domanda di Nuovo Farmaco

*IND raccolta datiInoltro domanda

*NDA

Fase III (contin.)

Schedatura

NDA

pagare

FDA

*PAI: Controllo Pre Approvazione

Attilio Citterio

N° di Prove Cliniche e Tempi di Sviluppo di

Nuovi Farmaci.

0

10

20

30

40

50

60

70

1977-80 1981-84 1985-88 1989-92 1993-95

N° di prove

1960 1970 1980 1990-1996

3,2

2,5

2,4

5,1

4,4

2,1

5,9

5,5

2,8

6

6,7

2,2

0

2

4

6

8

10

12

14

16

Tempo di Sviluppo

(anni)

Istogram. 3D 1 Fase preclinica Fase Clinica Fase di Approvazione

8.1

11.6

14.214.9

Attilio Citterio

Ingegneria Chimica: Adeguamento.

Significativo spostamento dai

tradizionali composti chimici

di base a capitale intensivo

Maggiore enfasi su

materiali di specialità ad

alto valore aggiunto

Crescita dei concetti di

prodotto ingegnerizzato

nell’ambito della pratica

dell’ingegneria chimica

Ingegneria Verde.

Importanza critica di uno

sviluppo del processo chimico

più sostenibile

Attilio Citterio

Tipico Processo Biologico

(Produzione di Anticorpi).

Attilio Citterio

Progettazione in Ingegneria Chimica.

Sicurezza

Salute

Ambiente

Problematiche

critiche

SHE

Ruoli chiave

Progettazione di

processi chimici

Ottimizzazione delle

condizioni processo

Rese dei

prodotti chimici

Attilio Citterio

Ingegnerizzazione del Farmaco.

MATERIALI ESOTICI

CONTROLLO SOFISTICATO

TRATTAMENTI DELL’ARIA E

COMPARTIMENTAZIONI

CONNETTIVITA’ E

FLESSIBILITA’

MULTI – FUNZIONALITA’

AUMENTO

DEI COSTI

EtOH

Cl

Cl

O

MMA

EtOH EtOH EtOH

H2/Pd

V VI VII

non-isolato non-isolato

Cl

Cl

N CH3

Cl

Cl

NH CH3

Acido D(-) mandelico

Cl

Cl

NH

CH3

OH C

O

CH

OH

EtOAc

HCl

XXIII VIII

Cl

Cl

NH CH3 HCl

Attilio Citterio

Tipico Diagramma di Flusso.

TYPICAL BATCH REACTION / ISOLATION / DRYING

REVISION DETAILS SHOWN

DRAWN BY

PROJECT No.

SCALEDRG.No. SHT.No. REV DATE

ON SEPARATE REV. SHEET

FLOW SHEET

ORIGINATOR

SCAMBIATORE DI CALORE

REATTORE

SERBATOIO

SERBATOIO

DI TESTA

AZEOTROPO

FILTRO ESSICATORE

SERBATOIO

SOLVENTE

SOLIDI

PANNELLO UMIDO

PANNELLO UMIDO

SERBATOIO

PRODOTO

Attilio Citterio

Tecnologia Batch.

VOC GAS (OG)

REAGENTI (R)

REAGENTI/DILUENTI (RD)

PRODOTTI (P)

REFLUI (W)

P

RD + R~ 1%

1. OTTIMIZZARE PER BILANCIO DI MASSA TOTALE – NON I REAGENTI CHIAVE

2. VARIARE/MIGLIORARE IL PROGETTO DEL REATTORE –SELETTIVITA’/VELOCITA’/RESA - SEPARAZIONE, ANALISI CIOE’ SFRUTTARE IL PROCESSO

Attilio Citterio

Tempistica di Flusso di un Processo.

TEMPO TOTALE TRASCORSO

MOVIM. MOVIM. MOVIM. MOVIM.

FARE RIUNIRE

SPEDIZ.ATTESA

ATTESA ATTESA IMBAL.CODADEPOSITOIMMISSIONE

BENIRIUNIONE

PARZIALE

RAPPORTO DI VELOCITÁ = VELOCITÁ A CUI IL MATERIALE SI MUOVE

VR =SOMMA DEL VALORE AGGIUNTO

TEMPO TOTALE TRASCORSO~ 1%

Attilio Citterio

Potenziali Approcci Futuri.

