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Seconda Università di Napoli

II° Anno II° Semestre A.A. 2012/2013 Sbobinatura Patologia Generale Prof. Castoria

Gruppo di studio “La Sbobba”

A cura di dodo e Ely24e

1) Aspetti Molecolari della Cellula Neoplastica Pag. 2

2) Regolazione e Deregolazione del Ciclo Cellulare Oncogeni e Oncosoppressori Pag. 20

3) Oncogeni e Oncosoppressori Invasività e Metastasi Pag. 33

4) Metastasi Risposta al Danno Pag. 49

5) Risposta al Danno Necrosi Pag. 63

6) Infiammazione Acuta e Cronica Pag. 80

7) Chemiotassi Fagocitosi e Degranulazione Mediatori Chimici dell'Infiammazione Pag. 97

8) Mediatori Chimici Infiammazione Cronica Pag. 112

9) Infiammazione Cronica Aspetti Caratteristici ella Guarigione di una Ferita Pag. 128

1scaricato da www.sunhope.it

Castoria 1.1 (Giovedì 11 Aprile 2013)

Aspetti Molecolari della Cellula Neoplastica

Il termine neoplasia significa nuova crescita, nuova formazione, il termine tumore deriva dal latino tumor che significa tumefazione, esistono dei tumori maligni e dei tumori benigni e che questi tumori hanno delle caratteristiche fenotipiche diverse perché i tumori benigni hanno una crescita espansiva i tumori maligni hanno una crescita infiltrativa e quindi tendono ad invadere i tessuti circostanti e a dare delle metastasi. Dal punto di vista più specifico quali sono le caratteristiche di una cellula neoplastica? Poi vedremo successivamente quali sono i meccanismi molecolari che sono alla base di queste caratteristiche, l‘autosufficienza rispetto ai segnali di crescita e cosa significa questo? Che alcune cellule neoplastiche secernano esse stesse dei fattori di crescita per es. fattori di crescita che sono simili a Tgf e uno di questo è proprio un oncogene che si chiama Sis, un’altra caratteristica è l’insensibilità di queste cellule a dei segnali che si oppongono alla crescita quindi a dei segnali antiproliferativi ancora l’evasione rispetto all’apoptosi infatti le cellule neoplastiche non crescono illimitatamente ma sopravvivono in condizioni ambientali sfavorevoli quindi quello che è forzato nella cellula neoplastica è il fenotipo della sopravvivenza. Altra caratteristica è che queste cellule riescono ad invadere i tessuti circostanti e dare metastasi a distanza, un’altra caratteristica è l’angiogenesi sostenuta di queste formazioni neoplastiche quindi si hanno dei processi di neoangiogenesi e poi ancora un potenziale replicativo che non ha limite per questo si parla molto spesso dell’immortalità della cellula neoplastica. Quando si parla dell’immortalità di una cellula il primo concetto che questa cosa rinvia è il concetto del tempo della cellula ovviamente non si può fare altro che parlare della regolazione del ciclo cellulare in una cellula neoplastica. Nella maggior parte della cellule neoplastiche cambia completamente il ciclo cellulare quindi si ha una deregolazione del ciclo e generalmente quello che cambia è la durata quindi il tempo che questa cellula impiega per poter duplicare, la maggior parte delle fasi del ciclo nelle cellule neoplastiche sono accorciate e soprattutto quello che risulta accorciata è la fase più importante del ciclo che è la fase G1, S.


Vediamo come viene deregolato il ciclo e come viene deregolato il tempo della cellula neoplastica. Il ciclo cellulare è caratterizzato da una serie di fasi in cui le cellule duplicano in due cellule figlie che sono perfettamente uguali alla cellula progenitrice durante il ciclo cellulare si ha una fase G1, una fase S di duplicazione del DNA, una fase G2 che è una fase di preparazione alla mitosi e quindi alla duplicazione vera e propria della cellula. Come viene controllato questo ciclo cellulare? La parola stessa Ciclo fa pensare a qualcosa che oscilla nel tempo e queste oscillazioni sono dovute ad alcune proteine chiave che sono le Cicline, le cicline sono degli oloenzimi costituiti da una parte regolatoria che sono le cicline D , E , A, B e una porzione catalitica che è formata dalle chinasi associate a queste cicline. Quali possono essere queste associazioni e quali sono le cicline che caratterizzano le varie fasi del ciclo? La fase G1 è caratterizzata prevalentemente dalla presenza di questi complessi ciclina D/cdk4 o 6, la fase G1/S è caratterizzata nella fase tardiva G1 fino alla fase S trovate il complesso ciclina E/cdk2, durante la fase S avete il complesso ciclina A/cdk2 e durante la fase M il complesso ciclina B/cdk1. Come cambia questo ciclo? Il ciclo cambia a seconda del tipo della cellula, generalmente la fase G1 ha una durata di 10h, la fase S di 7.30h, la fase G2 di 3h, la più breve è la fase M di 1h, che cosa è cambia nei tumori? Cambia proprio la fase G1. Da che cosa è caratterizzata da questa fase G1 e come viene regolato il ciclo? Il ciclo viene regolato non solo da marcatori positivi che sono le cicline e le chinasi ad esse associate ma viene regolato anche da inibitori del ciclo che sono di due classi fondamentali cioè gli inibitori della famiglia Ink che vanno a inibire direttamente l’attività catalitica delle chinasi associate alle cicline e vanno a inibire i complessi cdk4, cdk6, cicline D1, ciclina D2, ciclina D3, che sono di varie isoforme di cicline che potete trovare e che vengono espresse differenzialmente nei vari tessuti cellulari e nei vari tumori. Esiste un’altra famiglia di inibitori che non sono inibitori puri perché non vanno a legarsi alle chinasi associate alle cicline ma si vanno a legare al complesso quindi si vanno a legare alle chinasi associate alle cicline e questi sono P21, P27, P57 che inibiscono i complessi ciclina E/cdk2 o ciclina A/cdk2. Nei tumori umani possono essere alterati sia i marcatori positivi del ciclo


cellulare che gli inibitori del ciclo quindi alla fine si ha una deregolazione del ciclo. Quale è la fase più importante del ciclo? E’ la fase G1 e nelle cellule tumorali i cambiamenti avvengono proprio in questa fase, la fase G1 è l'intervallo in cui le cellule rispondono ai stimoli extracellulari e decidono se duplicare il DNA e dividersi o se entrare in uno stato di quiescenza, quindi se voi avete una cellula arrestata e somministrate un fattore di crescita, un mitogeno, un ormone questa cellula incomincia a intraprendere questa fase del ciclo e decide se essere commissionata o meno verso la duplicazione cellulare, questa decisione come viene chiamata? Viene chiamata PUNTO DI RESTRIZIONE, il punto di restrizione è quel momento in cui la cellula che è sottoposta a uno stimolo mitogeno decide di duplicarsi, questo vuol dire che quando la cellula ha superato questo punto di restrizione si possono togliere anche tutti i nutrienti dall’ambiente cellulare ma la cellula è commissionata verso la duplicazione, più o meno la stessa cosa avviene durante l’apoptosi quando la cellula decide di ingaggiare il programma di suicidio. Quando la cellula viene stimolata con un fattore di crescita si ha una fase G1 precoce in cui comincia ad aumentare il citoplasma, i mitocondri incominciano a dividersi, si ha un elevato metabolismo cellulare fino a che la cellula raggiunge questo punto di restrizione, in genere verso la 6-7 ora dalla stimolazione con un fattore di crescita, poi superato questo punto di restrizione si ha una fase tardiva di G1 in cui il citoplasma aumenta ancora, i mitocondri ancora si dividono e la cellula è commissionata alla divisione e comincia la fase di duplicazione del DNA, la cellula si prepara durante questa fase alla duplicazione del DNA fino ad avere la fase S. Questo punto di restrizione è importante perché i farmaci antitumorali che si usano in medicina molto spesso falliscono perché la cellula neoplastica ha alterato proprio questo punto di restrizione, la cellula neoplastica decide molto più facilmente rispetto alle cellule normale se raggiungere questo punto di restrizione e se si somministra un farmaco antineoplastico mentre la cellula ha già passato questo punto di restrizione il farmaco non funziona, questo è il motivo perchè molte terapie antineoplastiche non riescono a funzionare sulle cellule. Da chi viene controllato questo punto di restrizione? Il punto di restrizione viene controllato dalla ciclina D, da un esperimento fatto anni fa fu


dimostrato attraverso la micro inezione delle cellule di anticorpi anticiclina D che quando la cellule venivano stimolate con un fattore di crescita e veniva micro iniettato un anticorpo che blocca la ciclina Dl e cellule non riuscivano ad arrivare al punto di restrizione e quindi non potevano duplicare il DNA e non potevano entrare nella nella fase S. Quindi fu dimostrato che la ciclina D è indispensabile perchè la cellula raggiunga il punto di restrizione, quindi nei tumori umani se è alterato la ciclina D, come spesso accade, si ha come effetto finale il fatto che la cellula riesce a duplicarsi molto più facilmente rispetto a una cellula normale. Che cosa succede quando si ha un segnale mitogeno? Succede che aumentano i livelli di ciclina D e delle chinasi associate alla ciclina D come conseguenza nella fase successiva si ha l’elevazione del complesso ciclina E/cdk2 e il substrato di questo complesso è una proteina importantissima che è RB o proteina del retinoblastoma, e quando questa proteina RB che è un antioncogene viene fosforilata da parte delle chinasi ciclino dipendenti e soprattutto dal complesso ciclina E/cdk2 succede che Rb rilascia un fattore di trascrizione E2F che è libero di funzionare e va ad attivare a livello trascrizionale la sintesi di geni coinvolti nella duplicazione del DNA e attiva l’espressione di altre cicline come la ciclina A e di altri geni coinvolti nel controllo della fase S. Quindi questa è la cascata di eventi: segnale mitogeno, stimolazione del complesso ciclina D/cdk4, incremento del complesso ciclina di E/cdk2, questi complessi fosforilano Rb che quando è fosforilato si stacca da E2F (fattore di trascrizione) il quale viene liberato che va ad agire sulla sintesi di geni che controllano la duplicazione del DNA o anche di altri geni come ad es. la ciclina quindi in questa maniera avviene il controllo del punto di restrizione. Come viene modulato questo ciclo cellulare? Come fanno i segnali esterni a modulare positivamente il ciclo cellulare? I segnali esterni sono segnali solubili cioè fattori di crescita o ormoni ma possono essere anche i segnali insolubili della matrice extracellulare, le proteine della matrice collagene, laminina, fibronectina sono in grado di dare alla cellula dei segnali che agiscono positivamente sul ciclo cellulare. Che cosa fanno in definitiva tutti e due questi tipi di segnali? Sia i segnali solubili che i segnali insolubili della matrice controllano il ciclo attraverso l’attivazione di vie che sono chiamate vie di trasduzione del


segnale. Un fattore di crescita è un fattore solubile, peptidico quindi idrofilico e non può attraversare la membrana plasmatica, (invece gli ormoni steroidei lo possono fare perchè solo liposolubili) quindi questo segnale ha bisogno di un recettore di membrana la maggior parte dei recettori per i fattori di crescita attivano delle cascate di trasduzione del segnale intracellulare e come lo fa? Il fattore di crescita si lega al dominio extracitoplasmatico di questi recettori con alta affinità, questi recettori sono costituiti da una porzione extracitoplasmatica destinata al legame con il rispettivo ligando, da uno stretch di amminoacidi idrofobici che consentono a questi recettori di ancorarsi alla membrana plasmatica, da una porzione intracitoplasmatica che è caratterizzata da un’attività tirosinico-kinasica, generalmente questi recettori per i fattori di crescita posseggono un’intrinseca attività di tirosina-kinasi e che cosa sono? La fosforilazione di una proteina può avvenire in serina, treonina e in tirosina, fino a qualche decennio fa si conoscevano la fosforilazione in serina e treonina, (la fosforilazione in tirosina era rarissima, per un errore di laboratorio fu scoperta questa fosforilazione in tirosina ma fu data una grossa importanza quando si vide che le cellula cancerose sottoposte ad analisi biochimiche mostrano elevati livelli di proteine fosforilate in tirosina quindi questo processo biochimico di fosforilazione in tirosina venne messo in relazione con il processo di trasformazione neoplastico). Quindi un fattore di crescita si lega a questo recettore, il recettore, che è presente sotto forma monomerica, dimerizza quindi si ha la formazione di un dimero, quando un recettore dimerizza sulla membrana plasmatica si ha un cambiamento conformazionale del recettore ed attraverso questo cambiamento conformazionale si autofosforila il recettore e si autofosforilano i residui di tirosina intracitoplasmatici, quindi il recettore risulta fosforilato in tirosina e perchè si autofosforila? Perchè possiede esso stesso un’intrinseca attività tirosino-kinasica, quindi questi sono recettori di membrana ad attività tirosino-kinasica che possono essere degli oncogeni. Questo recettore che si è autofosforilato in tirosina recluta attraverso queste tirosine fosforilate delle proteine che hanno dei domini SH2, SH sta per Sarc homology, Src è una tirosina chinasi è un proto-oncogene coinvolta nei processi di crescita normale e neoplastica delle cellule, questa tirosina chinasi che non è una


tirosina chinasi di membrana ma è una tirosina chinasi solubile (fu identificata per la prima volta questo dominio SH e si vide che in un grosso numero di molecole che intervengono nella trasduzione del segnale sono presenti questi domini SH e questi domini servono a riconoscere le tirosine fosforilate di un’altra molecola). Quindi accade che si ha un’interazione tra una proteina a monte che si autofosforila in tirosina, in questo caso il recettore, con un’altra proteina che contiene dei domini SH2 che può essere essa stessa un’altra chinasi in tirosina oppure può essere una proteina che viene detta scaffold, una proteina di ancoraggio, che fa da interfaccia perché magari con un dominio SH2 interagisce con la tirosina fosforilata di un recettore in questo caso il recettore dell’EGF e con un altro dominio diverso per es. SH3 interagisce con altre proteine che sono per es. ricche di prolina che consente queste interazioni, quindi queste molecole scaffold fanno da interfaccia per poter reclutare altre molecole della trasduzione del segnale sulle membrane plasmatiche. Quando il recettore per il fattore di crescita si autofosforila in tirosina questi siti di fosforilazione in tirosina vanno a interagire con i domini Sh2 di molecole scaffold o adattatori come Garb2, e succede che come conseguenza di queste interazioni queste molecole scaffold avvicinano una piccola proteina legante il GDP che è la proteina Ras a una membrana plasmatica e accade che Ras in presenza di scambiatori guaninici detti anche Gef viene attivata e quindi si ha la conversione di Ras-gdp che è inattivo in Ras-gtp che è attivo. Immediatamente dopo questo segnale si spegne e Ras cicla nella sua forma inattiva e idrolizza il gtp in gdp e ritorna alla condizione di base, tutto questo può essere alterato nei tumori umani e quando Ras si attiva incomincia a sua volta ad attivare una serie di chinasi che stanno a valle di Ras e queste sono Raft che è coinvolta nei melanomi, Mek che è coinvolta in moltissimi tumori umani, e infine le Map kinasi.Per Map kinasi si intende mitogen activated kinase, kinase perché sono diverse è una famiglia di chinasi Erk1, Erk2, Erk3, Erk4, Erk5 ma a queste famiglia di kinasi appartengono anche delle altre chinasi attivate dallo stress come per es. la P38 che è una chinasi che non fa proliferare la cellula ma la fa rispondere allo stress oppure una Jun kinasi. Queste chinasi cosa fanno? Soprattutto le


