DOMANDA FREQUENTE:

QUALE E’ LA FUNZIONE DI UNA CERTA PROTEINA ?

OVERESPRESSIONE DELLA PROTEINA

ESPRESSIONE ECTOPICA CON UN VETTORE DI ESPRESSIONE

ABOLIZIONE DELLA ESPRESSIONE DELLA PROTEINA

INTERFERENZA A RNA (RNAi)

SI AUMENTA O SI DIMINUISCE

L’ESPRESSIONE DELLA PROTEINA

ALLA RICERCA DI EVENTUALI VARIAZIONI FENOTIPICHE !

RECETTORI EFRINICI: è la più numerosa famiglia di è la più numerosa famiglia di

RTK (Receptor Tyrosine Kinases),

composta da 16 membri.

RECETTORI EFRINICI

REGOLANO:

l’adesione cellula-cellula,

RECETTORI NON SOLUBILI:

Proteine di membrana di un’altra cellula

l’adesione cellula-cellula,

la motilità,

la invasività

(METASTASI)

RECETTORI EFRINICI

La loro over-espressione

o iper-fosforilazione (pTyr)

è associata al fenotipo tumorale

in tumori prostatici.

STUDIO DEGLI EFFETTI FENOTIPICI

CAUSATI DALLA OVER-ESPRESSIONE

DEL RECETTORE Eph

IN CELLULE IN COLTURA

vantaggi:1) l’ambiente extracellulare puo’ essere manipolato

Colture cellulari= propagazioni di cellule fuori dall’ organismo

1) l’ambiente extracellulare puo’ essere manipolato

2) uso di un tipo cellulare ben definito

3) grandi quantita’ di cellule

4) studio di varie funzioni cellulari

Due tipi di colture cellulari:1) colture primarie

2) linee cellulari

Linee cellulari

Possono derivare da varie fonti:

cellule trasformate in vitro cellule trasformate in vitro (p.e. espressione di oncogene)

espianti tumorali

(posti in coltura crescono indefinatamente)

differentiating

muscle

cell line =cell line =

C2C12

Vettore di espressione per cellule animali in coltura

Piccolo introne

G418 - GENETICIN

Blocca la traduzione in tutti gli organismi

La resistenza è conferita da una chinasi (Neo R) che fosforila l’antibiotico,

inattivandolo

LIPOFEZIONE

Si utilizzano “liposomi”caricati con caricati con

i vettori di espressione

Possibilità di

modulare negativamente

l’espressione di specifici geni

Somministrazione sperimentale

siRNA

FORTE RIDUZIONE DELL’ESPRESSIONE DELLA

PROTEINA

Somministrazione sperimentale

di siRNA

5’ NT 5’ NT 5’ NT 5’ NT “non tradotto”“non tradotto”“non tradotto”“non tradotto” 3’ NT3’ NT3’ NT3’ NTContiene una

ORF continua !!

Retrotrascrizione

in cDNA

Sul cromosoma 1 posizione 1p36

GENE: circa 35 kbp,

17 esoni mRNA: 3970 basi (12%)

ORF: 2931 basi (circa 150 basi di 5’-NT e circa 900 di 3’-NT)

Peptide: 976 aminoacidi

Gene: circa 35.000 basi (negative strand)

16 370 247 16 553 713

Circa 180.000 basi

SEQUENZA DEL cDNA

SEQUENZA DEL cDNA (mRNA)SITO DI INIZIO

DELLA

TRADUZIONE

STOP

5’ NT

(non tradotto)

STOP

3’ NT

Poly Adenylation site

•/translation="MELQAARACFALLWGCALAAAAAAQGKEVVLLDFAAAGGELGWL•THPYGKGWDLMQNIMNDMPIYMYSVCNVMSGDQDNWLRTNWVYRGEAERIFIELKFTV•RDCNSFPGGASSCKETFNLYYAESDLDYGTNFQKRLFTKIDTIAPDEITVSSDFEARH•VKLNVEERSVGPLTRKGFYLAFQDIGACVALLSVRVYYKKCPELLQGLAHFPETIAGS•DAPSLATVAGTCVDHAVVPPGGEEPRMHCAVDGEWLVPIGQCLCQAGYEKVEDACQAC•SPGFFKFEASESPCLECPEHTLPSPEGATSCECEEGFFRAPQDPASMPCTRPPSAPHY•LTAVGMGAKVELRWTPPQDSGGREDIVYSVTCEQCWPESGECGPCEASVRYSEPPHGL•

SEQUENZA PROTEICA

N terminal (citoplasmatico)

•TRTSVTVSDLEPHMNYTFTVEARNGVSGLVTSRSFRTASVSINQTEPPKVRLEGRSTT•SLSVSWSIPPPQQSRVWKYEVTYRKKGDSNSYNVRRTEGFSVTLDDLAPDTTYLVQVQ•ALTQEGQGAGSKVHEFQTLSPEGSGNLAVIGGVAVGVVLLLVLAGVGFFIHRRRKNQR•ARQSPEDVYFSKSEQLKPLKTYVDPHTYEDPNQAVLKFTTEIHPSCVTRQKVIGAGEF•GEVYKGMLKTSSGKKEVPVAIKTLKAGYTEKQRVDFLGEAGIMGQFSHHNIIRLEGVI•SKYKPMMIITEYMENGALDKFLREKDGEFSVLQLVGMLRGIAAGMKYLANMNYVHRDL•AARNILVNSNLVCKVSDFGLSRVLEDDPEATYTTSGGKIPIRWTAPEAISYRKFTSAS•DVWSFGIVMWEVMTYGERPYWELSNHEVMKAINDGFRLPTPMDCPSAIYQLMMQCWQQ•ERARRPKFADIVSILDKLIRAPDSLKTLADFDPRVSIRLPSTSGSEGVPFRTVSEWLE•SIKMQQYTEHFMAAGYTAIEKVVQMTNDDIKRIGVRLPGHQKRIAYSLLGLKDQVNTV••GIPI“ C TERMINAL (EXTRACELLULARE)

Sequenzasegnale interna

etrans-membrana

2Sequenza segnale

INTERNAN

Presenza di

AA carici +

a montedella seq. segnale interna

3

Inizio traslocazione al RER

e successivointrappolamentonella membrana.

