Aspetti generaliAspetti generalidelladella

Trasduzione del SegnaleTrasduzione del Segnale

Concetti chiave

SpecificitàAmplificazioneIntegrazione

Interruttori ‘On-Off’Feedback

Gli organismi multicellulari e in particolare i neuroni hanno GROSSI Gli organismi multicellulari e in particolare i neuroni hanno GROSSI problemi di comunicazioneproblemi di comunicazione

??

Hei tu – I tuoi outputs sono

troppo deboli!!!

Oi! Abbiamo bisogno di

inputs!

Avanti N. 7, adesso devi spegnerti!

Per piacere, vuoi smettere di

inviare segnali?

I Problemi del SignallingI Problemi del Signalling

Le cellule in generale, e i neuroni in particolare, sono esposti a una moltitudine di segnali inclusi quelli provenienti da altre cellule (p.es. segnali derivati da lipidi, piccole molecole organiche o peptidi) così come stimoli ambientali (p.es. luce,

calore o variazioni dell’osmolarità)

Selezionare i segnali rilevanti da quelli irrilevanti

Captare segnali di bassa intensità

Tradurre segnali diversi in un comune ‘linguaggio’ intracellulare

Le soluzioniLe soluzioni

Selezionare i segnali rilevanti da quelli irrilevanti

Captare segnali di bassa intensità (ad es. a basse concentrazioni)

Tradurre segnali diversi in un comune ‘linguaggio’ intracellulare

Recettori con un alto grado di specificità

Recettori ad alta affinità accoppiati ad un sistema di amplificazione

Attivazione di vie di signalling disegnate attorno a un limitato numero di processi comuni

Cosa fanno I segnaliCosa fanno I segnali

Le cellule rispondono ai segnali in una varietà di modi

Alterazione del metabolismo p.es. Alterazione del metabolismo del glicogeno in risposta all’insulina

Eccitamento p.es. propagazione dell’impulso nervoso in risposta a neurotrasmettitori

Crescita e Divisione (mitosi) in risposta a fattori di crescita

Morte cellulare programmata causata da specifici fattori di ‘morte’ o dalla rimozione di alcuni fattori essenziali

Espressione genica alterata – p.es. Sintesi di nuove proteine di membrana in risposta ad un incremento dell’attività sinaptica (plasticità sinaptica)

Far attraversare il segnaleFar attraversare il segnale

Molti segnalatori (p.es. neurotrasmettitori) non possono attraversare la membrana ploasmatica. Le cellule risolvono questo problema utilizzando recettori transmembrana. Questi sono proteine posizionate in membrana con il sito attivo per il ligando* sul lato extracellulare e un dominio intracellulare che si accoppia al passo successivo nella catena di trasduzione del segnale

*Ligando – una molecola che si lega ed è riconosciuta da un recettore

Dominio di legame

extracellulare

Dominio intracellulare – si accoppia al passo

successivo (può avere attività enzimatica)

Dominio transmembrana

Membrana plasmatica

esterno

iinterno

Definizione di RecettoreDefinizione di Recettore

Affinchè una proteina possa essere classificata come recettore (e non una semplice proteina di legame) devono essere soddisfatti diversi criteri

Specificità – un recettore deve essere in grado di distinguere tra segnali spesso strettamente correlati

Alta affinità – Le molecole segnalatrici sono spesso presenti a basse concentrazioni – I recettori possono spesso captare concentrazioni tra nM e pM

Saturabilità – una cellula ha un numero finito di recettori, quindi vi è un limite al numero di molecole di ligando che una cellula può legare

Reversibilità – l’associazione ligando-recettore non è covalente – quando la concentrazione del ligando diminuisce il complesso può dissociarsi

Accoppiamento – il recettore trasferisce un segnale dal ligando alla cellula

É quest’ultima caratteristica, più di ogni altra che contraddistingue un recettore da una proteina di legame

Curva di attivazione - Saturazione

(A) Se varia il numero dei recettori presenti si modifica il livello di saturazione della curva

(B) Se varia l’affinità del recettore per il messaggero la curva trasla sull’asse delle concentrazioni senza che si modifichi il livello di saturazione.

k1 k2k3

Risposta sigmoideRisposta iperbolica

sk

sV

dt

dp

m

max

nn

m

nmax

sk

sV

dt

dp

dt

dp

s

dt

dp

s

Una risposta sigmoide denota cooperatività e insorge ogni qual volta un recettore (o un enzima) presenta “n” siti di binding per il ligando “s” (n≡coefficiente di Hill è un numero intero >1)

Risposte iperboliche e sigmoidi

Le risposte sigmoidi sono caratteristiche di molte cascate di signaling, e rappresentano ciò che i biologi chiamano una risposta ultrasensibile ad un input.

Una risposta iperbolica insorge ogni qual volta un recettore (o un enzima) presenta un unico sito di binding per il ligando “s”

Una doppia fosforilazione come causa di ultrasensibiltà

Le cascate di MAP kinasi spesso ricevono inputs da molecole di signaling presenti in membrana in risposta a stimoli extracellulari.

Come mai sono utilizzate tre kinasi invece di una?

raf

Erk1

Mek1

ATP

ADP

ATP

ADP

MAP chinasichinasi

MAP chinasi

Fattore di Crescita

MAP chinasichinasi chinasi

Un importante aspetto del comportamento allo stato stazionario di un sistema di signaling è la forma della curva stimolo-risposta del sistema.