chinasi Erk1 e Erk2 una volta fosforilate traslocano nel compartimento nucleare dal citoplasma e nel compartimento nucleare vanno a funzionare sulla ciclina, ciclina D, ciclina E, attivando queste cicline oppure vanno ad inibire gli inibitori del ciclo cellulare naturalmente l’inibizione può essere a livello trascrizionale oppure può essere a livello di degradazione e sono molteplici i meccanismi con cui queste Map kinasi controllano il ciclo cellulare. Contemporaneamente accade che una volta il recettore si è autofosforilato in tirosina viene reclutata una fosfolipasi C gamma e quando viene reclutata la fosfolipasi C gamma viene rilasciato inositolotrifosfato (IP3) e DAG, il IP3 va a stimolare il rilascio del calcio da parte dei calcisomi, di queste strutture che servono ad immagazzinare il Ca per cui aumentano i livelli intracellulari di Ca, vengono attivati tutte le chinasi calcio dipendenti nella cellula, il DAG va ad attivare le protein chinasi C e quindi si vede come si amplifica questo segnale nella cellula, inoltre accade che questi eventi fosforilativi vanno ad agire sui fattori di trascrizione nucleari, e quali sono? Sono dei geni precoci Jun, FOS, Myc sono fattori trascrizione perché agiscono direttamente o indirettamente regolando positivamente o negativamente l’espressione genica. E che cosa fanno questi eventi di fosforilazione? Vanno ad agire positivamente sul ciclo cellulare. Ricordiamoci le tappe: 1) Fattore di crescita 2) Legame ai recettori dei fattori di crescita 3) Attivazione delle vie di traduzione del segnale, quindi attivazioni o di chinasi intracellulari o attivazione di piccole proteine leganti il GTP della famiglia RAS 4) Attivazione della cascata di chinasi dipendente da RAS 5) Infine il segnale arriva al nucleo, questa che abbiamo descritta, quindi, è la classificazione degli oncogeni, tutte queste proteine Fattori di crescita, Recettori, Molecole adattatrici, Chinasi in tirosina, Piccole proteine leganti il GTP, MAP chinasi, Raf, Mek e tutte queste vie di traduzione del segnale e i fattori di trascrizione nucleari possono essere alterati nei tumori umani e quando una di queste molecole viene alterata significa che la cellula tumorale si sgancia dal controllo esterno perché si può avere un attivazione costitutiva di un recettore e quindi il recettore può funzionare indipendentemente dal ligando, si può avere un attivazione costitutiva di RAS per cui RAS lega sempre GTP e quindi agisce sempre positivamente sul ciclo cellulare e lo forza oppure si può


avere alterazione delle MAP chinasi o di altre molecole che intervengono in questa trasduzione del segnale.Ma quali sono i meccanismi che regolano l’attività delle proteine della famiglia RAS? Prima di tutto sono tutte delle piccole proteine (piccole perché sono in opposizione alle proteine G eterotrimeriche che sono di membrana, presentano un elevato peso molecolare e che oscillano in forma attiva quando legano GTP o dalla forma attiva alla forma inattiva quando idrolizzano il GTP) che legano GTP e quasi tutte hanno un peso sui 21 mila, esistono vari membri di questa famiglia RAS quindi è un capostipite di una famiglia di piccole proteine che legano il GTP, queste proteine non sono solo coinvolte nei meccanismi di proliferazione e sopravvivenza delle cellule ma sono coinvolte anche nei processi di motilità cellulare quindi sono coinvolte nei processi di invasività e di metastasi, perché queste piccole proteine leganti il GTP regolano i cambiamenti citoscheletrici indispensabili per la migrazione delle cellule. Ma quali sono queste proteine? Sono la proteina RAS (mutata in molti tumori umani) la proteina RHO (Ras Homology) la proteina RAC di cui esistono varie isoforme differenzialmente espresse nei vari tessuti e la proteina CDC-42, queste sono le proteine più importanti di questa famiglia. Mutazioni di queste proteine sono state rinvenute nei tumori umani e soprattutto mutazioni di RAS e prevalentemente nei Tumori del Polmone, Tumori del Pancreas, Tumori dell’ovaio, ma moltissimo tumori umani presentano alterazioni o della proteina RAS o delle proteine che regolano l’attività di RAS e come viene regolata l’attività di queste piccole proteine leganti il GTP? Queste proteine sono generalmente associate nel citoplasma a degli inibitori e quando sono associate a questi inibitori non funzionano all’interno della cellula quindi sono in uno stato di quiescenza e quando arriva il segnale, che può essere un segnale di crescita o un ormone, anche l’insulina, oppure un segnale dalla matrice extra cellulare come la fibronectina e cosa accade? Accade che questi segnali vanno ad attivare degli scambiatori guaninici che si chiamano GEF (Guanine Exchange Factor) e che cosa fanno questi scambiatori guaninici? Favoriscono positivamente la formazione del GTP per cui quando arriva un segnale dalla cellula questi scambiatori (i più importanti VAV, TIAM-1) vengono attivati, e come vengono attivati? Vengono


generalmente fosforilati in tirosina e una volta attivati facilitano la formazione dei complessi leganti il GTP. Quindi si ha l’attivazione di queste piccole molecole. Cosa importante è che in molti tumori umani non è alterata l’attività di RAS ma sono alterati gli scambiatori guaninici per cui non è la mutazione delle piccole proteine leganti il GTP che induce l’eccessiva proliferazione cellulare ma una mutazione di questi scambiatori guaninici favorendo l’attivazione di queste piccole proteine leganti il GTP però questo nei tumori! In condizioni normali il segnale si spegne perché contemporaneamente vengono anche attivate dalla cellula delle “GTPasi activities protein” che vanno a favorire la conversione del GTP in GDP quindi del GTP in GDP per cui il ciclo si chiude e queste piccole proteine leganti il GTP si inattivano ritornando allo stato basale, per cui in condizioni normali si ha: segnale, dopo pochi minuti dal segnale ormonale (che può essere anche insulinico) si ha l’attivazione di queste piccole proteine leganti il GTP rapida transiente dopodichè si ha l’inattivazione e la conversione verso le forme inattive quindi forme leganti GDP avendo l’idrolisi del GTP e quindi il ritorno di queste molecole alla condizione basale però quando queste molecole sono attivate vanno ad attivare nella cellula una serie di chinasi che stanno a valle, attivando queste chinasi tra cui le map chinasi si ha la regolazione positiva del ciclo cellulare ma si possono avere anche altri tipi di risposta cellulare. Che cosa può succedere nei tumori ? Vi sono dei segnali extracellulari viene attivata Ras che a sua volta recluta Raf che è una serin treonin- kinasi che a sua volta recluta queste altre kinasi Mec1 Mec2 che attivano Erk1 e Erk2, Erk1 e Erk2 non solo vanno a controllare i fattori di trascrizione (myc, jun, fos) ma controllano positivamente il complesso ciclina D/cdk4 e controllano negativamente la p27. Come fanno queste due map chinasi a controllare positivamente la ciclina D? Perchè o ne inducono la fosforilazione e la stabilizzano (regolazione post trascrizionale) o perchè agiscono sull’rna messaggero perchè stabilizzano il messaggero o perchè agiscono sulla trascrizione della ciclina D a livello genico modulando positivamente la trascrizione del gene che codifica per la ciclina D, sono questi i meccanismi con cui le map chinasi controllano l’espressione di ciclina D quindi l’entrata in una


cellula in ciclo. Erk1 Erk2 controllano negativamente p27, che è un inibitore del ciclo, quindi lo inibiscono per cui il ciclo viene forzato e come fanno ad inibirlo? O perché ne inducono una fosforilazione che delocalizza p27 e lo porta dal compartimento nucleare a quello citoplasmatico per cui p27 non può esercitare più la sua funzione perché è delocalizzato in un altro compartimento o perché nel reprimere la trascrizione genica si ha una diminuzione della trascrizione di p27 o perchè si hanno delle fosforilazione di p27 che ne favoriscono la degradazione quindi i meccanismi possono essere molteplici ma l’effetto finale è quello di forzare il ciclo cellulare. Se avete delle mutazioni di Ras attivanti si ha che questa mutazione conferisce a Ras l’acquisizione di una funzione in più, Ras attivato in un singolo amminoacido può legare il Gtp e questo significa che quella via che dipende da Ras è costitutivamente attivata per cui avete una forzature continua del ciclo cellulare, dove si trovano le mutazioni che attivano Ras? Adenocarcinomi del pancreas, del colon, del polmone, leucemia mieloidi acute e questi sono alcuni dei tumori umani in cui si hanno delle mutazioni attivanti di Ras quindi per la sostituzione di un singolo amminoacido si hanno delle forme di Ras che negano il Gtp che non può essere idrolizzato per cui quella cellula si sgancia dai segnali esterni e non può essere controllata. Un’altra strada implicata nel controllo del ciclo cellulare è quella fosfatidilinositolo-3-chinasi (Pi3-chinasi) che sono degli enzimi coinvolti non solo nel controllo della proliferazione e della grandezza della cellula, il volume, quindi proprio la crescita cellulare che è una cosa diversa dalla proliferazione, è sintesi proteica, e quando si parla di crescita della cellula si parla di sintesi proteica e se la cellula non ha una certa grandezza non può dividersi non può andare incontro alla mitosi vera e propria; questi enzimi intervengono anche durante il differenziamento e controllano il processo della migrazione cellulare e i cambiamenti del citoscheletro associati alla migrazione cellulare, i processi differenziativi sono dovuti a dei processi di migrazione delle cellule che si muovono durante l’embriogenesi sotto forma di foglietti. Questi enzimi sono importanti anche nella risposta infiammatoria perchè nella risposta infiammatoria vi sono dei fenomeni di reclutamento cellulare di cellule infiammatorie quindi globuli


bianchi, neutrofili che vengono reclutati sul sito del danno perché si attivano questi enzimi; questi enzimi sono importanti anche nel diabete perchè la fosfatidilinositolo-3-chinasi viene attivata quando arriva l’insulina ai tessuti bersaglio e la deregolazione di questa via è implicata in alcune forme di diabete di tipo 2, quindi controllano processi metabolici, proliferazione, sopravvivenza, apoptosi, differenziamento migrazione e cambiamento del citoscheletro quindi per questa miriade di funzioni che svolgono questi enzimi costituiscono una attrazione da parte dei farmacologi perchè andare a costruire delle molecole che inibiscono questi enzimi significa avere delle terapie più mirate non solo nei tumori ma anche nei processi infiammatori.Esistono diverse classi di fosfatidilinositolo-3-chinasi e sono la classe 1, 2 , 3 e la classe 1 è la più rappresentativa ed è formata da due tipi da classe 1a e classe 1b e questi enzimi la classe 1a sono espressi in tutti i tessuti mentre quelli di classe 1b sono predominanti negli omociti e infatti questi ultimi sono importanti nella risposta infiammatoria. Le fosfatidilinositolo-3-chinasi di classe 2 sono espresse ubiquitariamente insieme a quelle di classe 3, queste fosfatidilinositolo-3-chinasi di classe 2 e 3 intervengono nel fenomeno di traffico vescicolare o di altofagia un tipo di morte cellulare. Come sono formate e come vengono attivate queste fosfatidilinositolo-3-chinasi? Le più importanti sono quelle di classe 1a e 1b. Le fosfatidilinositolo-3-chinasi sono formate da una porzione regolatoria e una porzione catalitica fatta eccezione per la fosfatidilinositolo-3-chinasi di classe 1b che è formata sono da una porzione catalitica ha una porzione adattatrice, ma sul ruolo di questa porzione adattatrice se ne discute ancora oggi, e come viene attivata questa forma gamma della fosfatidilinositolo-3-chinasi? Viene attivata dalle proteine G eterotrimeriche e queste a loro volta vengono attivate dalle interleuchine, dalle citochine (quindi quando parliamo di questa isoforma fosfatidilinositolo-3-chinasi parliamo della risposta immunitaria e infiammatoria). Quando una chemiochina arriva alla cellula riconosce il suo recettore e questo recettore è accoppiato a delle preteine G eterotrimeriche le quali si attivano e le due subunità beta e gamma vengono rilasciate dalla subunità alfa, le due subunità beta e gamma vanno a reclutare questa fosfatidilinositolo-3-chinasi di


isoforma gamma la quale viene portata vicino alle membrane plasmatiche dove catalizza la conversione del Pip2 in Pip3, quindi queste chinasi servono a catalizzare la conversione della fosfatidilinositolotrisfosfato a partire dal fosfatidilinositolo-3-chinasi quindi questi enzimi catalizzano alla formazione di Pip3. Pip3 va a reclutare delle molecole che contengono dei domini Ph (Pleckstrin homology) queste proteine vengono reclutate vicino alle membrane plasmatiche vengono a loro volta attivate e attivano una serie di chinasi la cui attività dipende dai Pip3 che sono stati rilasciati per l’azione della fosfatidilinositolo-3-chinasi e questo è quello che accade nella risposta infiammatoria soprattutto nei leucociti, nei neutrofili quando debbono devono fare chemiotassi si debbono portare sul luogo del danno per poterlo rimuovere.Esistono invece delle PI3-chinasi RAS-1A che vengono attivate dai fattori di crescita per poter controllare la sopravvivenza, proliferazione delle cellule, e come vengono attivate? Quando arriva il fattore di crescita induce la dimerizzazione del proprio recettore quindi dimerizza e si autofosforila in tirosina, questi residui di tirosina vanno al legare dei domini SH-2 contenuti in altre proteine. Le fosfatidilinositolo-3-chinasi di classe 1A da che cosa sono formate? Da una porzione catalitica di 110 mila dalton, che è quella che presenta l’attività enzimatica, ed una porzione regolatrice che generalmente pesa 85 mila dalton, questa porzione regolatrice che funge da adattatore presenta 2 domini SH-2 uno di questi due domini serve a riconoscere le tirosine fosforilate delle altre proteine, con l’altro dominio SH-2 possono o legare altre tirosine fosforilate di altre molecole all’interno della cellula o a stabilizzare il legame con la 110. In ogni caso quando la fosfatidilinositolo-3-chinasi viene reclutata da questo recettore dove forma questo legame tra fosfotirosina e domini SH-2 della porzione adattatrice della fosfatidilinositolo-3-chinasi quindi cosa succede? Che l’enzima viene portato vicino alle membrane plasmatiche dove catalizza la conversione del Pip2 in Pip3, il Pip3 che viene rilasciato recluta le molecole che contengono domini PH (pleckstrin homology) i quali a loro volta attivano una serie di chinasi che sono coinvolte nel controllo del ciclo. Quindi anche in questo caso, come nel caso di RAS, questo enzima in seguito alla stimolazione di una cellula come un fattore di crescita viene avvicinato alle membrane


plasmatiche, rilascia un mediatore intra cellulare Pip3 che a sua volta è responsabile dell’attivazione di una serie di eventi a valle e che sono anche in questo caso degli eventi di fosforilazione, anche in questo caso, come RAS, questo processo in una cellula normale è rapido, transiente ed è reversibile, il segnale che viene acceso dal fattore di crescita viene immediatamente spento, e come viene spento questo segnale? Viene spento perché nelle cellule in condizioni normali esistono almeno 2 fosfatasi una è una fosfatasi detta PTEN e l’altra è la fosfatasi SHIP che catalizzano la conversione di Pip3 in Pip2 quindi il segnale si spegne. E che cosa significa tutto questo? Significa che quando si ha l’attivazione di questa strada e si ha la formazione di Pip3 vengono attivate una serie di eventi a valle che consistono nell’attivazione di una serin-treonin-chinasi che si chiama AKT e questa che effetti ha sul ciclo cellulare? Attiva la formazione di ciclina D attraverso i tre meccanismi di cui abbiamo parlato prima, azione trascrizionale, fosforilazione oppure stabilizzazione del messaggero, inibisce P21 che è un inibitore del ciclo cellulare ed inibisce P27 o con meccanismi di fosforilazione o con meccanismi di tipo trascrizionale, quindi AKT non fa altro che quello che fanno le chinasi ERK1-ERK2. Ora tutto questo cosa significa? Che se si ha una mutazione di questa chinasi si ha un’attivazione del ciclo cellulare quindi una proliferazione continua e in quali tumori umani si trovano mutazioni di AKT? Tumori del pancreas, Tumori dell’ovaio, Tumori della mammella, Tumori della prostata, e ancora in altri tumori si può avere delle mutazioni puntiformi che conferiscono questa chinasi un’attività catalitica Costitutiva cioè la chinasi è sempre attiva e quindi è attiva indipendentemente dal segnale esterno per cui la cellula si sgancia da questo segnale esterno. Ma queste sono acquisizioni di funzione da parte della cellula, sia che si ha una mutazione di RAS, sia che si ha una mutazione di AKT la cellula acquisisce una funzione in più. Ma che cosa può succedere in una cellula neoplastica, oltre che acquisire questa funzione? La cellula si può trasformare anche perché ha una sottrazione della funzione, e un questo caso quale sottrazione si può avere? Si può avere la mutazione di questa fosfatasi, se in un tumore si ha la delezione o la mutazione di questa fosfatasi PTEN, cosa succederà? Che il segnale mediato dal


