Corso di Chimica Generale - CHI 083424 - CCS Ingegneria ... · Ossiemoglobina Carbossiemoglobina...

SPETTROSCOPIA UV-VISIBILEProf. Attilio CitterioDipartimento di CMIC “Giulio Natta” https://corsi.chem.polimi.it/citterio/

Corso di Chimica Generale - CHI083424 - CCS Ingegneria ChimicaA.A. 2015/2016 (I° Semestre)

Attilio Citterio

Spettroscopia

• A insieme di strumenti per misurare le proprietà molecolari.

• La spettroscopia è l’assorbimento o l’emissione di luce.

• L’analisi spettrochimica può esser definita come l’uso dello spettro della radiazione elettromagnetica in analisi qualitative e quantitative.

• Quando una molecola assorbe luce, la sua energia aumenta

• Quando una molecola emette luce, la sua energia diminuisce

Attilio Citterio

Fotoni o Quanti di Luce

• Atomi e molecole assorbono solo alcune frequenza, ma non altre.

• Ci sono due ragioni per questa osservazione. L’energia assorbita o emessa è proporzionale alla frequenza, .

Energia di un fotone = hCostante di Plank

e–

260 2400

Attilio Citterio

Effetto Fotoelettrico (emissione di elettroni da un metallo solido irraggiato)

Misura dell’energia cinetica deglielettroni emessi (fotoelettroni) =Voltaggio per cui la corrente è zero

-

+

+

-Batteria

Elettrodo di raccolta

Elettrodo metallicoilluminato

Luce incidenteda sorgente

+

-

-

+Generatorea voltaggio

variabile

Amperometro

e-

e-

Attilio Citterio

Energia dei Fotoelettroni Emessi da Metalli

o del Cesio

100

200

300

400

x 1014 (Hz)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Ecin./ kJ mol-1

Cs K Mg Zn Ni Pt

Infrarosso Visibile Ultravioletto

Pendenza = h (costante di Plank)

Ecin. = Efot.- Eemis.= h - = h Ecin. = h (- )

Attilio Citterio

Peculiarità dell’Effetto Fotoelettrico

L’emissione fotoelettrica dimostra che l’energia dell’elettrone:

Aumenta se si aumenta

Non è influenzata aumentando l’intensità

L’intensità influenza il numero di elettroni emessi per secondo

Attilio Citterio

Quantizzazione dell’Energia Molecolare

Le energie molecolari sono quantizzateSe solo certe frequenze sono assorbite, solo certe energie sono permesse

ener

gia

ener

gia

Attilio Citterio

Altre Evidenze della Quantizzazione

• Assorbimento del corpo nero (Panck)

• Capacità termica dei solidi a bassa temperatura

quindi E = h

Attilio Citterio

Spettrometri

• sorgente

• monocromatore (selettore di frequenza)

• campione

• rivelatore

Attilio Citterio

Strumenti a Dispersione

Usati negli spettrometri visibile/ultravioletto e nei vecchi tipi di strumenti infrarosso

Attilio Citterio

Strumenti a Trasformata di Fourier

Richiedono estesi calcoli per convertire il segnale in uno spettro. Usati nei moderni strumenti.

Attilio Citterio

Lo Spettro Elettromagnetico

= c / E = h

InfrarossoVisibileUltravioletto

1022 1019 1017 1015 1014 1010

Frequenza [Hz]106 103 1 10-3

106 108 10101041021

Lunghezza d’onda [m]

10-210-410-610-810-1010-1210-14

Ragg

i Cos

mici

Ragg

i Gam

ma

Ragg

i X

Ultra

violet

toVi

sibile

Infra

ross

o

Micr

oond

e

Rada

r

Telev

ision

e

NMR

Radi

o

Ultra

suon

i

Suon

i(u

dibi

li)

Infra

suon

i

Attilio Citterio

Transizioni Elettroniche nella Formaldeide

transizione *(187 nm)transizione

n *(285 nm)

Attilio Citterio

Transizioni Elettroniche e Spettri di Atomi

E

S0 S2

S0 S1

S0S1S0S2

IES2

S1

S0

Attilio Citterio

Transizioni Elettroniche e Spettri UV-visibile in Molecole

massimi di assorbimento (max.)