APPROCCIO VIA OPERAZIONI UNITARIE:

Prog. REATTORI - Molto più intensivi (Controllati calore e massa)

Prog. PRODOTTI - Regio- e Stereo-specificità da migliorare- Gestire la morfologia

PURIFICAZIONE - Velocità e precisione

SEPARAZIONE - Velocità e precisione

INTEGRAZIONE DEL SISTEMA

SINCRONIZZARE LE OPERAZIONI UNITARIE

OTTIMIZZARE IL PROCESSO PER MINIMIZZARE IL BILANCIO DI MASSA, NON LA RESA DELL'INTERMEDI CHIAVE.

Attilio Citterio

Come Migliorare.

• Intensificazione di Processo /

Catalizzatori

• Ingegnerizzazione dei Costi

• Favorire le Operazioni Unitarie, non i

Processi Unitari

• Standardizzazione/Ingressi – Uscite

• Maggiore Velocità/Maggiore

Produttività

• Minore Intensità di Investimento

Capitali (CAPEX).

ATTIVITA’ MULTIDISCIPLINARI

Sviluppo di Processo

Scelta della Sequenza

Scelta della Strada

Sviluppo del Metodo

Studio EHS

Fas

e P

rec

lin

ica

Fas

e C

lin

ica

Po

st-

Ap

pro

va

z.

Ampliam. di scala - Pilota

Produzioni di Prova

Conformità alle norme

Valutazione del sito

Sviluppo Industriale e

Trasferimento Tech.

Produzione Industriale

Attilio Citterio

Opportunità per l'Ingegneria Verde.

• Investigare il processo nelle prime fasi

dello sviluppo

• Sostituzione di Solventi – più benigni

• Riduzione/eliminazione del Solvente

• Nuovi processi per il riuso/recupero di

materiali

• Riduzione degli stadi di processo

“Indagare a fondo” la possibilità di eliminare

le fasi d'isolamento degli intermedi.

Sfida - mantenere purezza e rese in

produzione!

Attilio Citterio

Necessità per una Ingegneria Verde.

Metrica per misurare e quantificare i miglioramenti Cosa misurare, come

quantificare – ben di più della sola quantità ridotta

Materiali

Intensità di massa – quante materie prime sono richieste per produrre 1 kg di API

Intensità di solventi

Intensità di scarti

Intensità d'acqua

Emissioni

Efficienza

Energia

Quantificare in modo ampio l'impatto ambientale.

0

50

100

150

200

250

Lab Pilota TotaleInte

nsità

di m

assa

(kg/k

g A

PI)

Scala di Produzione

Attilio Citterio

Esempio: Riprogettazione del Processo

della Sertralina.

Sertralina: principio attivo nel Zoloft

Processo combinato

• Raddoppio della resa

• Sostituzione di CH2Cl2, THF, toluene, e esano con Etanolo

• Eliminazione dell’uso di 140 ton/anno di TiCl4

• Eliminazione di 150 ton/anno di HCl al 35%

Pfizer

Attilio Citterio

Riprogettazione del Processo della

Sertralina.

Attilio Citterio

Efficienza dello “Scheletro di Carbonio”

nella Sintesi della Sertralina.

SOCl2/

AlCl3

Benzene

Miscela racemica :

cis(+,-) e trans(+,-)

Separazione

Cl

Cl

CO2H

IVIXX

3 +

Resa Tetralone=37%

T-S

resa=33%

Resa totale =12.2%

Toluene

SMBEtOH

THF

T

S

XI

Cl

Cl

O

O

Cl

Cl

O

O

OH

Cl

Cl

O

O

OH

O

O

OCl

Cl

V

Cl

Cl

O

VI

Cl

Cl

NCH3

VII

Cl

Cl

NCH3

VIII

Cl

Cl

NCH3

Attilio Citterio

Miglioramento del 10% nell’Efficienza di Uso del Carbonio.

• All’interno della Compagnia (kg/kg Sertralina):

97 96 1 (la maggior parte dei reflui è solvente)

• Nell’insieme del Complesso Farmaceutico (kg/kg Sertralina)

39,098 35,794 3,304

Impatto oltre 3,000-volte superiore!

Attilio Citterio

Efficienza nell’Uso dei Solventi (V → VI).

Mescol.46

Naftalenone

Raffred.

1-5°C 47

Aggiunta48

Reazione,

Agitazione e

Raf. <10°C49

THF CH3NH2

0°C

TiCl4

+ Reagenti + Solvente + Perdite Chimiche + Solvente

VVI

Agitazione

17 h, N2 50

Filtrazione

aq/Lavag.51

Vuoto52

THF

THF

Naftalen-

ammina

“pannello” TiO2

THF

Attilio Citterio

Miglioramento del 10% nell’Uso dei Solventi.