fosfatidilinositolo-3-chinasi non può essere spento per cui rimane sempre acceso, per cui si ha Costitutivamente la formazione di Pip3 e i Pip3 non possono essere convertiti in Pip2. PTEN è considerato uno degli oncosoppressori più importante e maggiormente studiato oltre a P53 e mutazioni di PTEN si trovano in molti tumori umani come tumori del sistema nervoso, tumori della prostata in tutti i tumori della prostata si trovano delle mutazioni o delle piccole delezioni di PTEN per cui questa fosfatasi perde la sua funzione e in quei tumori si ha l’attivazione costitutiva della via Pi3-chinasi perché viene spento un oncosoppressore quindi una funzione di un oncosoppressre quindi una trasformazione si può avere o perché vengono attivati gli oncogeni o perché vengono inattivati gli oncosoppressopri in questo caso PTEN, ma Pi3-chinasi è importante non solo perché controlla la proliferazione della cellula e il ciclo cellulare ma controlla, come gia detto, anche la crescita di una cellula, come? Attraverso il controllo della sintesi proteica, la pathway, il circuito trasduzione Pi3-chinasi AKT va a controllare un'altra serin-treonin-chinasi che si chiama TOR (o mTOR che significa mammalian Target Of Rapamycin, ed è stata identificata alcuni anni fa perché fu identificato un anti fungino in alcune cellule di cultura e questo antifungino che è la Rapamicina inibiva la sintesi proteica di queste cellule e non si capiva perché si inibivano, ma successivamente si vide che questa sostanza che viene usata anche in medicina in alcune forme di tumori ma anche nelle dermatiti atopiche, questa Rapamicina inibiva l’attività di questa serin-treonin-chinasi a cui venne dato il nome di Target della Rapamicina). Ma cosa va a fare questa chinasi? Va a regolare la sintesi proteica attraverso l’attivazione di questa chinasi 6s che fosforila la subunità 40s favorendo la sintesi di nuovi RNA messaggeri e quindi la sintesi proteica. I fattori di crescita attivano la Pi3-chinasi, vengono rilasciati i Pip3 i quali attivano la serin chinasi AKT la quale va a fosforilare questo complesso TSC-1-2 (Tuberous sclerosis complex) questo complesso è formato da 2 proteine che sono la Tuberina TSC-1 e Ha-martina TSC-2 queste due proteine, questo complesso quando è fosforilato da parte di AKT, o altre chinasi, va ad inibire l’attività di Rab (GTP binding protein) che è una GTPa, quando l’attività di Rab è inibita mTOR viene attivato. Quindi quando AKT viene attivata viene attivata


questa mTOR perché viene fosforilato questo complesso della tuberosclerosi di due proteine Tuberina e Ha-martina e quindi la fosforilazione di questo complesso cosa fa? Inibisce l’attività di Rab e quando è inattivo succede che mTOR vene attivata che a sua volta attiva la chinasi 6s e quindi di ha la sintesi proteica, la deregolazione di questa strada, ovviamente, può portare ad una sintesi proteica eccessiva e alla crescita eccessiva quindi la deregolazione di questa pathway può essere coinvolta nei tumori umani. Ma che cosa è questo complesso della Tuberosclerosi? È una malattia genetica abbastanza rara che prende o il nome di Tuberosclerosi o Complesso della Tuberosclerosi ed è stata identificata per la prima volta nell’800 da un clinico e successivamente si è visto che è una malattia genetica che coinvolge numerosi organi e tessuti ed è caratterizzata da tumefazioni che vengono dette impropriamente “tumori” nel senso di tumefazioni, non sono maligne ma benigne e queste tumefazioni dove si vanno a localizzare? Nel cervello, reni, cuore, negli occhi a livello della retina, polmone, cute, ma la malattia è caratterizzato anche da un quadro dove si manifestano altri segni dove include ritardo della crescita e dello sviluppo, problemi di comportamento con autismo, anormalità della pelle, rene e polmone. Ma a che cosa è dovuta questa mutazione? È dovuta a mutazioni del complesso TSC, per ciò si chiama complesso della tuberosclerosi dove quelle proteine sono responsabili di questa malattia dov’è stato dato il nome di Tuberosclerosi, ma perché è stato dato il nome di tuberosclerosi? Osservando degli angiofibromi sul volto di un bambino si notano delle escrescenze le quali sono delle tumefazioni non maligne, in pratica il tessuto non riesce ad organizzare la sua architettura normale. Ma il fatto però quel è? È che molto spesso questa malattia si associa con una suscettibilità ai tumori anche se durante la malattia, che è geneticamente trasmessa dovuta a delle mutazioni di TSC-1-2 ma non si correvano dei tumori veri e propri, però in questi pazienti si ha una suscettibilità al tumore, il che non significa che il tumore si trasmette in maniera ereditaria ma significa che se si hanno delle mutazioni della linea germinale di quei geni si ha una predisposizione o una suscettibilità a sviluppare dei tumori se a quelle mutazioni di quella linea germinale si sommano successivamente delle mutazioni


somatiche e questo è quello che avviene per oncosoppressori, nella maggiori parte dei casi si può avere delle mutazioni della linea germinale degli oncosoppressori, queste mutazioni non fanno sviluppare il tumore ma fanno avere una suscettibilità verso la neoplasia. Mutazioni di PTEN, che è un oncosoppressore si ritrovano nella sindrome di Cowden nei tumori della prostata, del enometro, tiroide, ovaio, glioblastomi e nei linfomi umani. La Sindrome di Cowden è anch’essa una malattia geneticamente trasmessa in cui il bambino presenta la suscettibilità al tumore ma di per se questa sindrome non è una neoplasia maligna in senso stretto. In oltre mutazioni del complesso TSC-1-2, che può essere considerato come un oncosoppressore, si ha nell’Amartoma nel complesso della tuberosclerosi, nei tumori della mammella, nei tumori del rene, negli angiofibromi e ancora, in alcuni tumori umani si può avere alterazioni di questa chinasi mammalian target of rapamycin che ovviamente non è un oncosoppressore ma può essere considerato un vero e proprio oncogene.Quindi per ricapitolare, nei tumori umani si può avere regolazione della Pi3-chinasi attivandolo quindi si ha la produzione costitutiva o eccessiva di Pip3 o si possono avere mutazioni inattivanti della fosfatasi PTEN, oppure si possono avere mutazioni del complesso TSC-1-2, oppure si possono avere delle alterazioni delle espressioni o mutazioni che attivano la chinasi TOR ed avere quindi dei tumori umani.Quali sono le alterazioni del controllo del punto di restrizione? A che cosa possono essere dovute? Attivazione costitutiva degli effettori dei segnali mitotici quindi mutazioni che rendono costitutivamente attiva RAS o la chinasi AKT o la chinasi RAF o la chinasi NET oppure possono essere dovute all’inattivazione dei regolatori delle vie del segnale quindi all’inattivazione di geni oncosoppressori che sono, in questo caso, PTEN e il complesso TSC-1-2. A che cosa portano questi due eventi? Sia se si ha l’attivazione di un oncogene sia se si ha l’inattivazione di un oncosoppressore come viene deregolato il ciclo? Perché si ha un aumento della sintesi proteica quindi del volume della crescita cellulare, iper espressione della ciclica D, riduzione di P21, riduzione o assenza di P27 quindi il ciclo cellulare è forzato e soprattutto quello che è forzato è il raggiungimento del punto di restrizione, una cellula in queste


condizioni riesce a raggiungere il punto di restrizione molto più facilmente rispetto ad un'altra.Esistono anche delle alterazioni dei geni che codificano per le cicline in alcuni tumori, quindi non esistono solo alterazioni delle vie che controllano le cicline o le chinasi associate alle cicline. Vi sono dei tumori umani in cui si ha l’amplificazione genica del gene che codifica per la ciclina D e questo significa che la ciclina viene tradotta e sintetizzata in maniera abnorme, viene iper espressa in alcuni tumori come alcuni tumori mammari, o della prostata, così come, sempre per amplificazione genica si può avere un iper espressione della ciclina E come accade nei tumori dell’ovaio o della mammella, quindi anche in questo caso si può avere l’alterazione del punto di restrizione che viene diversamente controllato non perché sono alterate le vie a monte ma perché sono alterate questi marcatori del ciclo cellulare.Altro ruolo importante nel controllo del ciclo cellulare ma soprattutto il controllo dei checkpoint del ciclo cellulare, infatti noi sappiamo che durante il ciclo un'altra proteina gioca un ruolo importante nel controllo del ciclo cellulare, abbiamo visto fin ora come viene regolato il punto di restrizione e come può essere deregolato questo punto di restrizione, ma la cellula non si trasforma solo perché cambia il punto di restrizione del ciclo si può trasformare anche perché salta i checkpoint del ciclo cellulare perché si ha una deregolazione dei checkpoint, quanti sono i checkpoint? Almeno 4 uno in G1 un altro in fase S, G2 e un altro in M, probabilmente ce ne un quinto. Il primo nella fase G1 a che cosa serve questo checkpoint? Serve alla cellula per vedere se è danneggiata, se ha subito un danno; quello in fase S serve a vedere se tutto il DNA che sta per essere duplicato è corretto o se ci sono delle alterazioni del DNA; poi ne abbiano un altro immediatamente dopo la duplicazione del DNA e che la cellula lo fa per vedere se è stato duplicato tutto il DNA che poteva essere duplicato; un altro in G2; in fase M in questa fase se la cellula si accorge di non poter fare la mitosi va incontro ad un tipo di morte cellulare detta Catastrofe Mitotica (si chiama così perché si ha proprio un esplosine della cellula) quindi qual è la proteina che regola questi checkpoint? Una delle proteine chiave è p53 un fattore di trascrizione con un peso di 53 mila dalton ed è uno degli antioncogeni o oncosoppresori più studiati, com’è


regolata? È regolata da una proteina che è un Ubiquitina ligasi e che si chiama Mdm2 (Mouse double minute) e che qual è il suo ruolo? Blocca l’attività trascrizionale di p53 è ubiquitina ligasi per cui ubiquitina p53 e quindi la rende accessibile al proteasoma e quindi ne favorisce la degradazione è coinvolta nel export nucleare di p53 quindi nel meccanismo che trasporta p53 dal nucleo al citoplasma. Quindi p53 quando è legata a Mdm2 è inattiva, quando viene rilasciata Mdm2 invece diventa “cattiva” per cui il rilascio di p53 che cosa induce nella cellula? Induce l’arresto del ciclo cellulare e/o apoptosi.


Castoria 1.2 (Venerdì 12 Aprile 2013)

Regolazione e Deregolazione del ciclo cellulareOncogeni e Oncosoppressori

I tumori possono insorgere perché si hanno delle alterazioni del punto di restrizione, queste alterazioni si hanno perché si possono avere delle mutazioni a carico dei recettori per fattori di crescita o di trasduttori delle vie del segnale o di marcatori positivi del ciclo cellulare o inibitori del ciclo cellulare quindi partendo dalla membrana cellulare al nucleo si possono avere una miriade di mutazioni che sganciano la cellula dai segnali esterni, dai controlli, quindi la cellula riesce più facilmente ad essere commissionata in ciclo. Ma i tumori possono insorgere perché si hanno alterazioni dei punti di controllo checkpoint, di cui si conoscono due importantissimi il checkpointi in G1 e il checkpoint in G2 ma ce ne sono anche degli altri, e questi checkpoint vengono regolati da proteine che vengono considerate come degli antioncogeni o oncosoppressori e sono le proteine che regolano la risposta al danno soprattutto al danno genotossico cioè al DNA e tra queste la p53 che è un fattore di trascrizione che viene regolato in una serie innumerevoli di modi, negli ultimi anni si è rafforzato il concetto che questa p53 è regolata da una ubiquitino ligasi la mdm2, p53 è un antioncogene un guardiano del genoma, e mdm2 attacca delle ubiquitine a p53 e quindi p53 è suscettibile a degradazione da parte del proteosoma, quindi in questa maniera mdm2 inibirebbe l’azione di p53. Quando si ha una mutazione di Ras la cellula necessariamente si trasforma? O quando si ha una mutazione di un’altra proteina coinvolta nella trasduzione del segnale la cellula si trasforma? No, perché entra in gioco questo p53-mdm2 che protegge le cellule diploidi da stimoli proliferativi eccessivi o dalla mutazione o trasformazione di un oncogene, quindi quando p53 è complessata alla ubiquitino-ligasi non può funzionare a livello trascrizionale mentre quando è libera da questa mdm2 viene rilasciata nel compartimento nucleare o viene stabilizzata perché si formano dei tetrameri perché p53 funziona come tetramero e va ad attivare o a reprimere la trascrizione di alcuni geni importanti che sono coinvolti nell’arresto del ciclo cellulare e nel processo apoptotico. Perchè mdm2 è importante? Come avviene la


regolazione di p53 da parte di mdm2? Quando si ha una stimolazione inappropriata delle cellule cioè quando la cellula è sottoposta a degli stimoli eccessivi e stimolate continuamente la cellula con un fattore di crescita oppure se avete una mutazione di un oncogene per es Myc oppure se si ha la mutazione di Ras oppure se ha un infezione virale da parte di alcuni virus che codificano per delle proteine trasformanti per es. adenovirus succede che la cellula si arresta in ciclo, e in quale maniera? Quando si ha una stimolazione inappropriata da un lato si ha l’attivazione di un inibitore pure del ciclo cellulare, un inibitore della famiglia Ink che è p16, il quale inibitore va ad inattivare le chinasi associate alle cicline, alla ciclina D, quindi la fosforilazione di Rb è inibita e per cui la cellula non può entrare in fase S quindi non può duplicare il suo DNA e questa è una maniera con la quale la cellula bilancia e controlla le eventuali modificazioni che si possono avere nelle vie di trasduzioni del segnale; oppure ancora, in risposta a degli stimoli inappropriati non solo viene stimolata l’attività di questo inibitore del ciclo ma viene stimolata anche l’attività di un altro inibitore del ciclo che appartiene sempre alla famiglia Ink e viene chiamata p14arf (alternative reading frame) è un prodotto di lettura alternativa che deriva dalla p16 per una lettura alternativa del DNA, che cosa fa p14? p14 lega mdm2 e la stacca da p53 e la sequestra nel compartimento nucleolare delle cellule quindi attraverso questo sequestro di mdm2 p53 viene liberata nel nucleo quindi viene attivata e promuove la trascrizione del gene p21 che è un altro inibitore del ciclo cellulare, questo inibitore blocca il complesso Ciclina E/cdk2 e a sua volta anch’esso contribuisce all’iperfosforilazione di Rb; esistono due ondate di fosforilazione di Rb una prima fatta dal complesso Ciclina D/cdk4 e una successiva fatta dal complesso Ciclina E/cdk2 e queste, in maniera orchestrata, vanno a bloccare il ciclo cellulare. Quindi quando si legge sui testi e leggete che è presente una mutazione di un oncogene e la cellula va incontro a trasformazione neoplastica, non è vero perché quando si ha una mutazione di un oncogene ad esempio RAS la cellula è sottoposta ad uno stimolo appropriato e se p53 funziona in quella cellula e se Rb funziona in quella cellula si ha come risposta l’arresto del ciclo. Alcuni anni fa fu pubblicata la prima osservazione di ricercatori inglesi i quali scrissero questo