Un enzima che mostra sensibilità iperbolica richiede un incremento dello stimolo di input di 81 volte per essere portato dal 10% al 90% di attivazione massima.

Al contrario, alcuni enzimi e sistemi di signaling mostrano curve stimolo-risposta sigmoidi, che spesso sono ben approssimate dall’equazione di Hill:

y = xnH/(EC50 + xnH)

Un esempio molto comune di sistemi che mostrano curve stimolo-risposta sigmoidi è rappresentato dagli enzimi cooperativi.

Un sistema ultrasensibile richiede un incremento inferiore ad 81 volte nello stimolo di input per guidarlo dal 10% al 90% di massima attivazione

% d

i S

-P a

llo

sta

to-s

tazi

on

ario

[kinasi] in multipli di EC50

La cascata delle MAP kinasi esibisce una risposta marcatamente ultrasensibile

La risposta è marcatamente ripida; mentre un enzima con risposta iperbolica richiede un incremento di 81 volte dello stimolo di input per guidarlo dal 10% al 90% di attivazione massima, Erk2 (una MAPK) richiede un aumento di circa 2.5 volte

Pertanto, c’è qualcosa nel meccanismo a cascata che genera una risposta ad interruttore partendo da stimoli graduali.

Att

ivit

à d

i E

rk2

allo

sta

to-s

tazi

on

ario

[Mos] (nM)

Erk2=MAPKMos=MAPKKK

a) La MAPKK fosforilata si dissocia dalla MAPKKK

b) La seconda fosforilazione richiede una seconda collisione

allora la velocità di conversione della MAPKK fosforilata a doppiamente fosforilata aumenterà con il quadrato della concentrazione dello stimolo

La reazione del secondo ordine si traduce in una curva stimolo-risposta ultrasensibile con un coefficiente di Hill di 2.

Recenti studi indicano che la MAPK è fosforilata mediante un meccanismo a doppia collisione.

PMAPKKPMAPKKMAPKKK

PPMAPKKPMAPKK-PMAPKKK

La doppia fosforilazione avviene mediante una doppia collisione

L’attivazione delle MAPK dipende dalla fosforilazione di due siti nella MAPK. Anche la completa attivazione di MAPKK richiede la fosforilazione di due siti.

Qui si assume che le MAPKKK sono attivate e inattivate da enzimi denominati El e E2. MAPKKK* rappresenta la MAPKKK attivata. MAPKK-P e MAPKK-PP rappresentano MAPKK singolarmente e doppiamente fosforilate, rispettivamente. MAPK-P e MAPK-PP rappresentano MAPK singolarmente e doppiamente fosforilate, rispettivamente. P'ase rappresenta una fosfatasi.

Schema di una cascata di MAPK

Vero ordine zero per v=Vmax

Vero

prim

o or

dine

a) v in funzione di [S], per un ampio range di [S]

b) v in funzione di [S], per un ridotto range di [S] dove [S] << Km (~cinetica del 1° ordine)

c) v in funzione di [S], per un range di [S] dove [S] > Km (~cinetica di ordine zero)

Per semplicità si è plottato [S’], dove [S’]=[S]/Km

][][max SkSK

Vv

m

maxVv

Cinetiche di ordine 1 e zero

Vel

oci

tà d

i re

azi

on

e

S-P come % di S + S-P totale

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

0 20% 40% 60% 80% 100%

[kinasi]1

2

3

Derivazione grafica delle curve stimolo-rispostaSensibilità iperbolica

Un semplice sistema di fosforilazione-defosforilazione: un substrato S è fosforilato da una kinasi per ottenere S-P, che può essere defosforilato da una fosfatasi per riottenere S.

kinasi

fosfatasi

Si assume che la kinasi e la fosfatasi siano lontani dalla saturazione.

Allora la velocità della reazione verso destra (linea continua) diminuirà e quella verso sinistra (linea tratteggiata) aumenterà, entrambe linearmente (reazione del primo ordine) all’aumentare della percentuale di substrato fosforilato

Nel punto di intersezione delle linee tratteggiata e continua il sistema è allo stato stazionario.

Raddoppiando la concentrazione della kinasi: la pendenza della linea della reazione verso

destra raddoppia: ][kinasikv

Derivazione grafica delle curve stimolo-rispostaSensibilità iperbolica

[kinasi]

Vel

oci

tà d

i re

azi

on

e

S-P come % di S + S-P totale

kinasi

fosfatasi Raddoppiando la concentrazione della kinasi la pendenza della linea della reazione verso destra raddoppia.

Adesso la velocità della reazione verso destra sarà superiore a quella della reazione inversa, e il livello di S-P aumenterà.

Però, aumentando S-P la velocità della reazione verso destra decadrà e la velocità della reazione inverse aumenterà.

Verrà eventualmente raggiunto un nuovo stato stazionario, con il punto di intersezione e la percentuale di S-P allo stato stazionario spostati a destra.

Derivazione grafica delle curve stimolo-rispostaSensibilità iperbolica

Plottando i livelli di S-P allo stato stazionario del precedente grafico in funzione della [kinasi] si ottiene una curva stimolo-risposta iperbolica

Il sistema è massimamente sensibile (la curva stimolo-risposta ha la massima pendenza) a bassi livelli di stimolo, e diventa progressivamente meno sensibile all’aumentare dello stimolo.