• All’interno della Compagnia (kg.kg Sertralina)

97 89 8

• All’interno del Complesso Farmaceutico (kg/kg Sertralina)

39,098 38,493 605

Effetto superiore all’interno della Società, ma l’impatto maggiore è

fuori della Società.

Attilio Citterio

Riprogettazione del Processo della Sertralina.

Attilio Citterio

Sviluppo di Processi Farmaceutici: Ottimizzazione.

Studi di Ottimizzazione

Identificare le regioni dei parametri di processo dove le

prestazioni sono più stabili

Progettare il processo per operare in tale regione (QdB, PAT).

La norma attuale

5

3 1

4

Il futuro

2

ambientale

Proprietà delle materie prime

condizionici processo

ambientale

Proprietà delle materie prime

condizionidi processo

Attilio Citterio

Ottimizzazione di Processo via QdB.

Regione dove il processo è instabile

Regione dove il processo è robusto

Processo più stabileValori obiettivo

Regione per monitorare la robustezza del processo e in prospettiva identificare le deviazioni

Attilio Citterio

Esempio 2: Alternative per il TamifluTM

(Oseltamivir Fosfato).

• Sintesi dell’allilammina senza Azide

• Sintesi Diels-Alder dal Furano

• Trasformazione dell’Anello Aromatico: Approccio meso

Attilio Citterio

Riprogettazione di un Composto NCS:

Sintesi Benzodiazepina.

Migliorata la sintesi

di un principio attivo

per il sistema

nervoso centrale.

Approccio

interdisciplinare, che

combina chimica,

microbiologia e

ingegneria.

Per ogni 100 kg di prodotto furono eliminati:

• 300 kg di scarti di cromo

• 34,000 litri di solventi Fonte: Eli Lilly

Attilio Citterio

Esempio 3:

Strade Chimiche e Biocatalitiche al QCA.

Via Biocatalitica

1 stadio (3 reazioni enzima-

tiche), resa 86%

Reazione in acqua a 28°C

Via Chimica

3 stadi, resa 35%

Di-N-ossido:mutageno e

intermedio ad alta energia

Attilio Citterio

Confronto tra Processo Chimico e Biocatalitico.

Materie prime per 1 kg QCA

di-N -ossido 3.9 kg 2-metilchinossalina 0.97 kg

Na2S2O4 5.7 kg alcol benzilico 2.9 L

35% H2O2 6.5 L p -xilene 0.9 L

4N HCl 13.6 L 4N HCl 3.8 L

10% NaOH 11.7 L 10% NaOH 1.7 L

cloroformio 142 L Sali inorganici 0.75 kg

N ,N -dimetilacetammide 36 L traccia elementi 0.005 kg

etanolo 18 L H2O 79 L

Processo Chimico Processo P. putida

La via biocatalitica evita il pericoloso di-N-ossido e usa 4x meno materie

prime

Consumi ridotti di solventi organici per la via biocatalitica (3.8 L/kg QCA)

rispetto al processo chimico (196 L/kg QCA). N.B.: CHCl3 è cancerogeno.

Attilio Citterio

Scelta della Via per il Sildenafil.

Pfizer

Attilio Citterio

Scelta della Via per il Sildenafil.

Attilio Citterio

Ultimi Stadi Sintetici.

Attilio Citterio

Alternative nella Friedel-Craft.

Reagenti tradizionali nelle reazioni di Friedel-Crafts

Acido di Lewis : alluminio cloruro, stagno(IV) cloruro, boro trifluoruro

Solventi: idrocarburi aromatici, nitrobenzene, solfuro di carbonio,

cloruro di metilene

• Acilazione fotochimica del benzochinone con benzaldeide

Attilio Citterio

Alternativa Fotochimica alle Reazioni di

Friedel-Crafts.

Attilio Citterio

Altre Applicazioni Fotochimiche.

Kraus, Iowa State

Attilio Citterio

Applicazioni in Campo Farmaceutico.

Sintesi tradizionale del Progesterone

Alto impiego di EDC, alti volumi di reflui acquosi e organici

Pharmacia - Upjon

Attilio Citterio

Sintesi Alternativa del Progesterone.

• 89% in meno di reflui organici non recuperabili,

• 79% in meno di reflui acquosi

Attilio Citterio

Applicazioni Farmaceutiche.

Cytovene

agente antivirale usato nel trattamento delle infezioni retiniche da

citomegalovirus (CMV)

Pazienti con Aids e con trapianti da tessuti solidi

Sintesi migliorata:

Ridotti gli stadi chimici di processo da 6 a 2

Ridotto il numero di reagenti ed intermedi da 22 a 11

Eliminati 1.12 milioni di kg/anno di reflui liquidi

Eliminati 25,300 kg/anno di rifiuti solidi

Aumento complessivo della resa del 25%

Attilio Citterio

Applicazioni Farmaceutiche (2).