lavoro “La stimolazione eccessiva di RAS arresta il ciclo cellulare” questo lavoro fece molto scalpore perché allora si pensava che l’oncogene, una singola dose di mutazione di un oncogene potesse dare la trasformazione neoplastica. Questo è un concetto che bisogna puntualizzare in quanto nei testi si trova questa cosa, basta una singola dose di mutazione di un oncogene per dare la trasformazione neoplastica in una cellula normale con corredo diploide, non è vero questo! Ci vogliono più mutazioni di un oncogene per poter dare una trasformazione e dall’altra parte questo è intuitivo perché quando si pensa ad un tumore lo si pensa come incidenza dell'ambito degli individui e non bisogna pensare in questi termini ma in termini più biologici perché il tumore ha un origine monoclonale quindi quando si parla di tumore si parla di un'unica cellula che si trasforma e se si pensa a questo l’incidenza dei tumori è veramente bassa perché noi abbiamo un numero di cellule enormi nel nostro organismo, questo perché ci sono dei meccanismi che controbilanciano gli effetti trasformanti delle proteine mutate oppure controbilanciano la stimolazione eccessiva che la cellula può ricevere.Ora, che cosa può succedere nei tumori umani? Può succedere che si può avere alterazione di quelle due proteine che orchestrano la risposta agli stimoli inappropriati e quindi sono le proteine p53 ed Rb ma si possono avere anche mutazioni a carico di questi inibitori del ciclo. Quindi quando la cellula viene sottoposta alla stimolazione eccessiva se presenta intatte Rb, p53 e gli inibitori della famiglia Ink, risponde nella maniera che abbiamo descritto prima quindi il ciclo cellulare si arresta, quindi questa regolazione avviene a livello nucleare. Ora cosa può succedere che se si hanno mutazioni di p53 o di Rb o di Ink4 o di p14 o di Mdm2 e che cosa succede in questo caso? Succede che la cellula non può rispondere alla stimolazione eccessiva e quindi che cosa fa? Va incontro a trasformazione neoplastica. Si conoscono delle mutazioni della linea germinale di p53 e di Rb e che cosa portano queste mutazioni della linea germinale di p53? Portano ad una sindrome familiare detta Li-Fraumeni (deriva dal clinico americano che fece questa osservazione e notò che nell’ambito delle stesse famiglie vi era un elevata incidenza di tumori e soprattutto tra le donne di quelle famiglie un elevata incidenza dei tumori del seno). Avere mutazioni


della linea germinale di p53 quindi mutazioni germinali di p53 cioè nascere con queste mutazioni non significa necessariamente avere dei tumori ma significa avere una suscettibilità ai tumori per cui se alle mutazioni della linea germinale si aggiungono mutazioni somatiche spontanee si ha molto verosimilmente l’insorgenza di tumori. Quindi mutazioni del gene p53 sono associato con dei tumori familiari (sindrome Li-Fraumeni) ma mutazioni spontanee di p53 si trovano almeno nel 50% dei tumori umani quindi queste mutazioni sono molto frequenti. Mutazioni della linea germinali dei Rb danno origine o sono associati ad un tumore che si manifesta sin dall’infanzia che è il Retinoblastoma che è un tumore del età pediatrica, che colpisce la retina, perché la mutazione di Rb poi vada a dare questo tumore in quello specifico tessuto è ancora oggetto di controversie. Mutazioni spontanee di Rb sono presenti in diversi tumori umani. La stessa cosa accade in un inibitore p16 Ink4 dove mutazioni di questi inibitori sono associati ai melanomi e lo stesso vale per p14, ma mutazioni spontanee di questi due inibitori si rinvengono in diversi tumori umani. Ovviamente queste quattro molecole possono essere considerati degli oncosoppressori o degli antioncogeni perché inibiscono le risposte proliferative della cellula mentre l’ubiquitina ligasi Mdm2 può essere considerato un vero e proprio oncogene perché blocca l’attività di p53 quindi la sua funzione è di bloccare un oncosoppressore, quindi viene considerato un vero e proprio oncogene. Non si conoscono associazioni di mutazioni Mdm2 con tumori familiari umani ma mutazioni spontanee di Mdm2 si rinvengono in diversi tumori umani.Mutazioni del controllo del punto di restrizione della cellula si possono avere perché si possono avere delle mutazioni germinali o somatiche di oncosoppressori, quali sono? Rb, p53, p16 e p14, ovviamente quando si hanno mutazioni di Rb e p53 si ha un’alterazione delle pathway di sopravvivenza cellulare e quindi alterazione dei checkpoint cellulari.Come detto in precedenza esistono almeno 4 checkpoint di risposta al danno, quello in G1, in fase S, in G2 e quello in fase M e probabilmente ce ne è un quinto. Ma questi checkpoint come sono regolati? Sono regolati da sensori del danno! quando p53 si attiva perché la cellula ha subito un danno genotossico quindi un danno al


DNA questo danno deve essere avvertito dalla cellula, e come viene avvertito questo danno? perché nella cellula esistono delle molecole, delle proteine, delle chinasi che sono considerate dei sensori del danno e quindi “sentono” questa interruzione della doppia elica del DNA. Uno dei sensori del danno più importante è una chinasi che si chiama ATM, questa chinasi è stata scoperta a partire da una malattia umana, che compare in età infantile chiamata Atassia Teleangectasia e da cosa era caratterizzata questa malattia? Angiectasia al volto, neurodegenerazione con deficit soprattutto cerebellari, difetti immunitari, suscettibilità a sviluppare tumori, radiosensibilità cioè se questi bambini sono sottoposti a UV (raggi solari) possono sviluppare frequentemente tumori della pelle quindi sono particolarmente radiosensibili, sterilità. Quindi è una malattia che è caratterizzata da una serie molteplice dei sintomi. Successivamente si scopri che questa malattie era dovuta alla mutazione di una chinasi a cui è stato dato il nome di ATM (Atassia Teleangectasia Mutata) questa chinasi risultava mutata in questi bambini, per cui in questi bambini cosa era deficitario??? Era deficitaria la risposta al danno genotossico, perché? Il danno non poteva esser “sentito” da questo sensore ATM. ATM appartiene ad una famiglia di chinasi, se ne conoscono almeno 3, che sono simili alla Pi3-chinasi presentano qualche dominio simile alla Pi3-chinasi, le 3 chinasi sono ATM mutata nella malattia Atassia Teleangectasia, ATR (Atassia Teleangectasia Related) e una DNA protein chinasi. Quindi sono queste 3 chinasi che appartengono a questa famiglia, ma come fa a funzionare ATM? Quando il DNA si rompe si ha una interruzione della doppia elica, e che cosa succede? Come fa ATM a “sentire” questo danno? “Sente” il danno perché vengono modificati anche gli istoni H2a ed è proprio la modificazione di questi istoni che fa avvicinare ATM al DNA danneggiato sta vicina al DNA e quindi subisce una modificazione conformazionale e cosa fa? Dimerizza e questa dimerizzazione la fa fosforilare. Una volta che ATM si è fosforilata recluta un complesso di proteine sul DNA danneggiato e questo complesso si va a posare intorno a ad uno scaffold Rad50, ma soprattutto qual è la proteina che viene reclutata? BRCA-1 (Breast Cancer Related) e serve a riparare il DNA, quindi questo complesso multiproteico che è formato da Rad50, BRCA-1 e ATM cosa fa? Si


fosforila e quindi il DNA viene riparato, sempre se il danno può essere riparato. Quindi rottura della doppia elica, ATM subisce una modificazione conformazionale e si auto fosforila questa auto fosforilazione di ATM porta al reclutamento della proteina BRCA-1 che è la proteina riparatrice del danno al DNA sul DNA, si assembla il complesso multiproteico formato da Rad50 da ATM e BRCA-1 queste vengono fosforilate e quando BRCA-1 viene fosforilata agisce andando a riparare il DNA. Quindi quando si hanno mutazioni di questa chinasi il DNA non può essere riparato ma soprattutto il danno non può essere “sentito” e quindi riparato. Il checkpoint G1 S come viene regolato però? Viene solo regolato da questo meccanismo? Cioè il danno viene “sentito” solo da queste proteine? Tutto questo processo è molto lungo, ci vuole del tempo perché si verifichi. La stessa attivazione di p53 che risponde al danno è un attivazione che richiede una certa quantità di tempo. Invece la regolazione del checkpoint G1 S avviene in tempi più rapidi e come fa a avvenire in tempi più rapidi? Probabilmente sempre attraverso dei meccanismi di fosforilazione che sono un pò diversi rispetto a quelli che abbiamo parlato fin ora, cioè quando la cellula “sente” il danno vendono attivate le due chinasi ATM e ATR le quali una volta che si sono attivate vanno a loro volta ad attivare due chinasi che sono CHK-1 e CHK-2, CHK-1 significa checkpoint chinasi quindi sono 2 chinasi checkpoint, e che cosa fanno queste due chinasi? Vanno, secondo un modello che prevede un meccanismo molto più rapido d’azione, queste due chinasi vanno a fosforilare p53 ed Mdm2 inducendo il distacco di p53 da Mdm2 quindi la liberazione di p53 nel nucleo e l’azione sulla trascrizione della p21. Oltre al meccanismo, di cui abbiamo parlato prima, che recluta BRCA-1 e fa riparare il danno, oltre al meccanismo trascrizionale con cui p53 agirebbe nel riparare il danno, esistono meccanismi molto più rapidi che intervengono e che sono dei meccanismi di fosforilazione e secondo questi meccanismi, quindi, la cellula subisce il danno attiva ATM e ATR le quali a loro volta fosforilano queste altre due chinasi e queste altre due chinasi andrebbero a fosforilare p53 Mdm2, p53 viene rilasciata e va ad agire su p21. p53 interviene solo nella regolazione del checkpoint G1 S? No! Interviene anche nel checkpoint G2 M per cui quando si ha danno del DNA il danno viene “avvertito” alle due chinasi ATM e


ATR e queste due chinasi che cosa fanno? O possono fosforilare la chinasi CHK-1 forforilando una fosforilasi Cdc-25 e questa fosfato cosa fa? Defosforila i complessi ciclina cdk che sono responsabili della transizione G2 M e questa fosfatasi funziona quando è defosforilata questa tirosin-fosfatasi e cosa succede? Quando ATM e ATR attivano questa checkpoint questa fosfatasi si fosforila e che cosa succede? Esce dal nucleo e va nel citoplasma dove viene intrappolata da un'altra proteina che si chiama 14.3.3-σ e che proteina è? È una proteina che serve a far trasportare le proteine dal nucleo verso il citoplasma. Ma come avviene questo trasporto nucleo-citoplasimatico delle proteine? Avviene attraverso dei segnali specifici dette sequenze NES le quali sono riconosciute da un recettore a livello della membrana nucleare e queste sequenze NES vengono riconosciute da un recettore specifico presente sulla membrana nucleare che viene detto CRM-1. Molto spesso però le proteine nucleari, compresa p53, presentano queste sequenze NES però non sono forti non hanno grossa affinità per questo recettore CRM-1 per cui che cosa fanno per poter uscire dal compartimento nucleare? Sono accompagnate da altre proteine che invece presentano delle forti sequenze NES per cui si hanno dei complessi bi molecolari come ad es. p53 esce insieme a Mdm2 dal compartimento nucleare ma anche la Cdc-25 riesce ad essere trattenuta nel citoplasma attraverso l’azione di questa proteina la cui sintesi è controllata da p53. Quindi la regolazione in G2 M la si ha non solo perché si ha la fosforilazione e quindi l’inattivazione di Cdc-25 ma anche perché p53 che cosa fa? Stimola la trascrizione di questa proteina 14.3.3-σ che trattiene nel compartimento citoplasmatico Cdc-25, ovviamente quando si delocalizza una proteina non si ha più la possibilità di funzionare, quindi questo è un altro meccanismo con cui possono esser inattivate. Infatti in molti tumori umani gli oncosoppressori non funzionano più perché vengono delocalizzati da un compartimento all’altro della cellula. Questo è una altro meccanismo con cui p53 può essere inattivata non perché presenta delle mutazioni o delle delezioni ma perché si trova sempre nel compartimento citoplasmatico ad es. c’è un sottogruppo di tumori umani del colon che sono basati sulla rilocalizzazione nucleare di p53 cioè ci sono farmaci, che vengono somministrati a questi pazienti, che rilocalizzano p53 nel


compartimento nucleare quindi conferiscono a p53 quella giusta localizzazione per poter funzionare. Questa è un'altra regolazione, quindi molto spesso la genetica non ci aiuta a capire le basi della trasformazione neoplastica perché esistono una serie di modificazioni che non sono genetiche infatti basta che una proteina è presente in un compartimento piuttosto che in un altro e cambia completamente lo scenario della risposta biologica della cellula.Rifacendoci al discorso sull’Atm chiariamo un punto: in conseguenza alla mutazione si induce l’atassia teleangectasica non il tumore, il tumore può comparire successivamente, se compare, come gli amartomi di cui già abbiamo parlato che sono dovuti alla mutazione del complesso Tsc1-2, il tumore può comparire ma non è detto che compaia cioè quell’individuo se avrà delle mutazioni successive a carico di altri oncogeni o oncosoppressori avrà una suscettibilità a sviluppare tumori sicuramente maggiore ma non è detto che compaiono questi tumori. Quali sono le alterazioni di questi due checkpoint nei tumori umani? Sono: alterazioni di cdc25 non se ne conoscono ma in molti tumori mammari può essere alterata questa fosfatasi, mutazioni di ATM sono associate con l’atassia teleangectasica però mutazioni spontanee di ATM si trovano nei tumori mammari e nei linfomi, la checkpoint chinasi 2 e p53 possono avere delle mutazioni germinali che sono associate alla sindrome di Li-Fraumeni, esistono due forme di questa sindrome una dovuta alla mutazione germinale di p53 e una dovuta a mutazioni germinali della checkpoint chinasi2 e come abbiamo visto prima mutazioni somatiche di p53 sono presenti nel 50% circa dei tumori umani.Ma che cos’è la sindrome di Li-Fraumeni? Grazie ad un lavoro del 69 negli USA da due medici Li e Fraumeni i quali notavano l’incidenza di sarcomi dei tessuti molli dei tumori mammari ed altre neoplasie nell’ambito delle stesse famiglie e si chiedevano se fosse una sindrome familiare. Successivamente si vide che questa sindrome era dovuta a delle mutazioni della linea germinale di p53. ma come viene diagnosticata questa sindrome? Se il paziente ha un sarcoma al di sotto dei 45 anni, e già questo è un sospetto che ci possa essere una mutazione germinale di p53; se un parente di primo grado ha avuto una diagnosi di tumore al disotto dei 45 anni e se un altro parente di primo o di secondo grado ha ricevuto una


diagnosi di tumore al disotto di 45 anni oppure una diagnosi di sarcoma in qualsiasi momento della vita, quindi loro notavano questa incidenza di tumori nell’ambito della stessa famiglia e soprattutto in sarcomi, tumori della ghiandola mammaria nella popolazione femminile.In conclusione i tumori umani possono insorgere come conseguenza di alterazioni del controllo del punto di restrizione oppure alterazioni dei checkpoint del ciclo cellulare. Le alterazioni del controllo del punto di restrizione conferiscono alla cellula la capacità di potersi moltiplicare questi illimitatamente per cui la cellula diventa “immortale” ma non solo perché cambia completamente il tempo di quella cellula ma non solo diventa immortale perché si ha un alterazione dei checkpoint che sono quei punti in cui la cellula dovrebbe andare incontro ad apoptosi per delle mutazioni degli oncosoppressori tende a sopravvivere accumulando una serie di mutazioni.Ora, tutto questo che abbiamo visto viene orchestrato dagli oncogeni e dagli oncosoppressori. Ma che cosa sono, in specifico questi Oncogeni ed Oncosoppressori?Gli Oncogeni sono dei geni che codificano delle proteine che controllano la crescita, la proliferazione, il differenziamento dei tessuti. Sono delle proteine che sono normalmente espresse nelle nostre cellule e che controllano tutta questa serie di funzioni (anche gli effetti metabolici). Queste proteine vengono anche dette Proto oncogeni che sono proprio i nostri oncogeni cellulari contenuti nelle nostre cellule, esistono anche oncogeni virali, infatti i primi oncogeni che sono stati scoperti erano proprio quelli virali, e sono stati scoperti partendo dall’osservazione di alcuni virus che erano trasformanti per le cellule eucariotiche e quindi si pensò che questi virus contenessero del materiale che era capaci di trasformare le cellule, e tutti gli studiosi a quel tempo pensarono di aver risolto il problema di tumori perché avevano scoperto le proteine che erano responsabili delle neoplasie, ma successivamente si vide che i virus contenevano questi oncogeni perché li avevano presi dalle nostre cellule infettando le nostre cellule avevano preso dai nostri geni questi pezzi di DNA, li avevano modificati per poterli integrare nel proprio materiale genetico e che quindi non esisteva nessuna capacità trasformante da parte dei virus ma che gli oncogeni erano