Ampiezza della banda a metà altezza

E

S2

S1

Su

livelli elettronicilivelli vibrazionalilivelli rotazionali

I

= transizioni elettroniche

Attilio Citterio

Spettri Derivati di una Banda di Assorbanza Gaussiana

1a Derivata:

2a Derivata:

Assorbanza:

)('

fddA

)(fA

)(''2

2

fd

Ad

3° derivata

300 400 500 600 700

-2.0E-05

-1.0E-05

0.0E+00

1.0E-05

2.0E-054° derivata

300 400 500 600 700

1.0E-06

-5.0E-07

0.0E+00

5.0E-07

1° derivata

0.00

0.01

-0.01

Assorbanza

0.0

0.5

1.0Assorbanza

0.0

0.5

1.0

2° derivata

2.0E-04

0.0E+00

-2.0E-04

-4.0E-04

-6.0E-04

Attilio Citterio

Aumento Risoluzione

• Sovrapposizione di 2 bande Gaussiane con un NBW di 40 nmseparate da 30 nm

• Separate alla 4a

derivata

400 500 600

-5.0E-06

5.0E-06

0.0E+00

4° derivata

400 500 600

Assorbanza1.5

1.0

0.5

0.0

Attilio Citterio

Trasmissione e Colore

L’occhio umano vede il colore complementare di quello che è assorbito

Attilio Citterio

Assorbanza e Colori Complementari

400

500

600

700

800

380-435

435-480

480-490

490-500

500-560

560-595

595-650

650-780

violetto

blu

verde blu

blu verde

verde

giallo verde

arancio

rossoverde blu

blu verde

rosso

rosso-porpora

porpora

aranciogiallo

giallo-verde

Lunghezza d’onda [nm]

Coloreassorbito

Colorecomplementare

Attilio Citterio

Trasmissione e ConcentrazioneLa Legge di Lambert-Bouguer

Lunghezza Percorso

Tras

mitt

anza 100%

50%

25%

100% 50% 25% 12,5% 6,75% 3,125%

Io I1 I 2 I 3 I 4 I 5

Cammino Cost.0/T I I e

Attilio Citterio

Trasmittanza e Cammino OtticoLa Legge di Beer

Concentrazione Cost.0/T I I e

25%

50%

100%

Tras

miss

ione

Concentrazione

I5

I4

I3

I2

I1

3.125%

6.75%

12.5%

25%

50%

100% 5C

4C100%

3C100%

100% 2C

100% C

I0

Attilio Citterio

La Legge di Lambert-Bouguer-Beer

cbIIIITA /log/loglog 00

Concentrazione

Asso

rban

za

0.0

0.5

1.0

1.5

Attilio Citterio

Miscela Bicomponente

Esempio di miscela bi-componente con scarsa sovrapposizione spettrale

Asso

rban

za

0.0

0.5

1.0

1.5

200 210 220 230 240Lunghezza d’onda

x y x + y

Attilio Citterio

Miscela Bi-componente

Esempio di miscela bi-componente con significativa sovrapposizione spettrale


Asso

rban

za

0.0

0.5

1.0

1.5x y x + y

Attilio Citterio

Influenza di un Errore Casuale del 10%

Influenza sulle concentrazioni calcolate• Scarsa sovrapposizione spettrale: Errore 10%• Significativa sovrapposizione spettrale: Dipende dalla similarità, può essere

molto più alto (p.es. 100%)


Asso

rban

za

0.0

0.5

1.0

1.5Vero Misurato

Attilio Citterio

Spettri di Assorbimento di Derivati dell’Emoglobina

500 550 600Lunghezza d’onda [nm]

650

Asso

rban

za [A

U]

0.0

0.1

0.2

SulfemoglobinaOssiemoglobinaCarbossiemoglobinaEmoglobina (pH 7.0-7.4)Deossiemoglobina

Attilio Citterio

Intensità dello Spettro della Lampada ad Arco di Deuterio

• Buona intensità nell’intervallo UV

• Utile intensità nell’intervallo del visibile

• Basso rumore di fondo

• Intensità calante nel tempo Lunghezza d’onda [nm]