% d

i S

-P a

llo

sta

to-s

tazi

on

ario

[kinasi] in multipli di EC50

Derivazione grafica delle curve stimolo-rispostaUltrasensibilità a steps multipli

kinasi

fosfatasi

La curva stimolo-risposta è sigmoide (linea continua), con nH=2. La curva sigmoide ha maggiore pendenza di quella iperbolica (linea tratteggiata) per stimoli intorno alla EC50, ma è meno ripida per stimoli molto piccoli e molto grandi.

[kinasi]

Vel

oci

tà d

i re

azi

on

e

S-P come % di S + S-P totale

% d

i S

-P a

llo

sta

to-s

tazi

on

ario

[kinasi] in multipli di EC50In una reazione di doppia fosforilazione a due steps la velocità della reazione verso destra aumenta con il quadrato dell’ammontare di kinasi presente.

La pendenza della linea della reazione verso destra varia con il quadrato della concentrazione della kinasi presente

2][kinasikv

Ultrasensibilità con cinetica di ordine zero

L’ultrasensibilità può anche insorgere quando la kinasi e la fosfatasi operano vicino alla saturazione. In effetti le MAPK sono fisiologicamente presenti a concentrazioni sufficientemente elevate da saturare parzialmente le MAPKK.

Se la kinasi e la fosfatasi sono parzialmente saturati, le loro velocità non variano linearmente all’aumentare di S-P: le rette sono sostituite con curve iperboliche.

La curva stimolo-risposta è sigmoide (linea continua), con nH=2.5. La curva iperbolica è rappresentata dalla linea tratteggiata.

[kinasi]

Vel

oci

tà d

i re

azi

on

e

S-P come % di S + S-P totale

% d

i S

-P a

llo

sta

to-s

tazi

on

ario

[kinasi] in multipli di EC50

Interruttori di accensione e spegnimentoInterruttori di accensione e spegnimento

La maggior parte dei segnali è transitoria e pure la risposta dovrebbe essere transitoria. Se si accende un segnale, c’è anche bisogno di una via per spegnerlo. Per esempio, il mancato spegnimento di un segnale che fa aumentare la [Ca2+] nel citosol è una delle cause che induce la morte cellulare.

Pertanto, ciò che andiamo cercando sono dei sistemi biochimici in grado di passare rapidamente tra due stati: acceso (on) e spento (off).

In molti sistemi di signalling accensione e spegnimento sono operati da proteine G e/o da proteine di fosforilazione

Interruttori On-Off –Proteine G eterotrimericheInterruttori On-Off –Proteine G eterotrimeriche

Il ciclo di base di legame del GTP/GDP nele proteine G eterotrimeriche. è lo stesso di quello delle proteine G monomeriche.

GDP

GTP

Pi

GTP

GDPGDP

ATTIVA

INATTIVA

Scambio del GDP legato col GTP

La subunità attiva può interagire con lo step successivo della catena di ì signalling e

attivarlo

La subunità si dissocia da

Attività GTPasica della

subunitàGTP GDP+Pi

La subunità si riassocia a

Interruttori On-Off – Proteine G monomeriche Interruttori On-Off – Proteine G monomeriche

Ras (p21ras) è un buon esempio per questo tipo di switch. Ras è una piccola (21 kDa) proteina monomerica che lega il GTP o il GDP e ha un’attività GTPasica intrinseca

p21ras GDP p21rasGTP

p21ras

p21ras GDP

On

Off

GTP

Pi

GDP

ATTIVAINATTIVA

Il fattore di scambio del nucleotide

guanidinico (GEF) interagisce con ras

Ciò causa lo scambio del GDP legato con il GTP

L’attività GTPasica intrinseca idrolizza il

GTP a GDP e Pi

Ras GTPasi stimolata dall’associazione con la GTPase-activating

protein (GAP)

ras attivata interagisce con il componente

successivo della catena di signalling e lo attiva

Attivatori di ras

G-protein Exchange Factors (GEF)

•SOS (Son of Sevenless) - Un GEF importante nella regolazione della via della crescita cellulare MAPK/ERK.

•eIF-2b (Eukaryotic Initiation Factor 2) è richiesto per dare inizio alla sintesi proteica.

•Ras-GRF1.

•Recettori per fattori di crescita.

rasrafras

GTP

Risposta

Cascata delle MAP chinasi

L’attivazione di ras da parte della CaMKII attiva la via delle MAP chinasi

CaMKII

Interruttori On-Off – Proteine di Interruttori On-Off – Proteine di fosforilazione/defosforilazionefosforilazione/defosforilazione

Protein Kinasi – trasferiscono un fosfato dall’ATP ad amino acidi specifici

C

C C O

O

H

NH Serina

C

C C O

O

NH

OP

O-

O-

O-fosfoserina

KinasiATP

ADP

Protein Fosfatasi – rimuovono un fosfato da specifici amino acidi

C

C C O

O

H

NH Serina

C

C C O

O

NH

OP

O-

O-

Fosfatasi

Pi

Fosforilazione Defosforilazione

O-fosfoserina

Interruttori On-Off – Proteine di fosforilazioneInterruttori On-Off – Proteine di fosforilazione

Kinasi e Fosfatasi fosforilano/defosforilano specifici amino acidi

Amino Acido Kinasi Fosfatasi

Ser & Thr Protein kinasi C

MAP kinasi

PP1

PP2A

Tyr Recettore per l’EGF pp60c-src

CD45

Thr & Tyr(Doppia specificità)

MAP kinasi kinasi AtDsPTP1

Meccanismi di Trasferimento dell’Informazione

Un cambiamento nello stato di attività di un componente a monte porta ad un cambiamento dell’attività di un componente a valle.