AA carici +

Sequenza segnale: NON VIENE TAGLIATA E FUNGE ANCHE DA SEQ . DI ARRESTO !

a valledella seq. segnale interna

STRATEGIA DI AMPLIFICAZIONE

DELL’ mRNA

3’ NT

Poly Adenylation site

PURIFICAZIONE DELLA FRAZIONE polyA+

Catene di oligo dTlegate alla matrice

Strategia di amplificazione mediante PCR

al fine ricavare la regione codificante per la EphA2,

ottenendo un frammento con EcoRI alle due estremità,

per facilitare il successivo clonaggio.

5’----GGGAUCCCC AUCUGAGCCU CGACAGGGCC UGGAGCCCCA UCGG ---- 3’

3’ TAGACTCGGA GCTGTCCCGGCTTAAGGGCCGG

PRIMER REVERSE

EcoRI

PRIMER REVERSE

SUL CODONE DI STOP,

CONTENENTE, AL 5’,

IL SITO PER EcoRI

E 6 ALTRE BASI

Strategia di amplificazione mediante PCR

al fine ricavare la regione codificante per la EphA2,

ottenendo un frammento con EcoRI alle due estremità,

per facilitare il successivo clonaggio.

5’----UCGGACCGAG AGCGAGAAGC GCGGCAUGGA GCUCCAGGCA ----- 3’ RNA

3’----AGCCTGGCTC TCGCTCTTCG CGCCGTACCA CGAGGTCCGT ----- 5’cDNA

GGCCGGGAATTCAGCGAGAAGC GCGGCATGGA 3’

PRIMER FOWARD

EcoRI

PRIMER FORWARD

SUL CODONE DI INIZIO,

CONTENENTE, AL 5’,

IL SITO PER EcoRI

E 6 ALTRE BASI

5’----GGGAUCCCC AUCUGAGCCU CGACAGGGCC UGGAGCCCCA UCGG -- 3’ RNA

3’ TAGACTCGGA GCTGTCCCGGCTTAAGGGCCGG

PRIMER REVERSE

EcoRI

E 6 ALTRE BASI

PRIMER REVERSE

SUL CODONE DI STOP,

CONTENENTE, AL 5’,

IL SITO PER EcoRI

E 6 ALTRE BASI

AMPLIFICAZIONE MEDIANTE RT-PCR

1) Copiatura dell’mRNA con trascrittasi inversa e creazione del

primo filamento di cDNA

2) Inizio della reazione di PCR con copiatura del filamento di

cDNA ottenuto con RT

3) Amplificazione del doppio filamento di cDNA

1

2

1

3

EcoRI

5’ GAATTC

5’

5’

GGCCGGGAATTCCCGGCCCTTAAG

5’

5’GAATTCGGCCGGCTTAAGCCGGCC

5’ 5’

Taglio con EcoRIGenerazione di terminali “appiccicosi”

Vettore di espressione

per cellule di mammifero

Inizio trascrizione

resistenza alla Ampicillinaper selezione nel batterio

ori C di E.coli

termine trascrizioneresistenza al G418 (Neo)per selezione nelle cellule animali

AZIONE DELLA DNA LIGASI

PROTOCOLLO PER LA DNA LIGASI

Vettore: 5670 bp

Inserto: circa 2950 bp

1.9

DNA LIGASI

TRASFORMAZIONE:

Si utilizzano cellule di E.coli “competenti”

(danneggiate con shock salino, ma ancora vitali)

Il DNA entra (molto raramente, 1/106) nelle cellule

Le cellule vengono spatolate su terreno selettivo

(agar con LB e Ampicillina, in piastre Petri da 10 cm)

Dopo una notte a 37°si recuperano le singole colonieDopo una notte a 37°si recuperano le singole colonie

INOCULO DI SINGOLE COLONIE

IN TERRENO LB LIQUIDO

(crescita O/N)

PURIFICAZIONE DEI PLASMIDI IN PICCOLA SCALA

(MINIPREP)

SCHEMA DELLE ESERCITAZIONI PRATICHE

• Recupero dei dati in rete: sequenze dell’ mRNA e della proteina.

• Amplificazione del cDNA mediante RT-PCR di mRNA (frazione polyA+), con l’uso

di primer che aggiungono siti di riconoscimento per EcoRI alle estremità

• Digestione con EcoRI e inserimento in vettore di espressione eucariotico

(pTargetT). Reazione di ligasi

• Trasformazione e isolamento colonie

• Inoculo di singole colonie in terreno liquido

• Inoculo colonie in LB, crescita in liquido. GIORNO 1• Inoculo colonie in LB, crescita in liquido. GIORNO 1

• Preparazione del plasmide (miniprep)

• Controllo della qualità del plasmide su gel di agarosio

• Digestione dei cloni positivi con EcoRI

• Controllo dei digeriti su gel di agarosio GIORNO 2

• Preparazione su larga scala dei cloni positivi

• Esperimento di trasfezione su cellule di mammifero in coltura