Irrad

iazio

ne S

pettr

ale200 300 400 500 600 700

0.00

0.01

0.1

1

Attilio Citterio

Intensità dello Spettro della Lampada a Tungsteno-Alogena

• Bassa intensità nell’intervallo UV

• Buona intensità nell’intervallo visibile

• Rumore di fondo molto basso

• Basso drift1000

Lunghezza d’onda [nm]200 400 600 800

Irrag

giam

ento

Spe

ttrale

0.01

0.1

1

10

Attilio Citterio

Intensità dello Spettro della Lampada a Xeno

• Alta intensità nell’intervallo UV

• Alta intensità nell’intervallo visibile

• Rumore di fondo medio

Lunghezza d’onda [nm]200 400 600 800 1000

0.01

0.1

1

10

100

Irrag

giam

ento

Spe

ttrale

Attilio Citterio

Dispositivi di Dispersione

• Dispersione non-lineare• Sensibile alla temperatura

• Dispersione lineare• Differenti ordini

Secondo ordinePrimo ordine

Reticolo

Prisma

Attilio Citterio

Dispositivo Fotomoltiplicatore

• Alta sensibilità a bassi livelli di luce

• Il materiale catodico determina sensibilità spettrale

• Buon segnale/rumore di fondo

• Sensibile agli urtiCatodo Anodo

Attilio Citterio

Il Rivelatore a Fotodiodi

• Ampio intervallo dinamico

• Rapporto segnale/rumore molto buono ad alti livelli di luce

• Dispositivo a stato solido

Contatto metallico Fotone

SiO2

Regione intrinseca

Blocco d’orostrato n

strato p

Attilio Citterio

Diagramma Schematico di un Dispositivo a Fotodiodi

• Stesse caratteristiche dei fotodiodi

• Dispositivo a stato solido

• Veloci cicli di lettura

Ciclo di lettura

Linea video

Deviatoretransistor

Registrodeviazione

Capacitore Fotodiodo

Luce

Attilio Citterio

Spettrometro Convenzionale

Sorgente

Fessura d’ingresso

Monocromatore

Dispositivodi dispersione

Fessura d’uscita

Campione

Rivelatore

Attilio Citterio

Spettrometro a “Diode Array”

Fessura d’ingresso

Campione

Sorgente

Policromatore


Batteria di diodi

Attilio Citterio


Fessura Lente

Lente

Campione

Reticolo

Lampada adeuterio

Lampada aTunsteno

Shutter

Diode array a1024-elementi

Sistema ottico di uno spettrofotometro HP 8453 a “diode array”

Attilio Citterio


Rivelatore

Campione

Riferimento

Monocromatore

SorgenteFessura d’ingresso


Fessura d’uscita

Chopper

Sistema ottico di uno spettrofotometro a doppio raggio

Attilio Citterio


Cella delcampione

Cella delriferimento

Elissesorgente

Lampada visibile

Lampada UV

Specchiosorgente

Elissespettrografica

Specchi alati di cubo

Specchi alati di cubo

Reticolo olografico

UV

Visibile

Specchio orientante il raggio inferiore

Specchio orientante il raggio inferiore

Uscita Spettrografo e batteria rivelatore

Sistema ottico dello spettrofotometro a diode array HP 8450A

Attilio Citterio


Sistema ottico di uno spettrofotometro a raggio sdoppiato

Campione Rivelatore

Riferimento

Monocromatore

SorgenteFessura d’ingresso

RivelatoreDispositivodi dispersione

Fessura d’uscita

Deviatore del raggio

Attilio Citterio

Definizione di Risoluzione

La risoluzione spettrale è una misura della capacità di uno strumento di differenziare tra due lunghezze d’onda adiacenti

lunghezza d’ondalunghezza d’onda

intensitàSegnale in uscitadal rivelatore

Smax

0.8xSmax

Attilio Citterio

Ampiezza di Banda Spettrale

La SBW è definita come l’ampiezza, a metà dell’intensità massima, della banda di luce uscente dal monocromatore

lunghezza d’onda

intensità

SBW

I

0.5 I

Attilio Citterio

Ampiezza di Banda Spettrale Naturale

La NBW è l’ampiezza della banda di assorbimento del campione a metà del massimo di assorbimento

lunghezza d’onda

assorbanza

NBW

A

0.5 A

Attilio Citterio

Effetto della SBW sulla Forma della Banda

Il rapporto SBW/NBW deve essere 0.1 o migliore per dare una misura di assorbanza con un’accuratezza del 99.5% o migliore.