• Il cambiamento può essere attivante o inibente. Esso è interazione-specifico. (p.es. La fosforilazione del target può aumentarne o diminuirne l’attività)

Secondi MessaggeriSecondi Messaggeri

Tipicamente composti a basso peso molecolare prodotti all’interno della cellula da un enzima stimolato dal legame di un ligando a un recettore

Adenilato Ciclasi

GTP

ATPAMP ciclico

2Pi

Attiva la Protein Kinasi A

Attivata dalla subunità

di Gs

Fosfolipasi C

PIP2

PLC

IP3

DAG

Attivata da recettori legati a Gq

Attiva la Protein Kinasi C

Induce un aumento del Ca2+

citosolico

Membranaplasmatica

PIP2 – fosfatidilinositolo difosfatoIP3 – inositolo trifosfatoDAG - diacilglicerolo

In entrambi questi sistemi il legame di un singolo ligando ad un recettore produrrà un gran numero di molecole di secondo

messaggero

- AMPLIFICAZIONEAMPLIFICAZIONE - un ruolo chiave per i secondi messaggeri

Amplificazione

1 recettore attiva più proteine G

Ciascun enzima X produce molti

secondi messaggeri,

ciascun messaggero attiva

1 enzima Y

AMPLIFICAZIONE

AMPLIFICAZIONE

AMPLIFICAZIONE

AMPLIFICAZIONE

AMPc

Kinasi A

Enzima Z

Prodotti dell’enzima Z

proteina recettoreuna molecola

di ligando

subunità di Gs

Adenilato ciclasi attivata

Ciascuna kinasi A può fosforilare e attivare

molte copie di enzima Z

Ciascuna copia di enzima Z produce molte

molecole di prodotto

1recettore-ligando

500 Proteine G

500enzimi

105

2ndi messaggeri

250canali ionici

105-107

ioni

Una molecola di rodopsina assorbe un fotone

Sono attivate 500 molecole di trasducina

Sono attivate 500 molecole di fosfodiesterasi

Sono idrolizzate 105 molecole di GMPc

250 canali del Na vengono chiusi

Viene prevenuto l’ingresso nella cellula di 106-107 ioni Na per secondo per circa un secondo

La membrana dei bastoncelli è iperpolarizzata di 1 mV

Calcio – il messaggero universaleCalcio – il messaggero universale

Il Ca2+ è mantenuto ad una concentrazione estremamente bassa nel citosol (a causa della sua tossicità), tuttavia la concentrazione del Ca2+ è alta fuori dalla cellula e all’interno di alcuni organelli

L’apertura rapida e transitoria di canali permette al Ca2+ di fluire nel citosol seguendo il suo gradiente di concentrazione e costituisce la base di un sistema di signalling ubiquitario

PLCDAG

PKC

Calcio – il messaggero universaleCalcio – il messaggero universale

kinasi

L’IP3 si lega al recettore per l’IP3 sul reticolo

endoplasmatico e apre un canale del Ca2+ (che fa

parte del recettore)

L’attivazione della PLC porta alla formazione di IP3 solubile in

acqua

Il Ca2+ rilasciato dal RE si lega alle Calmoduline

permettendole di interagire con altre proteine e attivarle

La Calmodulina può attivare pompe del Ca2+ del reticolo endoplasmatico abbassando la [Ca2+] citosolico

La Calmodulina può attivare pompe del Ca2+

sulla membrana plasmatica abbassando la

[Ca2+] citosolico

La Calmodulina attiva una vasta gamma di proteine, p.es. kinasi calmodulina-dipendenti

Vie o Networks Generalmente le vie coinvolgono una serie di reazioni a cascata che portano ad un flusso lineare dell’informazione

Esempi di vie

1) Vie delle Proteine G2) Via di Ras–MAPK

I networks (reti) sorgono da interazioni in cui un componente di una via regola l’attività di una seconda via

La via Gq-PLC-

rasrafras

GTP

Risposta

Cascata delle MAP chinasi

L’attivazione di ras da parte della CaMKII attiva la via delle MAP chinasi

Chinasi a cascataChinasi a cascata

CaMKIIIl Ca2+ si lega alle

calmoduline

La Calmodulina attiva una vasta gamma di proteine, p.es la kinasi II

calmodulina-dipendenti

Meccanismi a feedback, feedforward e cross-talk

A volte, molecole non direttamente coinvolte in una reazione enzimatica possono interagire allostericamente con l’enzima stesso alterando la conformazione dell’enzima e quindi la sua velocità di reazione.

Quando sono gli stessi substrato o prodotto dell’enzima ad interagire allostericamente con esso, essi possono mediare interazioni a feedback o a feedforward con la via metabolica in cui è coinvolto l’enzima, oppure mediare un cross-talk tra vie metaboliche parallele.

(A) Feedback negativo in un semplice schema di reazione lineare. Il metabolita X è trasformato in Y, a sua volta trasformato nel prodotto Z. Z inibisce l’enzima E1 che catalizza la reazione XY.

(B) Feedback positivo in un semplice schema di reazione lineare. Il metabolita X è trasformato in Y, a sua volta trasformato nel prodotto Z. Z stimolsa l’enzima E1 che catalizza la reazione XY.