Processo GTE – Sintesi del Cytovene

Roche Colorado Corp.

Attilio Citterio

Applicazioni Farmaceutiche (3).

Sintesi della (+)-citreoviridina

Inibitore della ATP sintetasi

Trost, Stanford University

Attilio Citterio

Applicazioni Farmaceutiche (4).

Sintesi di Trans-β-lattami mediante l’uso di reazioni

organiche indotte da Microonde

intermedio nella sintesi del Tassolo/Tassotere

Bose, Stevens Institute of Technology

Attilio Citterio

Applicazioni via Metodologie Combinate.

Metodi sintetici Tandem assistiti da enzimi e per via elettrochimica

Sintesi del Conduritol C

(Hudlicky, University of Florida)

Attilio Citterio

Uso di Enzimi per Composti Chirali:

Sintesi della Pregabalina.

I risparmi derivano dalla sintesi efficiente che evita reagenti esotici, minimizza l'uso di energia e sostituisce i solventi organici con acqua (operazioni sempre meno costose!).

Sintesi a livello ricerca

Sintesi finale a scala produttiva

Attilio Citterio

Dolcificante Stevia.

Nome R1 R2

Stevioside Glcβ1- Glcβ1-2 Glcβ1-

Rebaudioside A Glcβ1- Glcβ1-2(Glcβ1-3)Glcβ1-

Rebaudioside B H- Glcβ1-2(Glcβ1-3)Glcβ1-

Rebaudioside C Glcβ1- Rhaα1-2(Glcβ1-3)Glcβ1-

Rebaudioside D Glcβ1-2Glcβ1- Glcβ1-2(Glcβ1-3)Glcβ1-

Rebaudioside E Glcβ1-2Glcβ1- Glcβ1-2Glcβ1-

Rebaudioside F Glcβ1- Xylβ1-2(Glcβ1-3)Glcβ1

Dulcoside A Glcβ1 Rhaα1-2Glcβ1-

Rubusoside Glcβ1- Glcβ1-

Steviolbioside H- Glcβ1-2Glcβ1-

Glc, Rha and Xyl rappresentano, rispettivamente, frammenti zuccherini del glucosio, ramnosio e xilosio.

Attilio Citterio

Stevia Derivatives Selection for Sweeteners

Steviol and the metabolic grid of glucosylation reactions resulting in formation of Reb D and Reb M. Top left the

structure of steviol with emphasis on its functional groups. Reb D and Reb M are the two desired sweeteners

(shown on green background). UGT91D2 has not been observed to glucosylate glucoside structures that harbor a

glucose residue bound in a 1,3-glucosidic linkage. Formation of the 1,3-bond prior to formation of the 1,2-bond

results in production of undesired side-products (shown on red background) [13, 15, 16]. UGT76G1 is known to

glucosylate Steviol-13-O-monoglucoside (13-SMG), rubusoside, 1,2-stevioside and Reb D. In this study, 1,2-

bioside, Reb G, Reb A and Reb E were identified as additional UGT76G1 substrates. UGT76G1 catalyzed

glucosylation of Reb G and Reb A lead to the formation and structural elucidation of two new steviol glucosides

Reb Q and Reb I

Microbial Cell Factories volume 15, Article number: 207 (2016)

Attilio Citterio

Development of a Practical Total Synthesis

of (+/-)-Steviol

Enzymatic conversion of geranylgeranyl pyrophosphate (GGDP) affords

ent-kaurene. The enone 3 was then obtained from 2 by a three-step

sequence involving elimination of a secondary alcohol, hydrogenolysis

and Birch reduction/isomerization. In the subsequent operation, a

critical allene [2 + 2] photocycloaddition installed the hindered C8

quaternary center of the advanced cyclobutane intermediate 4.

Ozonolysis of 4, when conducted in methanol, induced fragmentation of the strained cyclobutane framework to generate

the intermediary methyl ester 5. Next, the [2.2.2]bicyclic system of 6 was fashioned by exposure of 5 to forcing acidic

conditions and subsequent reductive cyclopropanation in the presence of acetic anhydride led to the advanced diacetate 7.

Finally, controlled fragmentation of 7 with methanolic hydrochloric acid, followed by an expedient methylenation/oxidation

endgame sequence produced fully synthetic steviol in only 17 total steps starting from geranyl acetate.

Baran laboratory