lunghezza d’onda

asso

rban

za

5 nm1 nm

10 nm20 nm50 nm

Attilio Citterio

Effetto del Campionamento Digitale

Anche l’intervallo di campionamento usato per digitalizzare lo spettro per la valutazione e lo stoccaggio da parte di un computer influenza la risoluzione

lunghezza d’onda

Asso

rban

zaAs

sorb

anza

Spettrodigitalizzato

Spettrooriginale

Processo dicampionamento

Attilio Citterio

Resettabilità della Lunghezza d’Onda

Influenza della resettabilità della lunghezza d’onda sulle misure al massimo e sulla pendenza della banda di un assorbimento

lunghezza d’onda [nm]

Asso

rban

za [A

U]

Errore = 0.1 AU (10%)

Errore = 0.0 AU

220 240 260 280 3000.00

0.05

0.10

0.15

0.20

Attilio Citterio

Effetto della Luce Diffusa

Effetto di vari livelli di luce diffusa sulle assorbanze misurate confrontate con le assorbanze reali

Asso

rban

za m

isura

ta

Assorbanza vera0.0 0.5 1.0 2.0 3.0 4.01.5 2.5 3.5

0.0

0.5

1.5

2.5

3.5

1.0

2.0

3.0

4.00.00 % di Luce Diffusa0.01 % di Luce Diffusa0.10 % di Luce Diffusa1.00 % di Luce Diffusa

Attilio Citterio

Errore di Assorbanza Teorico

L’errore totale a qualsiasi assorbanza è la somma degli errori dovuti alla luce diffusa e al rumore di fondo (rumore dei fotoni ed elettronico)

Erro

re %

Assorbanza410.10.010.001

-25.0

-20.0

-15.0

-10.0

-5.0

0.0

5.0

10.0

15.0

Curva dell’errore da luce diffusaCurva ’errore luce diffusa + noiseCurva errore luce diffusa - noise

Attilio Citterio

Effetto del Drift

Il drift è una potenziale causa di errore fotometrico e deriva dalle variazioni tra le misure di I0 e I


Asso

rban

za [A

U]Errore

220 240 260 280 300230 250 270 290 310 3200.00

0.05

0.15

0.10

0.20

Attilio Citterio

Caratteristiche di Trasmissione dei Materiali di Cella

Notare che tutti i materiali mostrano approssimativamente almeno il 10% di perdita nella trasmittanza a tutte le lunghezze d’onda.


Tras

mitta

nza

[%]

200 300250 350 400

20

0

40

60

80

100Silice fusa

Quarzofuso

Plasticaacrilica

Vetro

Vetroottico

Attilio Citterio

Tipi di Celle 1

Cella Standard rettangolare aperta in testa (a) e cella con apertura (b) per volumi limitati di campione

(a) (b)

Attilio Citterio

Tipi di Celle (II)

Micro cella (a) per volumi molto piccoli e cella a flusso (b) per applicazioni automatizzate

(a) (b)

Attilio Citterio

Effetto dell’Indice di Rifrazione

Variazioni nelle misure dell’indice di rifrazione del riferimento e del campione possono causare misure sbagliate di assorbanza

RivelatoreCampione

Luce non rivelata

(b) Raggio focalizzato

(b) Raggio collimato

Attilio Citterio

Geometria non Planare del Campione

Alcuni campioni possono agire come componenti ottici attivi nel sistema e deviare o defocalizzare il raggio luminoso

Campione planare Campione “inclinato”

RivelatoreRivelatore

Area fotosensibile

Attilio Citterio

Effetto del Tempo di Integrazione

Mediare i dati raccolti riduce il rumore di fondo della radice quadrata del numero dei punti mediati


Asso

rban

za [A

U]As

sorb

anza

[AU]

S/N = 18

16 sec

0.1 sec

S/N = 5.5± 0.00013 AU

± 0.00004 AU

450 500 550 6000.00000.00020.00040.00060.0008

0.00000.00020.00040.00060.0008

Attilio Citterio

Effetto della Media sulle Lunghezze d’Onda

• Mediare le lunghezze d’onda riduce anche il rumore (della radice quadrata dei punti raccolti)