Meccanismi a feedback

In una interazione a feedback, il prodotto di una reazione enzimatica influenza l’attività di un altro enzima che lo precede nella via metabolica.

Feedforward in uno schema di reazione lineare. Il metabolita X è trasformato in Y, a sua volta trasformato nel prodotto Z. X stimola l’enzima E2 che catalizza la reazione YZ.

Meccanismi a feedforward

In una interazione a feedforward, il prodotto di una reazione enzimatica influenza l’attività di un altro enzima che lo segue nella via metabolica.

Reti di signaling e comunicazione incrociata (cross-talk)

Una ipotetica rete di signaling. La rete consiste in sei recettori e tre protein kinasi citosoliche. Ciascun recettore attiva (frecce verdi) o inibisce (linea nera) la kinasi 1 o la 2 o entrambe con un meccanismo non specificato. Poichè i segnali convergono sulla kinasi 3 (la kinasi di output), questa rete si attiverà massimalmente solo quando saranno presenti combinazioni specifiche di stimoli extracellulari.

molecole della matrice fattori di crescita

kinasi 1 kinasi 2

kinasi 3

Nel cross-talk il metabolita di una via influenza l’attività dell’enzima di un’altra via.

Segnali multipli – ‘Crosstalk’ di recettoriSegnali multipli – ‘Crosstalk’ di recettori

Immaginate che una cellula riceva due segnali. Il segnale A inibisce la proliferazione, mentre il segnale B stimola la proliferazione…

A B

chinasiIl segnale A attiva una chinasi…

…che fosforila e inattiva il recettore per il segnale B -

risultato – nessuna proliferazione

Se il ‘crosstalk’ lavora solo in una direzione (ad es. da A a B) allora il segnale A sarà dominanteSe il ‘crosstalk’ lavora in entrambe le direzioni, ciò che accadrà dipenderà da diversi fattori p.es.

Timing della percezione del segnaleDensità relativa dei recettori

Ampiezza relativa del segnale

-

Un crosstalk tra vie del signaling neuronale può influenzare cambiamenti sinaptici indotti da stimoli

B (basale) stabile

T (soglia) metastabile

A (attivo) stabile

MAPK vs PKC

PKC vs MAPK

• Il punto A rappresenta uno stato di attività alta sia per la PKC che per la MAPK, mentre il punto B rappresenta uno stato di bassa attività.

• Entrambi i punti rappresentano livelli diversi di stati stazionari. Un sistema dI questo tipo è definito bistabile.

• Il punto di biforcazione T è importante perché definisce la soglia di biforcazione.• Con A viene innescato un loop a feedback positivo che diventa indipendente

dall’attivazione del recettore.

In particolare, la capacità della PKC di regolare la MAPK e della MAPK di regolare la PKC porta ad una interazione tra le due vie (feedback pos.)

• Quasi tutte le isoforme di adenilato ciclasi (AC) sono regolate dalla via della PLC.

• L’AC è intimamente associata a siti di ingresso del Ca2+ nella cellula.

• Oscillazioni nei livelli di AMPc intracellulare insorgono a causa di una inibizione a feedback dell’AC Ca2+-dipendente.

• Quindi il signalling dell’AMPc si interseca con il Ca2+ intracellulare ed estende le sue modalità di regolazione.

Feedback negativo ed oscillazioni

Feedback negativo ed oscillazioniIl modello mette in relazione i livelli di AMPc e l’ingresso di Ca2+. L’AMPc attiva canali del Ca2+ (Y). L’ingresso di Ca2+ aumenta. Il Ca2+ intracellulare inibisce l’adenilato ciclasi (AC). L’effetto complessivo è un loop a feedback negativo in cui l’AMPc inibisce la sua stessa produzione.

Oscillazioni nell’AMPc e nel Ca2+ sono sostenute dal loop a feedback negativo.

cAMPAMP)PDE(b

)AC(a

intf

eext CaCa

22

Od

c

C YY

*ACACg

h

Feedback positivo

Problema: come può essere immagazzinata informazione, ad es. nel sistema nervoso, partendo da molecole instabili?

Consideriamo ad es. il processo di fosforilazione come un meccanismo diimmagazzinamento di informazione.

• La fosforilazione è un meccanismo comune per attivare/disattivare enzimi.

• Supponiamo che un bit di informazione sia stato immagazzinato in un neurone in seguito alla fosforilazione di un enzima chiave attivandolo.

• In assenza di una fosfatasi defosforilante lo stato acceso (“on”) dell’enzima potrebbe durare a lungo.

In assenza di una fosfatasi defosforilante lo stato acceso (“on”) dell’enzima potrebbe durare a lungo.

Difficoltà: In realtà, l’emivita della proteina fosforilata è limitata e quindi anche lo stato “on” dell’enzima.

Quesito centraleÈ possibile costruire interruttori molecolari stabili?

Secondo questo articolo è possibile costruire interruttori molecolari in grado di immagazzinare informazione indefinitamente, utilizzando reazioni enzimatiche ben note e in maniera estremamente semplice.

Reazioni in un interruttore bistabile.

• L’interruttore è costituito da due proteine: la kinasi-1, che può esistere in uno stato inattivo (K1) o in uno stato attivo (K*

1p), e una fosfatasi.