dentro le nostre cellule e che noi li avevamo dati ai virus i quali a loro volta li avevano trasformati, per cui ai nostri oncogeni fu dato il nome di Proto oncogeni o oncogeni cellulari per cui si troverà il suffisso C-onc quando si parla degli oncogeni cellulari e V-onc quando si parla quando si parla di oncogeni virali. Il punto è capire come vengono attivati questi oncogeni nelle nostre cellule dal momento che essi funzionano normalmente nelle nostre cellule e consentono alle nostre cellule di eseguire delle risposte biologiche importanti. Ma in quale maniera possono essere attivati questi proto oncogeni (ma si possono chiamare anche solo oncogeni), si dice che le mutazioni di un oncogene conferiscono un’acquisizione di funzione e come è stato detto prima la teoria più in voga è che basta la mutazione di una singola copia del oncogene per poter dare la trasformazione, ma abbiamo visto che questo non è vero perché negli ultimi anni questo concetto è completamente cambiato. Come si può attivare un oncogene cellulare? Si può attivare perché la proteina è normale ma si ha un aumento quantitativo dell’oncogene, e a che cosa può essere dovuto l’aumento quantitativo quindi la iper espressione di questo oncogene? Può essere dovuta ad un amplificazione genica. Oppure, ancora, la normalità della proteina è dovuta ad una singola mutazione che cambia completamente la funzione di quella proteina ad esempio nel caso di una chinasi in tirosina si può avere una mutazione attivante per cui quella chinasi è costitutivamente attiva nel caso di una piccola proteina legante il GTP come RAS si può avere la sostituzione di un singolo aminoacido che fa perdere a quella proteina l’attività GTPasica intrinseca e quindi quella proteina lega sempre il GTP e questo è molto più intuitivo nel caso degli enzimi in quanto basta una mutazione per poter alterarla.Nel caso degli oncosoppressori si ha la perdita della funzione quindi il tumore può insorgere o perché l’oncogene è mutato quindi si ha l’acquisizione della funzione o perché viene mutato un oncosoppressore e quindi si ha la perdita di una funzione, ma come può avvenire questa perdita di funzione? Perché l’antioncogene si lega ad un inibitore oppure perché l’oncogene viene fosforilato e quindi perde la sua funzione di controllo oppure perché si hanno delle mutazioni quindi gli antioncogeni si possono attivare anch’essi o perchè si hanno delle mutazioni come p53 nella maggior parte dei


casi è mutato nei tumori umani, però p53 può essere anche fosforilato ad es. quando viene fosforilato in alcuni residui lascia il compartimento nucleare e va nel citoplasma quindi può funzionare? No! E quindi può essere attivato un antioncogene perché fosforilato o perché sta in complesso con una proteina che lo attiva e quindi se si ha la perdita di questo legame si ha la perdita della funzione, quindi questi sono i modi in cui gli antioncogeni possono perdere la loro funzione.Questi sono gli acronimi con cui vengono identificati gli oncogeni: Myc (mielocitomatosi); SIS (sarcome delle scimmie); ErbB (oncogene associato all'eritroblastosi aviaria B) è uno degli oncogeni più frequenti che si possono trovare infatti ora si fanno anche i dosaggi di questo oncogene nei tumori mammari, tumori della prostata, abbiamo anche ErbB2 che è un marcatore dei tumori del seno della ghiandola mammaria molto aggressivo e in genere quando si ha l’espressione di ErbB2 questi tumori della ghiandola mammaria non sono più responsivi alle terapie con gli antiestrogeni; RAS (Sarcoma del ratto); Abl (leucemia murina di aebersold).Classifichiamo gli oncogeni: Fattori di crescita, possono essere degli oncogeni? Si! Perché se la cellula tumorale produce un fattore di crescita per autocrinia (Produzione da parte di cellule, anche neoplastiche, dei fattori di crescita necessari per l’attivazione e la replicazione delle cellule medesime) questo fattore di crescita può andare ad agire sulla cellula tumorale stessa e quindi favorire la proliferazione di questa cellula. Schematicamente possiamo dire, partendo dall’esterno della cellula all’interno del nucleo cosa troviamo: Fattori di crescita tirosin chinasi e come possono essere queste tirosina-chinasi? Possono essere associate ai recettori oppure non associati ai recettori e quindi sono solubili e tra queste tirosin chinasi solubili che possono però essere associate alle membrane abbiamo soprattutto le chinasi della famiglia src, poi esistono altre tirosin chinasi che non si trovano neanche nella membrana non vengono neanche reclutate sulla membrana citoplasmatica; Proteine leganti il GTP e quali possono essere? Sia proteine eterotrimeriche, che si trovano sulla membrana plasmatica attivate della citochine, linfochine, che le proteine monomeriche che sono quelle della famigli RAS; Serin chinasi citoplasmatiche; Serin


treonin chinasi come AKT che è un substrato della Pi3-chinasi la quale l’attiva; Regolatori del ciclo cellulare Ciclina D, E, Cdc25; Fattori di trascrizione come Myc JUN FOS che sono considerati tra gli oncogeni nucleari più importanti. Quindi quando si parla di classificazione di questi oncogeni si va dall’esterno della cellula: fattori di crescita poi sulla membrana recettori per i fattori di crescita che generalmente hanno un attività tirosina chinasica poi tirosina chinasica, legate alle membrane citoplasmatiche, solubili poi serin treonin chinasi poi proteine leganti il GTP eterotrimeriche e monomeriche poi proteine che controllano il ciclo cellulare Ciclina D, E ed in fine i fattori di trascrizione Myc JUN FOS e questa è la classificazione più essenziale di questi oncogeni.Ma come fanno questi oncogeni a funzionare? Il fattore di crescita. Come gia detto, regola la proliferazione cellulare perché si lega al recettore, viene attivata la via di trasduzione del segnale e questo segnale favorisce il controllo del ciclo cellulare. Ora, come fanno le cellule neoplastiche ad avere autonomia ad esempio nella crescita? Lo possono fare o perché viene alterato il fattore di crescita o perché viene alterato il recettore o perché viene alterato questi trasduttori o perché viene alterata la proliferazione della cellula, ad es. quando dicemmo che nella classificazione degli oncogeni rientrano i fattori di crescita quale può essere un fattore di crescita? Il PDGF (Platelet-Derived Growth Factor) è un fattore di crescita di derivazione piastrinica, e come funziona questo fattore? Funziona riconoscendo un recettore che presenta un intrinseca attività tirosina chinasica ed il PDGF è uno dei mitogeni più potenti che si conoscono ed è importante perché non controlla solo la proliferazione ma controlla anche la risposta infiammatoria e la guarigione delle ferite. Questo PDGF stimola la proliferazione delle cellule. L’oncogene SIS, che è un oncogene cellulare umano, codifica un fattore di crescita che è appunto il PDGF di tipo β. La forma virale di SIS è un oncogene codificato dai virus, le cellule che sono infettate con questa forma virale di SIS, quindi il β-SIS iperproducono il PDGF e quindi queste cellule vanno incontro ad una proliferazione massiva. Ma la cosa importante quel è? È che questo oncogene può essere iperprodotto anche senza un infezione virale. La controparte virale è stata studiata infettando le cellule normali ed è stato visto che queste cellule incominciavano


ad iperprodurre questo PDGF, però l’iperproduzione di PDGF può essere dovuto anche ad una iperattività di SIS in assenza di infezioni virali. Quando si ha l’over espressione di questo SIS? Nei sarcomi e negli astrocitomi, quindi cosa succede in questi tumori? Che la cellula tumorale si mette a iperprodurre il PDGF-β perché si ha un attivazione di questo gene che codifica per il PDGF-β che è SIS e per autocrinia quelle cellule incominciano a proliferare cioè la cellula tumorale iperproduce un fattore di crescita che agisce sulla cellula stessa quindi si ha una sorta di Loop di autocrinia.


Castoria 1.3 (Lunedì 15 Aprile 2013)

Oncogeni e OncosoppressoriInvasività e metastasi

A partire dall’esterno della cellula possiamo avere delle alterazioni, quindi alterazioni che riguardano i fattori di crescita. L’oncogene c-Sis quindi il protoncogene o oncogene cellulare codifica per un fattore di crescita che è il PDGF e che cosa significa Pdgf? Significa fattore di crescita di derivazione piastrinica, questo fattore di crescita è uno dei mitogeni più potenti promuove la crescita dei fibroblasti e quindi è coinvolto non solo nei meccanismi di trasformazione ma anche nei meccanismi di risposta infiammatoria, risposta immunitaria e guarigione delle ferite, questo sis codificando per un fattore di crescita potente può andare incontro a delle modificazioni per cui la cellula iper produrrà questo fattore di crescita e per autocrinia questo fattore di crescita agisce sulla cellule stesse inducendone la proliferazione massiva quindi una delle prima modificazioni che potete avere è proprio nei fattori di crescita l’oncogene sis infatti può essere iper espresso nei sarcomi e astrocitomi. La controparte virale a cui diamo il nome di v-Sis che sarebbe l’oncogene virale, quando si infettano le cellule con questo oncogene virale le cellule iper producono il Pdgf beta e quindi questa iper produzione causa la trasformazione neoplastica cioè l’eccessiva stimolazione della crescita, la controparte virale codificano per delle proteine che sono mutate quindi acquisiscono una funzione in più, se voi infettate delle cellule normali eucariotiche con quell’oncogene virale le cellule normali eucariotiche vanno incontro a trasformazione neoplastica. Questo non vuol dire che i tumori insorgono perchè le cellule vengono infettate con quegli oncogeni virali ma semplicemente i virus infettando le nostre cellule hanno acquisito i nostri oncogeni nel loro materiale genetico l’hanno modificato e modificandolo succede che questo materiale esprime delle proteine mutate. Altra maniera con la quale la cellula tumorale può acquisire l’autonomia nella crescita riguarda le alterazioni di recettori per questi fattori di crescita, per es. il recettore dell’egf, quando il segnale arriva alla cellula il recettore dimerizza e si autofosforila in tirosina e una volta autofosforilato in tirosina dà luogo all’attivazione di una serie di


segnali intracellulari, vi sono dei tumori umani in cui si possono avere alterazioni di questi recettori? Si, e le mutazioni che si possono avere in questi recettori possono portare o ad un aumento della densità del recettore quindi ad una over espressione e generalmente un over espressione per i fattori di crescita è dovuta ad amplificazione genica oppure ancora ad un’attivazione dei segnali che è ligando indipendente perchè si hanno dei cambiamenti nel sito legante il fattore di crescita quindi nella porzione extracellulare, se si hanno delle mutazioni di un recettore in questo sito legante il fattore di crescita succede che quel recettore non può più legare i fattori di crescita e diventa indipendente dal segnale esterno e questa è un’altra maniera con la quale la cellula neoplastica si sgancia dal segnale esterno. Un altro fenomeno è lo Switching del recettore significa che il segnale passa da un recettore ad un’altra molecola di membrana molto spesso nelle cellule tumorali il segnale passa dai recettori per i fattori di crescita ad altri tipi di recettori che sono le integrine. Quando si hanno queste alterazioni nei tumori umani? Aumento nella densità dei recettori quindi over espressione della proteina quindi amplificazione genica del recettore dell’egf o dei recettori per altri fattori di crescita ma soprattutto del recettore dell’egf si ha nei tumori mammari metaplastici, il 70-80% di questi tumori over esprimono il recettore dell’epidermal growth factor che può essere considerato un marcatore di malignità tumorale quando si ha un tumore mammario generalmente il tumore viene asportato chirurgicamente e viene mandato in anatomia patologica e vengono dosati almeno tre marcatori e sono: recettore degli estrogeni, recettore del progesterone per vedere se quel tumore è ancora differenziato e il recettore dell’efg e l’iper espressione del recettore dell’egf è indice di una prognosi maligna di questi tumori e soprattutto di ormono-indipendenza cioè l’iper espressione di questi recettori si accompagna alla negatività di questi tumori per il recettore degli estrogeni e per il recettore del progesterone e vuol dire che quel tessuto mammario non è più responsivo agli ormoni steroidei ma passa sotto il controllo dell’egf cioè un potente mitogeno. Questo recettore dell’egf è considerato un marcatore prognostico e diagnostico molto importante per i tumori mammari, molte terapie di questi tumori mammari sono basati sull’uso di


anticorpi che bloccano il recettore dell’efg, ci sono dei farmaci che vengono assunti per via orale e che bloccano specificamente il recettore dell’egf o qualche altro membro della stessa famiglia perchè il recettore dell’egf appartiene a una super famiglia genica i cui i membri sono tutte molecole di membrane. Si può avere una mutazione che rende questo recettore indipendente dal ligando, normalmente il fattore di crescita arriva e attiva la tirosina chinasi intracellulare e avete l’accensione del segnale che è ligando-dipendente e da che cosa è caratterizzata questa attivazione ligando-dipendente? E’ caratterizzata dalla rapidità dell’esecuzione perchè l’affinità per il recettore per il fattore di crescita è elevatissimo, poi è caratterizzato dal fatto che è un segnale transiente e dalla specificità perchè si tratta di un legame tra un recettore e un ligando quindi si ha rapidità, specificità e soprattutto la reversibilità del fenomeno, dopo che si ha un attivazione delle vie intracellulari il recettore viene degradato attraverso un processi di endocitosi, e si chiama endocitosi mediato dal ligando e non avviene continuamente nella cellula perchè questo processo di endocitosi per il recettore per un fattore di crescita, ma anche per un fattore dell’insulina che è un ormone, si accende quando arriva il segnale e serve alla degradazione del recettore, serve allo spegnimento del segnale, se avete delle alterazioni nei meccanismi di formazione degli endosomi o nei processi di endocitosi si può avere l’inibizione della degradazione di questi recettori e il segnale persiste nelle cellule ad es. alcune malattie come la celiachia ha una patogenesi di questa genesi è dovuta ad un ritardo nella degradazione del recettore dell’egf quindi viene alterata la risposta delle cellule intestinali alla gliadina che è contenuta nella pasta, nel pane e tutti quegli alimenti a cui il celiaco è sensibile. Che cosa può succedere nei tumori umani? In alcuni tumori umani si possono avere delle mutazioni del dominio intracitoplasmatico che codifica per la tirosina chinasi accoppiata al recettore e questa mutazione all’interno del recettore della parte citoplasmatica lo rende indipendente dal ligando e questa mutazione cosa fa? Questa mutazione può o indurre una dimerizzazione costitutiva del recettore e quindi avete la formazione dei dimeri, degli omodimeri anche in assenza di ligandi quindi l’attivazione della tirosino chinasi oppure si possono avere mutazioni che tagliano il dominio


extracitoplasmatico per cui il recettore è costituito solo dalla porzione di membrana e dalla porzione intracitoplasmatica quindi è sganciata dal ligando o perchè perde il dominio legante l’ormone o perchè acquisisce la capacità di dimerizzare in maniera costitutiva quindi in assenza di ligando; infine queste mutazioni per es. si ritrovano in alcuni tumori umani e sono delle mutazioni per delezioni che rimuovono gli esoni 2-7 nel dominio extracellulare e portano a un’attività legante che è del tutto indipendente dalla presenza dell’egf. Esiste una terza maniera con la quale questo segnale si può amplificare ed è lo switching recettoriale, le cellule tumorali esprimono preferenzialmente dei recettori per la matrice extracellulare le integrine che favoriscono la crescita di questi tumori quindi in conclusione si può avere l’attivazione dei recettori perchè i recettori vengono over espressi quindi questa è una maniera con la quale viene attivato un oncogene cellulare, iper espressione dovuta ad amplificazione oppure si possono avere mutazioni che fanno dimerizzare i recettori in maniera costitutiva o mutazioni, delezioni, che tagliano la porzione extracitoplasmatica del recettore e in questo caso stiamo parlando del recettore dell’egf, ma nelle cellule tumorale si ha anche l’iperespressione delle integrine e quindi in questo caso si ha un cross talk tra recettori per i fattori di crescita e integrine e come avviene questo cross talk? Avviene dalla parte interna della cellula e succede che il segnale arriva alla cellula neoplastica attiva il recettore per il fattore di crescita il recettore dell’egf si autofosforila in tirosina recluta delle proteine che dall’interno inducono un cambiamento conformazionale della coda intracitoplasmatica delle integrine che vengono attivate poichè nei tumori umani si ha spesso l’iperespressione delle integrine si può avere la forzatura di questi meccanismi di cross talk e quando arriva il segnale alla cellula non solo viene attivato il recettore per i fattori di crescita ma viene attivato tutto il signalling delle integrine quindi avete necessariamente in quella cellula delle modificazioni nel riconoscimento tra la cellula e la matrice extracellulare e questa è la prima tappa di metastasi e di invasività tumorale, quindi la perdita da inibizione da contatto che è tipica delle cellule tumorali, che cosa significa? Che in genere in due cellule normali quando si toccano il contatto tra queste cellule le fa inibire, la crescita si inibisce mentre