• L’ampiezza del segnale viene influenzata

lunghezza d’onda

Asso

rban

za

Asso

rban

zaNBW Intervallo

ottimale

# dei punti

S/NSegnaleRumore

Attilio Citterio

Aumento dell’Intervallo Dinamico

La scelta di una lunghezza d’onda nella pendenza di una banda di assorbimento può aumentare l’intervallo dinamico ed evitare la preparazione del campione come la diluizione

lunghezza d’onda

Asso

rban

za [A

U]

Concentrazione mg/ml

Asso

rban

za

Misu

rata

[AU]

200 250 300 0.00.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

0.5

1.0

1.5

266 nm

241 nm

0.1428 mg/mlspironolattone

0.1 0.2 0.3 0.4

Attilio Citterio

Diffusione

La dispersione causa un assorbanza apparente in quanto meno luce raggiunge il rivelatore

Rivelatore

Rivelatore

Campione che diffonde

Campione trasparente

Attilio Citterio

Spettri Diffusi

• Diffusione di Rayleigh : Particelle piccole rispetto alla lunghezza d’onda• Diffusione di Tyndall : Particelle grandi rispetto alla lunghezza d’onda


Asso

rban

za [A

U] Diffusione di RayleighDiffusione di Tyndal

200 300 400 500 600 700 8000.0

0.2

0.4

0.6

08

1.0

Attilio Citterio

Correzioni per Isoassorbanza

L’assorbanza alla lunghezza d’onda di riferimento deve essere equivalente all’interferenza alla lunghezza d’onda analitica


Asso

rban

za [A

U]

5004504003503002502000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

A2

A1 A1 A1 =A1 – A2

1

1

Spettro analitaSpettro interferenteSpettro misurato

Attilio Citterio

Modellizzazione del Fondo

Si può eseguire la modellizzazione del fondo se l’interferenza è dovuta ad un processo fisico


Asso

rban

za [A

U]

5004504003503002502000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

A1AC AC = A1 – A5

A5

Spettro misurato

Spettro diffuso estrapoato

Intervallo del modello

1

Attilio Citterio

Riferimenti Interni

Corregge per la costante absorbanza del fondo su un intervallo


Asso

rban

za [A

U]

220 240 260 280 300230 250 270 290 310 3200.00

0.05

0.15

0.10

0.20

A1a ≠ A1

b A2a ≠ A2

b

1

2

Spettro aSpettro b

Attilio Citterio

Correzione a Tre Punti

• Uses two reference wavelengths• Corrects for sloped linear background absorbance

Asso

rban

za [A

U]

lunghezza d’onda [nm]500450400350300250200

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

A1AC AC = A1 – A5

1

2

3

A3A1A2

Spettromisurato

Attilio Citterio

Discriminazione delle Bande Larghe

• Le derivate possono eliminare l’assorbimento di fondo• Le derivate discriminano rispetto alle ampie bande di absorbanza

lunghezza d’onda [nm]400 500 600

Derivata seconda

-0.010

-0.005

0.000

0.005-0.005

0.000

0.0050.0

0.5

1.0

Derivata prima

Assorbanza

Attilio Citterio

Correzione della Diffusione per Spettroscopia Derivata

La diffusione è discriminata come una banda ampia di assorbanza

lunghezza d’onda [nm]400 600 700

Derivata prima

Assorbanza [AU]

500300

-0.01

0.00

0.01

0.0

0.5

1.0 Spettro misuratoSpettro reale

Attilio Citterio

Effetto della Fluorescenza

La luce emessa da un campione fluorescente causa un errore nella misura dell’assorbanza


Asso

rban

za [A

U]Lunghezza d’onda

di eccitazione

Lunghezza d’ondadi emissione

Spettro misurato con ottica inversa

Spettro misurato con ottica diretta

Spettro di assorbanza vera

200 250 500 350 400 450 500 550 6000.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Attilio Citterio

Angoli di Accettazione e Grandezza dell’Errore di Fluorescenza

• Ottica Diretta: Assorbanza alla lunghezze d’onda di eccitazione sono troppo basse• Ottica inversa: Assorbanza alla lunghezze d’onda di emissione sono troppo basse