• La transizione tra gli stati inattivo e attivo è dovuta a una reazione di fosforilazione.• La fosforilazione può essere catalizzata dalla kinasi-1 attiva (feedback positivo) • o dalla kinasi-2 attivata durante una stimolazione neuronale.

Interruttori molecolari bistabili

In assenza di attività della Kinasi-2, l’interruttore è descritto da quattro equazioni:

Eq. 1 stabilisce che la derivata prima della concentrazione della Kinasi-1 attiva dK*1p/dt, è la differenza tra le velocità di reazione della kinasi e della fosfatasi.

Eq. 2 è la legge di conservazione per la kinasi-1, dove T è la somma della kinasi-1 attiva e inattiva.

Eq. 3 descrive le reazioni della Eq. 1 in termini di cinetiche di Michaelis-Menten, dove Km1 e Km2 sono le costanti di Michaelis per la kinasi-1 e la fosfatasi, rispettivamente; C1 e C2 sono i numeri di turnover della kinasi-1 e della fosfatasi, rispettivamente, e P è la concentrazione della fosfatasi.

Eq. 4 è ottenuta sostituendo l’eq.2 nella 3.

• In assenza di kinasi-1 fosforilata, la velocità di reazione della fosfatasi è zero.

• All’aumentare di K*1p, la velocità di reazione della fosfatasi aumenta fino alla saturazione.

• La velocità della reazione della kinasi-1 aumenta all’aumentare di K*1p, ma la velocità decresce nuovamente per concentrazioni elevate di K*1p perchè vi è poca proteina non fosforilata da fosforilare.

Ve

loci

tà (

mo

li/l·

10-8/s

)

Fosfatasi

Kinasi

Le velocità di reazione della kinasi-1 e della fosfatasi dipendono dalla frazione di kinasi-1 attiva

Velocità (M/s) delle reazioni della kinasi-1 (termine di sinistra nell’Eq. 4) e della fosfatasi (termine di destra nell’Eq. 4) in funzione della frazione dei kinasi-1 attiva (K*

1p/T).

Grafico della derivata di K*1p (Eq. 4) rispetto al tempo in funzione di K*1p/T.

La derivata prima rispetto al tempo della concentrazione di kinasi-1 attiva (dK*pl/dt) è la differenza tra le velocità delle reazioni della kinasi e della fosfatasi.Allo stato stazionario (equilibrio) sara:

Affinchè uno stato sia stabile, deve essere dK*1p/dt = 0 e d2K*1p/dt2 deve essere negativa. Questa seconda condizione è richiesta affinchè una piccola deviazione da uno stato stabile sia seguita da un ritorno spontaneo a quello stato.

In questo esempio i criteri di stabilità sono incontrati in due punti: K*1p/T = 0 e K*1p/T 0.74, mentre K*1p/T 0.22 rappresenta uno stato instabile.

Stati stabili

stato instabileK*1p/T0.22

I punti in corrispondenza di K*1p/T = 0 e di K*1p /T 0.74 rappresentano gli stati stabili.Ad esempio:• se K*1p /T > 0 ma < 0.22, dK*1p/dt è negativa e K*1p ritornerà velocemente a zero;• se K*1p/T > 0.22 ma < 0.74, dK*1p/dt è positiva e K*1p/T aumenterà a 0.74,• se K*1p/T diventa > 0.74, dK*1p/dt è negativa e K*1p/T scenderà verso 0.74.

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

-5

0

5

dK1p

/dt

& d

2 K1p

/dt2

[K1p

]/[T]

dK*1p/dt

d2K*1p/dt2

Affinchè un punto di equilibrio sia stabile, deve essere:

dK*1p/dt = 0 e

d2K*1p/dt2 <0

In questo esempio i criteri di stabilità sono incontrati nei due punti: K*1p/T = 0 e K*1p/T 0.74, mentre K*1p/T 0.22 rappresenta un punto di equilibrio instabile

0.22 0.74

Tempo (s)

[K1

p*]

/T

0.74

0.22

0

Le curve convergono verso i due punti stabili K*1p/T = 0 e K*1p/T = 0.74 a seconda che la concentrazione iniziale (normalizzata) di K*1p sia rispettivamente minore o maggiore di 0.22, che rappresenta il punto di equilibrio instabile.

stato stabile (fosforil.)

stato stabile (defosforil.)

stato instabile

Soluzioni dell’equazione differenziale:

per diverse concentrazioni iniziali di K1p*

Effetto della stimolazione sull’interruttoreStimoli di diversa ampiezza attivano la kinasi-2 in modo graduale.

L’interruttore può essere acceso permanentemente da uno stimolo esterno

Kinasi

Fosfatasi

Stimolo

Funzione neuronale

K*1p/T

K*2 (nM)

Tempo

L’attivazione risultante della kinasi-1 è anch’essa graduale finchè la sua attivazione diviene rigenerativa. Da quel momento, l’attività della kinasi-1 rimane alta anche quando lo stimolo verrà rimosso.

Meccanismo molecolare del potenziamento a lungo termine

Spina

Ramo di un dendrite

Assone

Terminalepresinaptico

TerminalepostsinapticoSinapsi

PSD

La “densità postsinaptica o “postsynaptic density” (PSD) è una zona specializzata densa di proteine attaccate al lato citosolico della membrana postsinaptica.

• La PSD, caratteristica delle sinapsi eccitatorie del SNC, consiste di recettori ionotropici, proteine di sostegno e del citoscheletro, e molecole di signaling.