nelle cellule tumorali si ha la perdita dell’inibizione da contatto, che infatti nei laboratori viene dosata per vedere se nelle cellule si sono trasformate o meno e come si fa a fare questa caratterizzazione? Si va a fare il focus end serity è un dosaggio attraverso il quale si possono vedere del Foci di trasformazione neoplastica nella piastra cellulare e questi foci sono dei gruppetti di cellule trasformate che hanno perso l’inibizione da contatto e che cominciano a crescere l’una sul altra e quando si colorano queste mono layer di cellule in coltura con cristal violetto questi foci appaiono come dei puntini viola in questa piastra ma tutto questo è dovuto da questo crosstalk forzato che c’è per i recettori per i fattori di crescita e le integrine ma soprattutto alla ridistribuzione delle integrine nella cellule neoplastica. Poi ancora, cambiamenti nei messaggeri intracellulari, e questi cambiamenti che cosa riguardano? Riguardano soprattutto degli effettori del segnale e quali sono questi effettori del segnale? Possono essere delle tirosin chinasi che sono intracellulari come la Crk oppure un onco proteina che è il prodotto di due geni ma soprattutto si può avere l’attivazione di una famiglia di tirosin chinasi che possono essere di membrana che sono le chinasi della famiglia Sarc (Src). La tirosin chinasi Src è stato uno dei primi oncogeni ad essere identificato dove è stato studiato moltissimo la maniera come questa tirosin chinasi viene regolata, e a che cosa serve normalmente questa Src? Serve alla proliferazione, differenziamento dei tessuti, ma quando viene attivata da luogo all’attivazione di una serie di eventi che portano a differenziamento, motilità cellulare, invasività, proliferazione e l’attivazione di questa chinasi è stata studiata soprattutto in relazione al Signality attivato dal PDGF perché sicuramente in vivo il PDGF funziona attraverso l’attivazione di questa Src. In quali tumori umani Src può essere deregolata (diciamo deregolata perché in realtà non si conoscono dei tumori umani in cui questa chinasi è mutata, si sa che in alcuni tumori del colon iperesprimono questa chinasi ma nella maggior parte dei tumori umani in realtà questa Src è semplicemente deregolata) è una chinasi importante perché è capostipite di una famiglia di tirosin chinasi il cui membro più studiato è appunto Src con un peso di 60mila mentre gli altri membri sono Yes, Fyn, Lyn, che si presentano differenzialmente distribuite nei vari tessuti e alcune di queste chinasi sono distribuite soprattutto nel tessuto


ematopoietico altre nell’intestino come Yes, Fyn mentre Src è pressoché ubiquitariamente espressa e svolge le sue funzioni differenziative soprattutto nel sistema nervoso centrale. Ma com’è fatta questa chinasi e perché è molto importante? Questa chinasi è importante perché attraverso lo studio molecolare di questa chinasi furono identificati i domini SH2 SH3 (SH significa Src Homology) che sono responsabili del riconoscimento tra le molecole che attiva il flusso di segnale intracellulare, in condizione di base cellulare (in condizione di riposo) è avvolta su se stessa quindi si trova in una conformazione che viene detta chiusa, e da cosa è formata Src? Da un dominio catalitico in cui si trova la tirosina 416 che è il sito di auto fosforilazione della chinasi, e da domini SH2 SH3 che sono uniti da un linker e in condizioni di base è completamente avvolta su se stessa perché all’estremità carbossi-terminale di Src si trova una tirosina 527 che è la tirosina regolatoria della chinasi e non quella catalitica questa tirosina è normalmente fosforilata quindi essendo fosforilata in condizioni di base che cosa consente? Consente il legame tra la tirosina fosforilata e il dominio SH2 di Src per curi risulta ripiegata su se stessa. In tutte le situazioni in cui la tirosina 527 viene defosforilata che cosa succede? Succede che il dominio SH2 viene rilasciato dalla tirosina 527 e la chinasi (Src) si apre e si ha un’attivazione parziale di questa chinasi. Poi, quando la chinasi, attraverso il dominio SH3 interagisce con altre proteine contenenti proline (molte proteine del citoscheletro contengono proline) e in questo caso la chinasi viene completamente aperta e la porzione catalitica (enzimatica) della chinasi è libera di funzionare e quindi si ha la completa attivazione della tirosin chinasi Src. Esiste una controparte virale di questo oncogene? Si! È la chinasi V-src che è stato uno dei primi oncogeni virali studiati e questa controparte virale cosa fa? Presenta una mutazione nella porzione carbossi-terminale e questa mutazione cosa fa? Stacca la porzione carbossi-terminale per cui in questa controparte virale non si ha la tirosina in posizione 527 e come conseguenza di questa delezione la chinasi sempre aperta quindi è sempre attiva per cui studiando la controparte virale di questa chinasi si arrivò all’ipotesi che basta avere la mutazione di una piccolissima regione che taglia la tirosina regolatoria per poter attivare un oncogene e da qui sono partiti gli studi di Src sulle cellule eucariotiche. Che cosa fa questa


chinasi Src? Viene attivata da recettori a tirosin chinasi di membrana soprattutto il recettore del PDGF che recluta in vivo Src, quindi PDGF si serve di Src per fare che cosa? Per attivare almeno 4 processi che sono coinvolti nella progressione tumorale che sono: la Sopravvivenza, Angiogenesi, Proliferazione cellulare, Motilità, Invasività e Migrazione cellulare, quindi l’attività di questa chinasi, attraverso questa rete intricata di network intracellulare controlla questi 4 processi che sono coinvolti nella progressione di un tumore.Al momento si conoscono 4 inibitori di Sarc incluso il Dasatinib che vengono usati in pazienti con i tumori alla prostata in cui l’attività di questa tirosina chinasi sembra deregolata ma questi inibitori vengono utilizzati in altri tumori umani.Si possono avere alterazioni delle piccole proteine leganti il Gtp, le cellule tumorali contengono varie forme di Ras che sono delle forme attive e che sono delle forme attraverso una mutazione puntiforme queste piccole proteine legano costitutivamente il Gtp quindi sono sempre attive oppure perdono l’intrinseca attività gtpiasica quindi non sono capaci di idrolizzare efficientemente il Gtp in gdp per cui rimangono sempre attive nella cellula e queste sono ki-ras e h-ras, la cancerogenesi chimica risulta in mutazioni di ras nei residui in 12, 13, 59, 61, sono quasi tutte delle mutazioni attivati questa piccola proteina leganti il gtp; ancora ci sono i fattori di trascrizione e quali sono le mutazioni più importanti di questi fattori di trascizione? Sono c-myc, è una proteina che in alcune condizioni cellulare media la proliferazione cellulare quindi spinge la cellula in ciclo in altre condizioni invece fa la cosa opposta cioè induce l’apoptosi della cellula infatti è un oncogene che ha una doppia funzione si può comportare in alcune situazioni come un oncogene e in altre situazioni si comporta come un oncosoppressore, se si ha una coltura di cellule in basso siero, quindi con scarsa disponibilità di nutrienti e si iper esprime questo fattore di trascrizione myc in queste cellule, queste cellule non vanno in proliferazione non vanno in ciclo ma vanno incontro ad apoptosi. Le proteine virali associate al virus Epstein-Barr attivano costitutivamente myc perchè fanno diminuire la proteolisi di myc ubiquitino-dipendente e questo è un meccanismo di attivazione e questa attivazione di myc si trova nel linfoma di Burkitt, myc è iper espresso nel linfoma di Burkitt perchè?


Perchè non va incontro a dei processi di proteolisi ubiquitino-dipendenti e perchè non va incontro a questi processi? Perchè in questi tumori sono queste proteine del virus di Epstein-Barr, Ebna1 Lmp1 e la proteina 2A, che fanno dimunuire la proteolisi di Myc e questo è un altro meccanismo con cui gli oncogeni possono essere attivati. Si possono avere delle modificazioni dei cromosomi, dei riarrangiamenti e succede che la parte per una traslocazione dei cromosomi succede che myc si mette sotto il controllo delle IgG quindi delle catene pesante delle Ig e si ha un iper espressione dell’oncogene quindi per una traslocazione cromosomica la porzione del gene che codifica per un oncogene cellulare viene messa sotto il controllo di un promotore forte per es. promotore per le Ig. Le Ig vengono codificate continuamente nelle nostre cellule e insieme alle Ig viene codificato anche l’oncogene Myc quindi questo è un altro meccanismo con cui possono essere attivati questi oncogeni. Sempre per una traslocazione di cromosomi si possono avere l’attivazione di oncogeni perchè si hanno la formazione di proteine chimeriche, proteine di fusione, e questo è il caso della leucemia mieloide cronica in cui avete un gene di fusione che è formata da una tirosina chinasi Abl la quale quando è fusa con la proteina Bcr diventa costitutivamente attiva quindi nelle leucemie mieloidi croniche per una traslocazione tra i cromosomi 9 e 22 si ha fusione di due geni che danno luogo a una proteina di fusione Abl-Bcr che è tipica di queste leucemie. Quali sono gli inibitori che vengono utilizzati nelle terapie? Ad es il Gleevec è uno degli inibitori che inibisce l’attività di questa tirosina chinasi Abl perchè compete con il sito catalitico, il sito di legame all’atp e se la chinasi non lega l’atp non può attivarsi dal punto di vista catalitico; il Gleevec è infatti un farmaco usato nelle leucemie mieloidi croniche con effetti collaterali perchè la maggior parte di questi farmaci mancano di specificità, soprattutto gli inibitori di tirosino-chinasi perchè funzionano sulle chinasi Abl ma possono funzionare anche sulle altre chinasi intracellulari e questo è il motivo per cui oggi si tende ad arrivare a una terapia quanto più mirata che colpisca soprattutto le interazioni tra le proteine perchè sono quelle che sono specifiche nella cellula. Quindi in conclusione quali sono i principali meccanismi di attivazione degli oncogeni intracellulari? Iper espressione dovuta ad amplificazione genica e questo riguarda


l’oncogene Myc, recettore dell’Egf, Erb-2 che è un’altra tirosino-chinasi simile al recettore dell’egf oppure ancora per delle mutazioni puntiformi, mutazioni per delezioni o inserzioni e queste sono a carico di Ras, riarrangiamento dei cromosomi per traslocazione, inversione, e si può avere attivazione di Bcl2 o di Myc oppure per fusione di geni che codificano per proteine di fusione come con Abl-bcr. Quali sono le principali modificazioni che si hanno negli oncosoppressori? Come vengono perse le funzioni degli oncosoppressori? Le funzioni degli oncosoppressori possono essere persi o perchè vengono inibiti da un’altra proteina ad es è il caso di P53 che viene inibita da mdm2 o perchè questi oncosoppressori vengono fosforilati quindi vengono degradati o delocalizzati o perchè avete la formazioni di mutanti di questi antioncogeni, generalmente è luogo comune il concetto che ci basta la singola dose di mutazione di un oncogene per dare la una trasformazione invece ci vuole una doppia dose di mutazione di un antioncogene per dare la trasformazione, concetto che non è vero perchè la cellula normale diploide adotta dei meccanismi che si oppongono alla mutazione di un oncogene quindi alla mutazione di Ras o di uno stimolo eccessivo. Quindi il concetto che oggi è sempre più accreditato è che occorrono in una cellula mutazioni di oncogeni e di antioncogeni quindi ci vuole una cooperazione per avere la trasformazione neoplastica, a che cosa servono questi antioncogeni? Gli antioncogeni sono degli oncosoppressori, delle proteine che servono a monitorare il microambiente cellulare e se è richiesto forzano la cellula in uno stato di quiescenza quindi possono mantenere lo stato post-mitotico ed eventualmente il differenziamento della cellula quindi sono considerate proteine antiproliferative tra queste una delle più importanti è p53 che è coinvolta nel segnale indotto dal danno genotossico. Il 50% dei tumori umane mostra mutazioni somatiche non della linea germinale di p53, il 90% delle mutazioni le trovate nei carcinomi a cellule squamose, l’80% di point-mutation sono delle mutazioni puntiformi il 20% sono delle mutazioni per delezione quindi avete una proteina troncata come prodotto finale. Le mutazioni di p53 cosa causano? Causano perdita della funzione di P53 quindi portano a una continua proliferazione cellulare nonostante la cellula


venga danneggiata nel sua Dna quindi la cellula accumula mutazioni nel suo Dna e questo è il meccanismo con cui le mutazioni di p53 inducono il danno tumorale. Questa proteina dal punto di vista molecolare viene attivata con un meccanismo di regolazione di p53 da parte di mdm2 che è un ubiquitino-ligasi che favorisce la degradazione della p53 l’export nucleare e quindi l’inattivazione di p53. La p53 è un fattore di trascrizione che dal punto vista molecolare è costituito da una regione centrale destinata al legame con il dna, da una regione aminoterminale in cui trovate il dominio di transattivazione, in questo dominio di transattivazioni ci sono diversi siti aminoacidici che possono essere fosforilati e queste fosforilazioni regolano l’attività della proteina, si ha una porzione carbossiterminale una regione destinata alla formazione del tetramero e una regione carbossiterminale in cui avete un dominio regolatorio e in questo dominio regolatorio si possono avere modificazioni post-trascrizionali della proteina quindi questa proteina può essere fosforilata, acetilata, sumoilata quindi può essere regolata a livello post-trascrizionale oltre a essere regolata da mdm2 ovviamente la perdita di questi siti di regolazione della proteina può portare a una modificazione della funzione. Questa proteina funziona come tetramero quindi il dominio di tetramerizzazione della proteina che si trova nella porzione carbossiterminale è molto importante per questo processo di tetramerizzazione quindi quando si ha uno stress cellulare succede che p53 o può subire delle modificazioni post-trascrizionali o si può assemblare sotto forma di tetramero, funziona come tetramero e il tetramero può essere anche indotto dalle modificazioni che p53 subisce quindi quando la cellula viene danneggiata le 4 molecole di p53 tetramerizzano direttamente e p53 può dare l’arresto del ciclo, può stimolare la riparazione del dna o preparare la cellula all’apoptosi oppure può subire delle modificazioni sumoilazioni, fosforilazioni o altre modificazioni che inducono indirettamente la stabilizzazione e la formazione di questo tetramero. La regolazione di p53 da parte di mdm2 quindi i meccanismi sono: o modificazioni post-trascrizionali o legame con mdm2 che sequestra la p14 all’interno dei nucleoli e lascia libera p53 nel compartimento nucleare e lì p53 può funzionare. Mdm2 può essere considerato un vero e proprio oncogene perchè legando il dominio di


transattivazione di p53 ne blocca l’attività trascrizionale, mdm2 è iperespresso nel glioblastoma multiforme. L’esposizione allo stress induce modificazioni di p53, altra cosa importante è il dominio di tetramerizzazione di p53 perchè p53 si lega al dna sotto forma di tetramero ed esistono delle mutazioni in questo dominio di tetramerizzazione, esistono delle mutazioni in alcune popolazioni infantili del Brasile con tumori adrenocorticali sono state identificate mutazioni di questo dominio e queste mutazioni non consentono a p53 di funzionare a livello trascrizionale. Quindi come avviene in definitiva questa regolazione di p53? Una prima fase si attivazione di p53, una seconda fase in cui avete l’attivazione degli effettori e una terza fase in cui avete gli effetti biologici indotti da p53. Quali sono gli altri tumor-suppressor importanti? RB, BRCA1, Apc che coinvolto nella ricognizione cellula-cellula. Una delle modificazioni che avete nella trasformazione neoplastica è l’alterazione del punto di restrizione, l’alterazione del punto di restrizione può portare ad una deregolazione della proteina Rb e Rb significa retinoblastoma e questa proteina serve a tenere legata nella condizione di base, quindi nella condizione di ipofosforilazione, questa proteina tiene legato un fattore di trascrizione che è E2F e quando questa proteina viene fosforilata dalle chinasi associate alle cicline le quali a loro volta vengono attivate in risposta ad uno stimolo proliferativo quindi ad un mitogeno, quindi quando questa proteina viene iper fosforilata permette il passaggio della cellula in fase S quindi il raggiungimento del punto di restrizione e accade questo perchè E2F viene rilasciato e come fattore di trascrizione va a stimolare la trascrizione di alcuni geni che sono importanti nella duplicazione del dna; quindi stato di quiescenza cellulare è associato a ipofosforilazione di Rb stato di attività proliferativa è associata a fosforilazione di Rb. Questa proteina normalmente inibisce la proliferazione cellulare, è localizzata nel compartimento nucleare, il gene per Rb è di 300 chilobasi e mutazioni di questo gene portano ad una perdita di funzione di questa proteina; la tumor suppressor la proteina è di 110mila dalton ed Rb ha almeno 10 siti di fosforilazione e questi 10 siti di fosforilazione servono all’interazione tra Rb e E2F, quando la fosforilazione di questa proteina è completa cioè è iper fosforilata rilascia completamente E2F ed è in quel momento in cui si ha