Rivelatore

Rivelatore

FendituraOttica inversa

Ottica diretta

Attilio Citterio

Calibrazione Inadeguata

• Teoricamente si richiede solo uno standard per calibrare• In pratica, deviazioni dalla legge di Beer possono causare risultare sbagliati

Concentrazione Concentrazione

Asso

rban

za [A

U]

Asso

rban

za [A

U]

0.000.25

0.50

0.751.001.251.501.75

0 5 10 15 0 5 10 150.000.25

0.50

0.751.001.251.501.75

Possibile risultato di quantificazione

Curve di calibrazione possibilmente vere

Assorbanza del campione misurata

Concentrazione nota dello standard

Assorbanza misurata dello standard

Attilio Citterio

Insieme di Dati di Calibrazione

• Ottica Diretta: Assorbanza alla lunghezze d’onda di eccitazione sono troppo basse• Ottica inversa: Assorbanza alla lunghezze d’onda di emissione sono troppo basse

Asso

rban

za [A

U]

Concentrazione

0.50

1.00

1.50

0.00

0.50

1.00

1.50

0.000 5 1510 0 5 1510

Asso

rban

za [A

U]

Concentrazione

Attilio Citterio

Lunghezza(e) d’Onda per la Migliore Linearità

• Una curva lineare di calibrazione è calcolata ad ogni lunghezza d’onda

• Il coefficiente di correlazione da una stima della linearità

Lunghezza d’onda [nm]200 300 400 500Co

effici

ente

di co

ncen

trazio

ne

0.9900.9920.9940.9960.998

Asso

rban

za [A

U]

0.0

0.4

0.8

1.2

1.6

Intervalloottimale

Attilio Citterio

Lunghezza(e) d’Onda per la Migliore Accuratezza

• I risultati di quantificazione sono are calcolati ad ogni lunghezza d’onda• Le concentrazioni calcolate danno una stima dell’accuratezza


Asso

rban

za [A

U]

0.0

0.4Co

ncen

trazio

ne

0.2

0.6

0.8

7.08.0

9.0

10.0

11.0Concentrazione misurataConcentrazione vera

Intervalloottimale

Attilio Citterio

Precisione di una Analisi

La precisione di un metodo è il grado di accordo tra I singoli risultati delle prove quando si applica ripetutamente la procedura a campionamenti multipli

Numero di misure

Valor

e [m

g/m

l]

Media = 1.41 mg/mlDeviazione standard = 0.022 mg/ml

2 4 6 8 10

31.36

31.38

31.40

31.42

31.44

Attilio Citterio

Lunghezza(e) d’Onda per la Migliore Sensibilità

• Il calcolo della deviazione standard relativa dei valori misurati ad ogni lunghezza d’onda

• La lunghezza d’onda con la RSD % inferiore possibilmente fornirà la migliore sensibilità


Asso

rban

za [A

U]

0.00

0.100.05

0.150.200.25

0.00.20.40.60.81.0

% R

SD Intervalloottimale

Attilio Citterio

Lunghezza(e) d’Onda per la Migliore Selettività

La selettività è l’abilità di un metodo a quantificare accuratamente e specificamente l’analita o analiti in presenza di altri composti


Asso

rban

za [A

U]

0.0

0.4

Conc

entra

zione

[mg/m

l]

0.2

0.60.8

5

10

15

20Concentrazione misurataConcentrazione vera Intervallo

ottimale

Attilio Citterio

Assorbanza Ideale e Standard di Lunghezza d’Onda

• Uno standard ideale di assorbanza dovrebbe avere una assorbanza costante a tutte le lunghezze d’onda

• Uno standard ideale di lunghezza d’onda dovrebbe avere picchi molto stretti e ben-definiti

Lunghezza d’onda [nm]200

Asso

rban

za [A

U]

250 200 350 400 450 500 550 600 700 8000.0

0.2

0.4

0.06

0.8Standard di assorbanza

Standard di lunghezza d’onda

Attilio Citterio

Filtro Ideale per Luce Diffusa

Un filtro ideale di luce diffusa dovrebbe trasmettere tutte le lunghezze d’onda eccetto quelle usate per misurare la luce diffusa


Tras

mitta

nza

[AU]

250 300 350 400 450 500 600 7000

20

40

60

80

100

Attilio Citterio

Soluzione di Perclorato di Olmio

Il più comune standard per l’accuratezza della lunghezza d’onda è il perclorato di olmio