• Tali proteine creano un microdominio di signaling, che traduce inputs presinaptici in risposte postsinaptiche.

• Due sottotipi di recettori glutamatergici, AMPA ed NMDA, mediano la la trasmissione eccitatoria rapida.

Trasmissione Sinaptica

AM

PA

R

AM

PA

R

Po

ten

zial

e d

’azi

on

e

Po

ten

zial

e d

’azi

on

e

Glutamato

Potenziamento

Glutamato

AM

PA

R

AM

PA

R

NM

DA

R

NM

DA

R

Na+ Na+ Ca++

Mg++

NM

DA

R

NM

DA

R

Mg++

I recettori AMPA forniscono la depolarizzazione della membrana postsinaptica, che a sua volta aiuta l’apertura dei recettori NMDA a generare l’ingresso di Ca2+ che innesca cascate di signaling.

Long-term potentiation (LTP): un aumento della forza sinaptica

Tempo (min)0 60

Cor

rent

e po

stsi

mna

ptic

a

Protocollo di LTP che induce un ingresso postsinaptico di Ca2+

Bliss & Lomo J Physiol, 1973

Il potenziamento a lungo termine o LTP è una forma sinapsi-specifica di plasticità che potrebbe essere correlata ad alcuni tipi di memoria.

Long-term potentiation (LTP): un aumento della forza sinaptica

Protocollo di LTP che induce un ingresso postsinaptico di Ca2+

Tempo (min)0 60

Cor

rent

e po

stsi

mna

ptic

a

con un inibitore della CaMKII non c’è LTP

Lledo et al PNAS 1995, Giese et al Science 1998

*CaMKII a bassa attività: Potenziamento precoce (memoria a breve termine?)

Le CaMKII attivate agiscono su proteine preesistenti in attesa di essere attivate. Ad es., fosforilazione di recettori AMPA risposta postsinaptica più intensa a parità di glutammato liberato

AMPAR

fosforilazione

Processi di rilascio

*CaMKII

NMDAR Ca++

**CaMKII LTP

** CaMKII ad alta attività: Potenziamento tardivo (memoria a lungo termine?)

Premessa

La CaMKII è localizzata nella PSD ed è richiesta per l’induzione di LTP

La protein kinasi II Ca2+/calmodulina-dipendene (CaMKII) localizzata nella PSD è in una posizione ideale per giocare un ruolo chiave nell’LTP, essendo virtualmente in grado di indurre i processi a valle che potenziano la trasmissione sinaptica.

• L’ingresso transiente di Ca2+ attraverso canali NMDA, che avviene durante l’induzione dell’LTP, stimola l’autofosforilazione persistente e l’attivazione della CaMKII.

• L’attivazione persistente della CaMKII suggerisce che essa possa agire come un interruttore bistabile responsabile del rafforzamento tutto-o-nulla delle singole sinapsi.

Obiettivo

Comprendere il meccanismo di accensione della CaMKII e, in particolare, come la CaMKII possa rimanere in uno stato altamente fosforilato nonostante l’attività delle fosfatasi endogene.

La CaMKII è una proteina multimerica in cui l’oloenzima è costituito da 8 a 12 subunità, ciascuna delle quali ha un’attività kinasica.

Ciascuna subunità è fosforilabile e il sito di fosforilazione è rappresentato dalla Thr286.

La defosforilazione della CaMKII avviene per azione specifica della PP1 trattenuta nel PSD da proteine strutturali.

Un oloenzima = 8/12 subunità

Protein Kinasi II Calmodulina-dipendente

CATALiTICAAUTO-INIBITORIA

CaM ASSOCIAZIONEALLE SUBUNITA’

COOHH2N

Un dominio autoinibitorio occupa e blocca il sito catalitico.

La Ca2+/calmodulina rimuove il dominio autoinibitorio dal sito catalitico causando fosforilazione e attivazione.

Gli oloenzimi di CaMKII formano una struttura ad anello. Negli oloenzimi di CaMKII, le subunità si assemblano in due anelli coplanari, ciascuno contenente 4/6 subunità. In queste strutture ad anello si realizza l’autofosforilazione mediante un processo in cui una subunità fosforila quella accanto.

Meccanismi di bistabilitè del sistema CaMKII/PP1 nel PSD

La CaMKII può trovarsi quindi in uno stato attivato (“on”) nel quale la maggior parte delle 8/12 subunità sono fosforilate a livello della Thr286 e in uno stato disattivato (“off”) nel quale esse sono quasi completamente defosforilate.

Come fa un gruppo di molecole CaMKII e PP1 nella PSD ad operare come un interruttore che presenta due diversi stati stabili a concentrazioni basali di Ca2+ intracellulare?

L’operazione di attivazione è basata su tre reazioni che possono avvenire ai livelli basali di Ca2+.

Stato “off” Stato “on”

(1) Se nessun sito Thr286 in un anello è fosforilato, la prima autofosforilazione richiede il legame di due molecole di Ca2+/calmodulina: una per attivare la subunità catalitica della CaMKII, e l’altra per esporre la Thr286 della subunità adiacente che funge da substrato.

v1 = velocità di inizio dell’autofosforilazione per sito (subunità)

k1 = costante di velocità dello step di autofosforilazione elementare

KH1 = [Ca2+]50 per l’attivazione della CaMKII (0.7 μM, Kuret and Schulman, 1984)

[Ca2+]i a riposo (100 nM) << KH1 l’inizio procederà lentamente alla [Ca2+] di riposo.