l’iperfosforilazione della proteina che la cellula riesce a duplicare il DNA e quindi si ha la fase S del segnale. Come si perdono le funzioni di Rb? Le funzioni di Rb si possono perdere perché si hanno delle mutazioni nel gene e queste mutazioni sono state studiate in alcuni bambini, questi bambini nascevano o sviluppavano dopo poco tempo dalla nascita un tumore alla retina che è appunto il retinoblastoma, ma non avete solo la perdita di funzione di Rb per mutazione di Rb ma potete avere la perdita delle funzioni di Rb perché avete un segnale mitogeno eccessivo nella cellula oppure perché questa proteina si lega a delle proteine virali per es E7 dell’adenovirus che la inattivano, quindi i meccanismi di perdita della funzione di Rb si possono avere o per fenomeni genetici quindi mutazioni o perché avete uno stimolo mitogenico eccessivo o perchè avete delle proteine virali che ne bloccano le funzioni.Ma che cosa è questo Retinoblastoma? Partendo dalle cause genetiche, che portano alla perdita della funzione di Rb, è un tumore raro dell’infanzia localizzato agli occhi e questo tumore si sviluppa generalmente in questi bambini al disotto di 5 anni di età, incidenza è del 2% nella popolazione infantile e i fattori che influenzano questo tumore sono dei fattori ereditari nel 30/40% dei casi e nel 60/70% dei casi questi tumori sono dovuti a delle mutazioni sporadiche, infatti come già detto, mutazioni della linea germinale di Rb sono associate con il retinoblastoma, ma avere la mutazione germinale non vuol dire necessariamente la comparsa del tumore ma significa avere una suscettibilità quindi esiste quella teoria del “Doppio Colpo” cioè non è sufficiente una dose di mutazione ma che occorre una seconda dose di mutazione che è evidentemente una mutazione spontanea somatica che viene acquisita nel corso della vita. Il trattamento di questa malattia è chirurgico o radiante oppure vengono praticate delle chemioterapie. Il motivo per cui la perdita di Rb da un tumore che è localizzato soprattutto alla retina non è a tutt’oggi stato chiarito.È stato detto che Rb può essere attivata attraverso il legame con delle proteine virali come la proteina E7 la quale proteina si lega ad RB e ne mima lo stato di fosforilazione e che cosa succede? Succede che Rb rilascia E2F quindi compete con RB per E2F, spiazza E2F da Rb quindi Rb risulta ugualmente attivato, quindi


questa proteina virale E7 che cosa fa? Mima lo stato di fosforilazione, quindi il distacco di Rb da E2F lo si può avere o perché la proteina viene iperfosforilata o perché una proteina virale compete per quel legame, spiazzandolo, lega Rb rilasciando E2F che è libero di agire e di mandare la cellula in fase S.In conclusione possiamo dire che la mutazione attivante di alcune proteine oncogeniche o l’inattivazione di altre proteine oncosoppressori possono portare ad una deregolazione delle funzioni cellulari quindi alla trasformazione neoplastica.Per quanto riguarda gli oncogeni, ricapitolando, quali possono essere queste mutazioni? Mutazioni che alterano il segnale che arriva alla cellula come ad es. il fattore di crescita come nel caso dell’oncogene SIS; mutazioni che alterano o deregolano i recettori per i fattori di crescita come nel caso del recettore del egf; mutazioni che alterano la via di trasmissione dei segnali quindi che alterano le tirosino chinasi, le serin treonin chinasi, le piccole proteine leganti il GTP che devono portare questo segnale dalla membrana al nucleo trasmettendo questo flusso di informazioni; oppure si possono avere alterazioni dei fattori di trascrizione nucleare. Questi sono i principali oncogeni che si possono trovare alterati nei tumori umani. Ma il processo di trasformazione può dipendere anche dalla perdita delle funzioni degli oncosoppressori i quali servono alla risposta al danno quindi alla risposta apoptotica. Quando si perse la funzione di questi oncosoppressori cosa si ha nella cellula? La sopravvivenza cellulare. Tra questi i principali sono p53 e Rb. P53 può avere delle mutazioni germinali che sono associate a dei tumori familiari come la sindrome di Li-Fraumeni come per la proteina del retimoblastoma quando si hanno mutazioni germinali si ha l’associazione con il retinoblastoma che è un raro tumore infantile. Nei tumori umani però si può avere un incidenza elevatissima di mutazioni somatiche spontanee sia di p53 che di Rb. Esistono però delle cose che tutt’oggi non è stata fatta chiarezza: perché vi è la associazione tra le mutazioni degli oncosoppressori e dei tumori familiari e invece la stessa cosa non accade per gli oncogeni? Non esistono a tutt’oggi mutazioni della linea germinale degli oncogeni che si conoscono; nei tumori, nel processo di trasformazione tumorale vi sia un effetto cumulativo tra oncogeni e oncosoppressori e che i tumori risultano da alterazioni


di processi molto complessi che riguardano per es l’acquisizione delle funzioni da parte delle oncoproteine e dalla perdita di funzione dei tumor suppressor quindi si ha, come detto, una cooperazione tra questi oncogeni e oncosoppressori nella progressione neoplastica; perché nei pazienti bambini che hanno mutazione della linea germinale hanno questi tumori della retina e non sviluppano ad es tumori in altri posti così come nella sindrome di Li-Fraumeni perché le mutazioni germinali di p53 la fanno insorgere in questi pazienti sarcomi o tumori mammari? Queste sono domande che a tutt’oggi non si hanno risposta.La caratteristica molecolare di una cellula neoplastica è anche un'altra è quella di non solo sganciarsi dalle cellule circostanti per acquisire autonomia proliferativa ma è quella di sganciarsi anche dalle cellule circostanti per andare ad invadere in altri tessuti eventualmente a dare metastasi.Nell’ultima lezione dicemmo che i vari processi che vengono alterati in una cellula neoplastica sono: la cellula è autosufficiente nei fattori di crescita, è insensibile ai segnali anti proliferativi, evade i meccanismi di apoptosi ma altra caratteristica importante è che la cellula invade generalmente tessuti a distanza e come fa a fare questo? Le vie di Metastasi sono diverse, si possono avere mestatasi per Diffusione Diretta o per via Endocavitaria o via Ematica o Linfatica, e quali sono le sedi di metastasi? Polmoni, Fegato e il Cervello, queste sono le principali sedi si metastasi tumorale ma come avviene questo processo di Metastasi? Prima di tutto per un certo periodo di tempo le metastasi non sono visibili clinicamente, cominciano a diventare evidenti quando incominciano a proliferare nel tessuto che hanno raggiunto a nutrirsi di propri vasi per cui questo processo di metastasi è costituito da diverse fasi, e quali sono? Si osserva una Prima fase di distacco e la cellula che metastatizza è UNA SOLA anche in questo caso si ha un origine monoclonale per le metastasi cioè è una sola la cellula che acquisisce queste nuove proprietà molecolari per poter invadere e andare a metastatizzare, quindi si osserva una prima fase di distacco della cellula, quindi si ha una Seconda fase di invasività cioè la cellula attraversa i vasi o i linfatici e va a localizzarsi in un sito secondario come ad esempio il fegato. La metastasi diventa clinicamente evidente quando quelle cellule hanno colonizzato un


altro organo o un altro tessuto incominciano a proliferare e a fornirsi di nuovi vasi. Ora, quel è il punto fondamentale ad esempio nel melanoma, tumore maligno dei melanociti che viene studiato come modello per spiegare le basi molecolari delle metastasi. I melanomi sono dei tumori che molto spesso se aggrediti immediatamente non danno complicanze, ma quando non vengono diagnosticati subito sono dei tumori altamente metastatici, danno metastasi ai polmoni soprattutto. Noi ci occuperemo delle basi molecolari attraverso le quali queste cellule riescono innanzitutto a staccarsi dal tessuto primario e ad andare a metastatizzare in un altro posto, è vero che tutto questo è favorito dai vasi linfatici, ematici e dalla circolazione! è vero che il melanoma metastatizza al polmone perché il polmone riceve tutto il sangue della circolazione sistemica e vedremo che questo non è vero perché vi è un riconoscimento molecolare tra la cellula metastatica ed il microambiente tissutale che deve ricevere questa cellula e che questo processo è regolato soprattutto dalle chemiochine e dai recettori per le chemiochine, ma soprattutto, com’è stato detto, anche per le metastasi c’è un origine monoclonale cioè un'unica cellula acquisisce queste capacità e perché parliamo di acquisizione di nuove capacità? La maggior parte dei tumori umani sono tumori di origine epiteliale e quindi la domanda è: com’è possibile che una cellula epiteliale acquisisca delle nuove capacità che la rendono mobile? Come prima cosa dobbiamo fare una suddivisione delle nostre cellule del nostro corpo in base alla loro capacità di migrare, ma quali sono le cellule più mobili del nostro corpo? Sono gli elementi figurati del sangue soprattutto i Neutrofili (rimandiamo argomento alle lezioni sull’infiammazione) come si muovono queste cellule, con quale tipo movimento si muovono? Con un movimento che viene detto di tipo Ameboide detto così perché è un movimento ad altissima velocità riescono a fare 15/20mila milli micron in 24ore e si muovono anche come cellule singole, si muovono nel sangue in soluzione quindi sono elementi altamente mobili. Come Secondo gruppo di cellule abbiamo le cellule Mesenchimali che per la loro costituzione fenotipica presentano una certa motilità, ma sicuramente inferiore come velocità alla migrazione che si ha negli elementi figurati del sangue. Come terzo gruppo abbiamo le cellule epiteliali non si muovono affatto. Ma la prima domanda è questa: com’è possibile


che la maggior parte dei tumori umano sono tumori epiteliali che danno metastasi, come avviene questo processo di trasformazione? Come fa la cellula epiteliale ad acquisire questo fenotipo migratorio, mobile?


Castoria 1.4 (Mercoledì 17 Aprile 2013)

MetastasiRisposta al danno

Dal punto di vista generale la metastasi è l’attecchimento del tessuto tumorale delle cellule tumorali in un organo a distanza e può avvenire per diverse strade: diffusione diretta, via endocavitaria, via ematica, via linfatica e che le sedi di metastasi dei tumore più importanti sono polmoni, fegato e cervello, fino a poco tempo fa si era attribuito al fatto che questi organi avessero degli scambi arteriosi ed intensi e che quindi le cellule neoplastiche molto più facilmente potessero raggiungere queste sedi a distanza ma in realtà la cosa non sta in questi termini. Dicemmo che la metastasi diventa rivelabile quando le cellule che hanno attecchito un organo a distanza incominciano a proliferare quindi da uno strato di cellule dormienti vanno incontro ad attiva proliferazione quindi colonizzano questo tessuto diverso rispetto al sito di origine. La maggior parte dei tumori originano dal tessuto epiteliale, il tessuto epiteliale è un tessuto che non è pronto all’invasività perchè non ha nè le caratteristiche molecolari nè le caratteristiche fenotipiche di una cellula migratoria. Perché la maggior parte dei tumori vanno a metastatizzare in alcuni sedi come ad es. i polmoni, o l’osso o il cervello? Ci sono dei microambienti che si creano oppure ci sono delle nicchie metastatiche in questi tessuti che favoriscono l’attecchimento di queste cellule, i processi a cui va incontro una cellula metastatica sono diversi, il primo è l’acquisizione di un fenotipo aggressivo e questa acquisizione avviene perché avete mutazioni di oncogeni e oncosoppressori oppure modificazioni epigenetiche nell’insieme questi meccanismi portano ad una instabilità genetica di questa cellula. Il pre-requisito perché questa cellula possa andare incontro dal sito primitivo alla metastasi è la capacità di autorinnovarsi e quindi è una capacità tipica di una staminalità cellulare le cellule staminali hanno questa caratteristica, la motilità quindi una cellula che normalmente ha scarsa capacità migratoria invece diventa altamente mobile e la sopravvivenza durante il distacco cioè la cellula si distacca dal processo primario e deve sopravvivere in questo processo di distacco. Altro fattore importante è il microambiente che si crea


intorno a questa cellula infatti si parla sempre di più del ruolo, della componente stromale del tumore, e cosa fa e da cosa è formata questa componente stromale? E’ formata da fibroblasti, da cellule infiammatorie, da Macrofagi Associati a Tumori i cosiddetti TAM, da adipociti, tutte queste cellule rilasciano dei mediatori chimici dell’infiammazione e quindi creano un microambiente che favorisce l’invasività, la migrazione di queste cellule lungo dei gradienti chimici. Altro processo importante è che questa cellula una volta che ha attraversato la matrice extracellulare deve entrare nei vasi ematici e linfatici e durante questo processo deve modificare il suo fenotipo, questa transizione viene detta Transizione Epitelio Mesenchimale per cui la cellula va incontro a delle modificazioni fenotipiche ma all’attivazione di una serie di pattern intracellulari, deve vivere durante questo transito e deve trovare a distanza una nicchia metastatica molto spesso la nicchia metastatica è formata dal tessuto osseo oltre che dal cervello o dal polmone etc e poi deve andare a sopravvivere e a proliferare a distanza e deve fornirsi di nuovi vasi in un processo altamente regolato da Egf che è il processo di neoangiogenesi. Alla base di tutte le fasi metastatiche vi sono dei cambiamenti molecolari, quindi la cellula è trasformata perchè ha subito dei processi di instabilità genetica o sia attivazione di oncogeni, sia inattivazione di oncosoppressori sia processi epigenetici per instabilità genetica tende ad acquisire delle nuove caratteristiche ma il microambiente favorisce questo processo metastatico? Normalmente il microambiente non favorisce questo processo metastatico, vi sono dei segnali chimici per es. le specie reattive dell’ossigeno, l’abbassamento del pH, l’ipossia o segnali fisici, la membrana basale, le forze tensionali, la pressione interstiziale o processi biologici, sorveglianza immunitaria, citochine inibitorie, peptidi della matrice extracellulare e regolatori che si opporrebbero a questo processo di metastatizzazione ma invece che cosa accade in queste cellule? Il processo di metastatizzazione dipende sempre di più dall’eterogeneità delle cellule tumorali quindi un tessuto tumorale è eterogeneo più vi sarà la possibilità nell’ambito di questo tessuto primario che un gruppo di cellule o una sola cellula incominci ad acquisire delle caratteristiche che la rendono insensibile a tutte queste barriere del microambiente, quali sono le caratteristiche più importanti che la cellula metastatica deve


