DIMOSTRAZIONE DELLA SEQUENZA DI REAZIONE: METEMOGLOBINA-EMOGLOBINA-OSSIEMOGLOBINA

SU SEPHADEX G-25

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His 58, His 87

metemoglobina

La emoglobina tende ad ossidarsi, ma in circolo solo lo 0.5% di essa si trova sotto forma ossidata perché c’è un sistema enzimatico (metemoglobina riduttasi) che provede a trasformare la emoglobina ossidata (Fe 3+) in emoglobina ridotta (Fe 2+)

metemoglobinemie

mancanza congenita di metemoglobina riduttasi varianti emoglobiniche

nature new biology 237, 259-263 (28 June 1972) Subunit Interaction of Haemoglobin M Milwaukee

M. F. PERUTZ1 ,  P. D. PULSINELLI2 &  HELEN M. RANNE

IN four of the five different abnormal haemoglobins that cause

methaemoglobinaemia, methaemoglobin reductase is ineffective, because either the

proximal or the distal haem-linked histidines in one pair of subunits have been replaced

by tyrosines.

varianti catena

HbM Boston

HbM Iwate

HbM Saskatoon

HbM Hyde Park

HbM Milwaukee

His che interagiscono con l’eme

mutazioni che provocano metemoglobinemie

• DIMOSTRAZIONE DELLA SEQUENZA DI REAZIONE: METEMOGLOBINA-EMOGLOBINA-OSSIEMOGLOBINA SU SEPHADEX G-25

• Materiali e soluzioni• 1. Colonna cromatografica 1.5 cm (diametro interno)x 8 cm, preimpaccata con sephadex G-25(Pharmacia PD-10)• 2. Pipette: 200 l, 1000l e pipetta pasteur• 3. Eluente: tampone fosfato 20 mM, pH 7• 4. Sangue intero con anticoagulante, ditionito di sodio (30mg/ml), ferricianuro di potassio

(K3Fe(CN)6), metemoglobina preparata come riportato di seguito.

• Procedura sperimentale• Fissare la colonna sull’apposito supporto. Preparare la soluzione di ditionito di sodio (30 mg in 1 ml di H2O distillata) e di metaemoglobina (diluire 0.5 ml di sangue intero a

2 ml con tampone fosfato; agitare fino a completa emolisi e poi aggiungere 15 mg di ferricianuro di potassio). Effettuare 3-4 lavaggi della colonna con tampone fosfato allo scopo di allontanare ogni traccia della azide sodica impiegata per preservare la colonna dall’azione batterica. A colonna chiusa applicare sul letto sephadex 100 l di soluzione di ditionito , quindi eluire immediatamente raccogliendo 30 gocce di tampone fosfato. Chiudere la colonna ed applicare 200 l di soluzione di metaemoglobina. Eluire.

• Risultati• Questo esperimento dimostra non solo il principio della gel cromatografia (cromatografia ad esclusione) ma anche come poter rimuovere uno dei due prodotti di una

reazione realizzata su colonna.• Il ditionito di sodio (Na2S2O4), un sale a basso peso molecolare, viene applicato come un disco molto stretto sulla sommita’ della colonna. La metaemoglobina, essendo una

sostanza ad alto peso molecolare, viene esclusa dalle particelle porose di sephadex G-25 e pertanto si muove attraverso gli spazi interstiziali. In pratica la metaemogloina migra piu’ velocemente del ditionito di sodio e del ferricianuro di potassio (che è presente in eccesso). Nel corso del movimento dei diversi soluti attraverso la colonna è possibile osservare i seguenti cambiamenti:

• le metaemoglobina (banda marrone) si separa dall’eccesso di ferricianuro di potassio (banda gialla) e si trasforma in emoglobina banda di color porpora) non appena è ridotta dal ditionito. A sua volta, l’emoglobina lascia la zona del ditionito sotto forma di banda porpora ed è quindi rapidamente trasformata in ossiemoglobina, di color scarlatto, ad opera dell’ossigeno disciolto nell’eluente (tampone fosfato). Queste reazioni possono essere così schematizzate:

• emoglobina + K3Fe(CN)6= metaemoglobina• metemoglobina + Na2S2O4 = emoglobina

• emoglobina +O2 = ossiemoglobina

CROMATOGRAFIA

Tecnica di separazione di molecole tra FASE STAZIONARIA FASE MOBILE

La separazione si ottiene perché le sostanze migrano con diversa velocità attraverso la fase stazionaria

La migrazione è provocata dal flusso della fase mobile o eluente

FASE STAZIONARIA

Particelle di determinate dimensioni impaccate su colonna o stratificate su un supporto solido (strato sottile)

FASE MOBILE

Viene fatta scorrere attraverso la fase stazionaria

SOSTANZE

Vengono trasportate lungo la fase stazionaria dalla fase mobile

CROMATOGRAFIA AD ADSORBIMENTO: le sostanze interagiscono con la superficie delle particelle costituenti la fase stazionaria

CROMATOGRAFIA DI PARTIZIONE: le sostanze si separano in base alla diversa ripartizione tra fase stazionaria e fase mobile

GEL CROMATOGRAFIA (ad esclusione molecolare): La fase stazionaria è rappresentata da un GEL, attraverso cui scorre l’eluente

GEL: viene preparato permettendo il rigonfiamento delle particelle in eccesso di eluente Generalmente la matrice del gel possiede gruppi idrofilice (-OH) Il gel viene impaccato mediante il passaggio di eluente attraverso di essa

Sephadex

E’ costituito da DESTRANO, un polisaccaride costituito da residui di glucosio

Viene prodotto da ceppi differenti di Leuconostoc mesenteroidesche crescono in un medium contenente saccarosio Successivamente il destrano viene polimerizzatocon EPICLOROIDRINA

Tre stadi nel corsodella separazione

low molecular weight

high molecular weight

Gel particles

Principio di ripartizione: le molecole piccole possono entrare nel gel attraverso i grani della fase stazionaria (equilibrio dinamico) le molecole più grosse passano attraverso i grani di gel senza interagire con esso il sistema può essere complicato a causa di particolari interazioni con la matrice del gel

ESERCITAZIONE

Sangue metaemoglobina emoglobina emoglobina ossigenata

K 3Fe(CN)6

Fe(III)marrone

Fe(II)rosso porpora

rosso

6Fe3++S2O42- 2SO4

2- + 8H+ + 6Fe2+4H2O+3

1) Aggiungo prima ditionito di sodio2) Poi metaemoglobina

marronerosso porporarosso

metaemoglobina

+6

ditionito

Na2S2O4

La metaemoglobina è più veloce e raggiunge il ditionito tornando allo stato di ossidazione Fe(II) assumendo quindi la colorazione rossae successivamente rosso più chiaro grazie alla presenza di Ossigeno nelle soluzioni in colonna