Asso

rban

za [A

U]

400300 500 600 8000

0.2

0.4

0.6

0.8

Attilio Citterio

Soluzione di Dicromato di Potassio

Lo standard di accuratezza fotometrica richiesto da molte farmacopee è una soluzione di bicromato di potassio


Asso

rban

za [A

U]

250 300 350 500 6000.0

0.5

1.0

1.5

2.0

400 450 550

350 nm

257 nm235 nm

313 nm

Attilio Citterio

Soluzioni Standard per Luce Diffusa

I più comuni standard per luce diffusa e le rispettive lunghezze d’onda usate


Tras

mitta

nza

[AU]

250 300 350 500 700400 450 6000

20

40

60

80

100 KCl200 nm

NaI220 nm

NaNO2340 nm

Attilio Citterio

Toluene in Esano (0.02% v/v)

La risoluzione è stimata prendendo il rapporto dell’assorbanza del massimo vicino a 269 nm e il minimo vicino a 266 nm.


Asso

rban

za [A

U]

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

260 262 264 266 268 270 272 274 276

Picco – 0.442 AU

Valle – 0. 275 AU

Rapporto – 1.61

Attilio Citterio

Analisi di Conferma

Nell’analisi di conferma, si usa l’assorbanza ad una o più ulteriori lunghezze d’onda per quantificare un campione


Asso

rban

za [A

U]

260 270 280 310290 300 3200.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Acido salicilico

284 nm274 nm264 nm

Caffeina

Attilio Citterio

Similarità Spettrale

Grafici comparativi di spettri simili e dissimili


0.0

0.20.40.60.81.0

Norm

alizz

atoNo

rmali

zzato

Lunghezza d’onda [nm]0.0

0.20.40.60.81.0

Incognito

250 300

Stan

dard

[AU]

Stan

dard

[AU]

Incognito [mAU]

Incognito [mAU]0.0 0.1 0.2 0.3

0.0 0.5 1.0 1.5

Correlazione = 0.056

0.0

0.1

0.2

0.3

0.0

0.1

0.2

0.3Correlazione = 0.999

Incognito

Standard

Standard

Attilio Citterio

Precisione e Accuratezza

Precisione – Precisione + Precisione – Precisione +Accuratezza – Accuratezza – Accuratezza + Accuratezza +

Attilio Citterio

Uso dell’UVCinetica dell’Idrolisi del Sultone


Ass

orba

nza

[AU

]

Attilio Citterio


La geometria più semplice si trova negli strumenti a singolo raggio. Per effettuare la misura, si introduce prima il bianco e se ne misura la Io . Quindi si introduce il campione (utilizzando la stessa cuvetta) e se ne misura la I, e lo strumento ne calcola a scelta la trasmittanza o l’assorbanza.

Gli strumenti a raggio singolo sono poco costosi, hanno alta resa luminosa, e perciò alta sensibilità, a causa della semplicità del sistema. Lo svantaggio sta nel tempo che deve intercorrere tra le due misure e nell’aumento dei problemi di deriva.

Sorgente

Fenditurad’ingresso

Dipsositivo didispersione

Monocromatore

Fenditurad’uscita

Campione

Rivelatore

Attilio Citterio

Rivelazione Spettrofotometricaa “diode array”

Un rivelatore spettrofotometrico a “diode-array” usa una batteria di rivelatori e una configurazione ottica “inversa”, con il dispositivo di dispersione collocato dopo il campione. Si ha il vantaggio che solo la luce passante sull’asse dalla sorgente alla fenditura prima del dispositivo di dispersione raggiunge il rivelatore; la luce avente altri angoli viene scartata. Così la luce ambiente non interferisce e si può lasciare aperta la zona del campione, rendendo il sistema più facile da utilizzare e versatile.

La luce di tutte le lunghezze d’onda colpiscono il “diode-array” e sono misurate simultaneamente. Lo spettro si recupera per scansione elettronica della batteria. In principio, gli spettrofotometri a “diode-array” possono avere una geometria a raggio singolo o doppio ma, in pratica, i vantaggi dei primi si combina bene con il rivelatore a “diode-array”.Sorgente

Policromatore

Dispositivo didispersione

Campione

Fessurad’ingresso

batteria di diodi

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