C= complesso Ca2+-calmodulina Po=oloenzima non fosforilatoP1=oloenz. fosforil. una volta

Po PoC PoC2 P1C2

(1)

Pertanto, la velocità di autofosforilazione per sito, v1. dipenderà dalla seconda potenza della [Ca2+/calmodulina], che a sua volta dipende dalla quarta potenza della [Ca2+]:

Pertanto, la velocità di autofosforilazione per sito, v2, della CaMKII parzialmente fosforilata sarà superiore a v1, in quanto dipenderà solo dalla quarta potenza della [Ca2+]:

(2)

0.E+00

2.E-07

4.E-07

6.E-07

0 0.04 0.08 0.12

[Ca] (microM

velo

cità

di a

uto

fosf

ori

lazi

on

e

v1

v2

(2) Invece, una volta che una o più subunità sono fosforilate, la velocità di fosforilazione della Thr286 diventerà molto più rapida, nonostante la bassa [Ca2+]in, dal momento che è richiesta solo una molecola di Ca2+/calmodulina per esporre la Thr286 della subunità che funge da substrato.

P1 P1C P2

Quindi, il compartimento biochimico di rilievo è il volume della PSD all’interno del quale la concentrazione delle subunità della CaMKII è 100–200 μM.

Se vi è un numero significativamente elevato di subunità fosforilate della CaMKII, la loro concentrazione sarà molto più alta della KM della fosfatasi (1 μM), e vi sarà saturazione della fosfatasi.

(3) I siti della Thr286 della CaMKII vengono defosforilati ad opera esclusivamente della PP1 tenuta nel PSD da proteine di sostegno: il contributo delle altre fosfatasi è minimo in quanto non sono in grado di funzionare nella PSD.

La defosforilazione delle subunità procede secondo lo schema di Michaelis-Menten:

SP = subunità fosforilataS = subunità defosforilataE = fosfatasi

(3)

Pertanto, la velocità di defosforilazione per sito della CaMKII parzialmente fosforilata, v3, sarà:

k2 = costante catalitica della PP1

KM = costante di MM

ep = concentrazione di PP1 attiva*

Pi = concentrazione dell’oloenzima fosforilato i-volte.

Interpretazione intuitiva di come questo sistema chimico può operare da interruttore

• Quando gli oloenzimi CaMKII sono pochissimo fosforilati, la velocità alla quale i siti disponibili diventano autofosforilati è bassa perchè la reazione (1) è lenta.

• Al contrario, la PP1 può rapidamente defosforilare ogni sito fosforilato poichè essa non è saturata (vi sono pochi siti sui quali la PP1 deve intervenire).

• Lo stato “off” è pertanto stabile poichè la velocità di autofosforilazione della CaMKII per sito è bassa rispetto alla velocità della fosfatasi per sito.

• Questa situazione è ribaltata nello stato “on”.

• In questo caso, la reazione della CaMKII è più veloce (essendo richiesta solo una calmodulina per la reazione (2).

• D’altro canto, l’alta concentrazione di subunità fosforilate satura la fosfatasi, e la velocità alla quale essa può defosforilare le varie subunità è pertanto bassa.

• Lo stato “on” è quindi stabile essendo la velocità di autofosforilazione della CaMKII per sito alta rispetto alla velocità della fosfatasi per sito.

La simulazione mette in evidenza l’esistenza di un sistema bistabile a [Ca2+]in basali che dipende dalle proprietà della fosfatasi presente nel PSD

Vi sono due livelli stabili (punti neri) di fosforilazione a [Ca2+]in basali (linea verticale). Il sistema è bistabile in un ampio intervallo di [Ca2+]in (area ombreggiata).

Il punto rosso indica la percentuale totale di siti di Thr286 fosforilati dopo che il 20% dell’oloenzima della CaMKII nello stato “on” altamente fosforilato è stato rimpiazzato da oloenzimi non fosforilati. Tale perturbazione non è sufficiente a spingere il sistema nello stato “off”.

Il passaggio del sistema allo stato “off” richiederebbe che la fosforilazione precipitasse al di sotto del livello marcato con il punto giallo (punto di equilibrio instabile).

Allo stato stazionario, il livello di fosforilazione delle Thr286 varia con la concentrazione intracellulare di Ca2+.

NOTA BENE: La CaMKII nella PSD può essere defosforilata solo dalla PP1.

Un aumento della [Ca2+]in aumenta la frequenza di autofosforilazione.

Se la [Ca2+]in è quella basale (bassa), il grado di fosforilazione allo stato stazionario della CaMKII è basso (cerchio nero nel grafico).

Successivamente, un ingresso di Ca2+, causato ad es. da stimolazione elettrica, può muovere transitoriamente la [Ca2+]in verso destra, a valori molto più elevati.

Se la [Ca2+]in rimane per un certo tempo elevata, a destra della regione grigia, l’autofosforilazione farà saltare stabilmente l’attività della CaMKII da un livello basso ad uno alto (cerchio nero nel grafico).

Successivamente, quando la [Ca2+]in ritorna a livelli basali, lo stato della CaMKII si riduce, muovendosi verso sinistra. Ma l’attività della CaMKII permane comunque ad un livello alto, con sostenuta autofosforilazione.

Un aumento della [Ca2+] aumenta la frequenza di autofosforilazione.

FINE