acquisire? La prima caratteristica è quella della motilità quindi le cellule epiteliali sono delle cellule scarsamente mobili e generalmente si muovono sotto forma di foglietti, esistono diversi tipi di migrazione cellulare e la migrazione può avvenire a foglietti e questo accade per le cellule epiteliali e accade anche durante i processi di embriogenesi quando avete il differenziamento dei tessuti oppure le cellule si possono muovere come cellule singole e questo accade nella risposta infiammatoria quando gli elementi figurati del sangue devono essere reclutati sul sito del danno e in questo caso vengono reclutati attraverso un processo migratorio a cui viene dato il nome di Chemiotassi, chemiotassi è migrazione lungo un gradiente chimico quindi una migrazione di tipo direzionale. Le cellule tumorali come fanno ad acquisire queste capacità migratorie? Lo fanno perchè in queste cellule tumorali si costituiscono dei propulsori, degli invadopodi a cui è stato il nome di podosomi. Ma che cosa sono questi Invadopodi? Sono delle protrusioni del citoscheletro che sono formati prevalentemente da fascette di actina e altre due proteine la Wasp e la Cofillina. Wasp è il substrato più importante di tutte le piccole proteine che legano il GTP, a queste proteine appartengono, non solo il oncogene RAS ma anche altri 3 oncogeni che sono Rac, Rho e Cdc42. Wasp è substrato di Rac e di Cdc42, e cosa è? È un effettore intracellulare che quando viene attivato da queste piccole proteine legante il GTP va ad attivare il complesso arp2/3 che è responsabile nella modificazione dell’actina citoscheletrica quindi la modifica in maniera tale che l’actina citoscheletrica si va a localizzare sotto forma di fascetti verso la membrana cellulare addensandosi e a livello della membrana cellulare va a formare, in una cellula migrante normale detti lamellipodi cellulari che sono responsabili dell’adesione della cellula alla matrice extracellulare oppure negli endoteli vasali. Wasp si chiama così perché è una sindrome detta Sindrome di Wiskott-Aldrich, questa proteina è mutata e studiando bambini con immunodeficienza congenita fu trovato che in questi bambini questa proteina Wasp era mutata e la mutazione di questa proteina impediva di avere una risposta infiammatoria normale perché era inefficace il reclutamento delle cellule infiammatorie sul sito del danno. In oltre gli invadopodi sono formati da un'altra proteina che è associata al citoscheletro che si chiama Cofillina, ma


ci sono altre componenti proteiche degli invadopodi come proteine che intervengono nella regolazione dell’actina come la Talina, effettori del segnale o molecole adattatrici come Cdc42, la tirosin chinasi SARC, la tirosin chinasi FAC che è la chinasi per le adesioni focali, molecole di adesione tra cui integrine, la vinculina la paxillina, metallo proteasi MMP2 e proteine che vi modellano le membrane, quindi queste sono le proteine più importanti degli invadopodi che la cellula neoplastica forma per por invadere attraverso la matrice extracellulare.Ripetiamo la migrazione cellulare!!! Si ha una prima tappa in cui si ha l’estensione dei lamellipodi da parte del citoscheletro che servono come punto di attacco della cellula sulla matrice e la proteina che interviene in questo processo è la proteina RAC che si attiva e induce delle modificazioni citoscheletriche che portano alla formazione dei lamellipodi, la cellula quindi comincia a produrre degli enzimi che degradano la matrice extracellulare per farsi spazio tra la matrice e questi enzimi sono le metalloproteasi, contemporaneamente si ha la formazione di nuove adesioni focali che servono alla cellula per creare dei nuovi punti di contatto con la matrice extracellulare perché la cellula si deve fare spazio sulla matrice quindi si hanno delle estensioni citocheletriche che le consentono di attaccarsi alla matrice che è responsabile la piccola proteina RAC poi deve degradare la matrice che lo fa attraverso le metalloproteasi, poi deve formare delle nuove adesioni perché si deve muovere sulla matrice extracellulare, poi deve fare una contrazione del corpo cellulare cioè sul retro della cellula che sta migrando si formano dei fascetti di actina filamentosa che fungono da motore per la cellula e nella formazione di questi fascetti è responsabile la piccola proteina legante il GTP Rho ed in fine si ha la ritrazione della parte posteriore della cellula altrimenti la cellula non potrebbe avanzare in questo processo. Queste tappe sono tutte alterate nei tumori umani perché nei tumori si ha l’alterazione delle piccole proteine leganti il GTP come altrerazioni di Rac, Rho e in che cosa consistono queste alterazioni? Consistono nel fatto che molto spesso queste proteine sono mutate nelle cellule metastatiche ed essendo mutate sono sempre attive quindi sono sempre in uno stato di legame al GTP o perché perdono l’intrinseca attività GTPasica o perché legano costitutivamente il GTP, quindi


questo conferisce l’alterazione, queste mutazioni conferiscono alla cellula neoplastica la capacità di migrare molto più facilmente sulla matrice extracellulare. Un'altra cosa che avviene nelle cellule metastatiche è che si ha l’aumento dell’attività delle proteine che si trovano nei complessi focali e che cosa sono questi Complessi Focali? Sono dei complessi multiproteici che si trovano localizzati vicino le membrane cellulari, e a che cosa servono questi complessi? Servono alla cellule per avere interazioni, scambi di informazione con la matrice, quindi cosa ci aspettiamo di trovare in questori complessi? In questi complessi, verosimilmente, troviamo le integrine che sono responsabili della ricezione dei segnali da parte della matrice, poi troviamo un altra proteina molto importante che è la chinasi Fac che è la chinasi delle adesioni focali, è una chinasi in tirosina che viene attivata dalle integrine quindi quando le integrine ricevono un segnale dalle proteine della matrice extracellulare si attivano per dei cambiamenti conformazionali l’attivazione delle integrine, che è un attivazione conformazionale perché le integrine non hanno attività enzimatica, porta all’auto fosforilazione di Fac che a sua volta si autofosforila in tirosina che a sua volta recluta altre proteine che contengono linee SH2 lasciandosi fosforilare gli altri suoi siti (Fac contiene 8 residui in tirosina) e quindi lasciandosi fosforilare diventa una Super Fac e con tutti questi residui fosforilati in tirosina cosa può fare? Può attivare una serie molteplice di pathway intracellulari perché regola tante proteine che contengono domini SH2 e quindi si ha l’amplificazione di questo segnale. Questo segnale che cosa fa? Fa aumentare il turnover delle adesione focali e significa che una cellula normale, in un certo numero di tempo, si formano delle nuove adesioni e quelle preesistenti vengono rotte perchè non servono più, la cellula deve avanzare sulla matrice per potersi muovere, a questo processo biologico viene dato il nome di turnover delle adesioni focali, in una cellula neoplastica cosa avrete mutato? Il turnover delle adesioni focali quindi è un fatto dinamico quindi non è un fatto che aumenta l’attività di una molecola o di un enzima, molto spesso l’aumento eccessivo di una di queste molecole porta all’arresto delle migrazioni e quello che aumenta è il turnover di questi processi quindi questi processi diventano altamente dinamici in una cellula neoplastica e questo perchè avete


alterazioni di queste piccole proteine che legano Gtp ma avete anche alterazioni delle proteine che intervengono nella formazioni dei complessi focali; nelle cellule neoplastiche si ha di spiccato la secrezione delle metallo-proteasi, in alcune cellule neoplastiche il grado di malignità della cellula lo si va a determinare facendo delle analisi di laboratorio attraverso il dosaggio della secrezione della metallo-proteasi, soprattutto nella cellula neoplastica aumentano le secrezioni delle metallo-proteasi di tipo 9 di tipo 2. A che cosa servono queste metallo-proteasi? Servono a degradare la matrice extracellulare quindi si ha aumento del turnover delle adesioni focali, aumento della degradazione della matrice e la cellula riesce in maniera spiccata ad invadere e a muoversi lungo la matrice extracellulare. Ma cosa succede in questa cellula? Perchè questa cellula diventa migratoria? Come può una cellula epiteliale che migra poco diventare una cellula migratoria? Lo può fare in due modi o perchè subisce una transizione che viene detta transizione epitelio-mesenchimale e significa che una cellula che si muove sotto forma di cluster o di foglietto può subire una modificazione fenotipica per cui diventano più affusolate hanno un fenotipo mesenchimale e diventano simili a fibroblasti e diventano molto più prone alla migrazione oppure diventano ameboidi cioè avete una transizione epitelio-ameboide, la maggior parte di cellule neoplastiche hanno una transizione di tipo epitelio-ameboide e attraverso degli studi si è visto che sono proprio delle cellule che stanno all’interno del tumore primario che riescono ad assumere questa caratteristica e a farsi spazio e succede che in cellule epiteliali ci sono delle giunzioni tra le cellule, si ha la normale espressione delle caderine, delle integrine e delle proteasi e durante questi passaggi accade che durante la transizione epitelio-mesenchimale si ha la perdita delle caderine e questo significa che le cellule non possono avere più dei normali contatti tra loro. Quando la cellula fa questa transizione dal fenotipo mesenchimale al fenotipo ameboide perde le integrine quindi il fenotipo ameboide e la migrazione ameboide delle cellule neoplastiche è dovuta alla perdita di cluster di integrina quindi transizione epitelio-mesenchimale è dovuta alla perdita delle molecole responsabili delle adesioni tra le cellule e quindi delle caderine la perdita delle integrine porta invece a questa transizione di tipo ameboide. Dal


punto di vista funzionale la cellula neoplastica può avere due tipi di transizione o passare dal fenotipo epiteliale a quello mesenchimale poi subire la perdita successiva delle integrine quindi fare la transizione in senso ameboide, oppure si ha una transizione da fenotipo epiteliale a fenotipo ameboide e quale è la differenza tra una cellula epiteliale e una cellula mesenchimale e una cellula ameboide? La cellula mesenchimale riesce a fare 500-1000 millimicron in termine di motilità di distanza nelle 24h, la cellula ameboide riesce a raggiungere i 15.000 millimicron nelle 24h quindi una velocità più grande rispetto a quella mesenchimale, un’altra differenza è che la cellula ameboide si riesce a muovere come singola cellula, le cellule del nostro corpo che hanno una migrazione di tipo ameboide sono gli elementi figurati del sangue. La maggior parte della cellula neoplastica per es. nei tumori del pancreas aggressivi o cellule che derivano dai tumori del polmone che hanno altissima capacità di metastasi sono delle cellule che riescono a sopravvivere in sospensione, quelle coltivate in laboratorio vivono in un mezzo di sospensione e non hanno bisogno dei rapporti con la matrice extracellulare per poter vivere quindi non hanno bisogno di un supporto o di una superficie. Negli ultimi anni è stato discusso il ruolo della transizione epitelio- mesenchimale dei tumori e sicuramente questo tipo di transizione è importante durante i processi di differenziamento per es. nella formazione del mesoderma, della cresta neurale, durante la formazione delle valvole cardiache o durante il differenziamento del palato quindi il suo ruolo nel processo di metastatizzazione è tutt’ora discusso mentre è sicuro che la transizione di tipo ameboide è importantissimo nel processo di invasività delle cellule tumorali. A che cosa è dovuto per es. la transizione epitelio-mesenchimale? Oltre a fatto che vengono perse le caderine che cosa succede nella cellula? Accadono una serie di eventi da cui sono mediati dal signalling di Wnt che è una glicoproteina, è importantissima nei tumori oppure dai recettori a tirosino chinasi o dal recettore Tgf Beta, e questi segnali modulati da Wnt, dalle caderine, dal recettore a tirosino-chinasi, dal recettore del Tgf-Beta portano alla differenziazione mesenchimale della cellula, inibiscono i processi di adesione e di polarità che sono tipici delle cellule epiteliali e favoriscono i processi migratori quindi la transizione epitelio-


mesenchimali è dovuta all’attivazione di pathway che dipendono da recettori a tirosino-chinasi oppure dall’attivazione della pathway che dipende da Wnt e dal signalling di (knoc ??) o dal Tgf-beta che va ad attivare il suo proprio recettore in ultima analisi l’attivazione di questi segnali porta al differenziamento nel senso mesenchimale, perdita delle caratteristiche di una cellula epiteliale e migrazione. Altra componente importante nel processo di invasività è il ruolo dei macrofagi quindi il ruolo del microambiente: capacità migratoria della cellula e la cellula acquisisce questa capacità perché subisce una transizione epitelio-mesenchimale e mesenchimale-ameboide oppure direttamente una transizione epitelio-ameboide questi due processi sono accompagnati da perdita di molecole di adesione e di integrine. Ma una volta che questa cellula che si è staccato dal tessuto primario e ha acquisito questa capacità e ha invaso la matrice extracellulare come fa a sopravvivere in questa matrice extracellulare e a farsi spazio? Lo fa attraverso i macrofagi, due ricercatori americani hanno studiato il ruolo di questi macrofagi soprattutto nei tumori della ghiandola mammaria in vivo, e questi hanno osservato che i macrofagi sono partner obbligati del processo di metastatizzazione e significa se si abolisce il signalling dei macrofagi come si può abolire? Ad es. si può abolire facendo il Knokout in un topo di un gene che codifica per un fattore di sopravvivenza dei macrofagi il Csf (Coling stimulating factor) succede che i macrofagi di quel topo poiché il topo ha il knokout per questo gene (il prodotto di questo gene è importante per la sopravvivenza dei macrofagi) in quei topi non si ha lo sviluppo del tumore della ghiandola mammaria quindi in questo esperimento dimostrarono che questo fattore Csf che è indispensabile per la sopravvivenza dei macrofagi ha un ruolo chiave nei tumori umani, in quei topi in cui manca il Csf non si ha lo sviluppo dei tumori soprattutto alla ghiandola mammaria ed è stato visto anche nei tumori della prostata e anche per molti altri tumori. Che cosa fanno questi macrofagi? I macrofagi hanno dei ruoli strani perché la loro comune funzione è quella di produrre dei fattori di angiogenesi, di provvedere al rimodellamento e alla guarigione dei tessuti, hanno per un ruolo importantissimo nell'infiammazione cronica, nella guarigione delle ferite, rilasciano dei fattori di crescita, dei fattori di migrazione, e la cosa importante quale è? E’ che questi macrofagi


regolano lo sviluppo della normale ghiandola mammaria e in questo caso è stato preso come esempio la ghiandola mammaria se non vengono reclutati i macrofagi non si può avere la formazione, lo sviluppo e il differenziamento normale di una ghiandola mammaria. Quindi i macrofagi sono dei partern importantissimi nel normale sviluppo e nel differenziamento della ghiandola mammaria di una persona normale. Quindi i macrofagi sono partner sia delle cellule epiteliali normali quindi faranno differenziare bene il tessuto ma sono anche partner del tessuto trasformato o neoplastico. Ma come fanno i macrofagi a sostenere il processo di metastasi? In precedenza è stato detto che la cellula tumorale ha delle caratteristiche come l’automantenimento, la capacità di auto rinnovarsi, di sganciarsi dai segnali proliferativi, di non rispondere più ai segnali anticrescita a questi processi si deve aggiungere anche altri 6 processi e sono processi che promuovono la malignità tumorale da parte dei macrofagi e come fanno i macrofagi a promuovere la malignità tumorale? Promuovono l’invasività delle cellule tumorali, Promuovono i Processi infiammatori perché rilasciano mediatori chimici dell’Infiammazione, promuovono il Rimodellamento della Matrice Extracellulare, promuovono il Processo di Passaggio nei Vasi, l’Attecchimento in una sede distante e i processi di Angiogenesi, quindi sono 6 caratteristiche della cellula metastatica che vengono favorite dai macrofagi. Come fanno i macrofagi, con quale meccanismo? Lo fanno attraverso un Crosstalk tra due tipi cellulari e non tra due molecole. Ma quali sono i tipi cellulari coinvolti che sono stati studiati? Le cellule degli epiteli di ghiandola mammaria trasformata quindi tumori della ghiandola mammaria e macrofagi che si trovano nel microambiente (probabilmente macrofagi residenti in quanto si trovano nella matrice extracellulare). Che cosa accade tra questi due tipi di cellule? Accade che le le cellule epiteliali trasformate possono produrre dei fattori di crescita PDGF, Sis e mentre i macrofagi possono produrre un fattore di crescita Egf che va ad agire sulle cellule di carcinoma mammario le quali producono Csf e va ad agire sui macrofagi che posseggono il recettore per il Csf. Quindi attraverso questo meccanismo di Crosstalk EGF-CSF si ha la proliferazione e la sopravvivenza delle cellule dell’epitelio mammario e anche la sopravvivenza di questi macrofagi associati


ai tumori. Recentemente, da un gruppo italiano Mantovani, è stato trovato una sostanza detta Trabectedina di origine marina è stata trovata nei tumori umani, e che cosa fa questa sostanza? Va ad inibire specificamente i macrofagi che sono associati ai tumori. In pazienti in cui sono state somministrate queste sostanze si avuta una riduzione dei processi di metastasi ed invasività. Questa sostanza va ad agire preferenzialmente sui macrofagi perché riconosce un recettore specifico detto TRAIL4 che è espresso SOLO sui macrofagi. Ma come succede che questo tumore va scegliersi una sede piuttosto che un'altra? Quando parlammo del melanoma che è un tumore maligno dei melanociti, il quale molto spesso viene asportato chirurgicamente quindi non da complicanze però nel 50/60% dei casi il melanoma metastatizza e i processi di metastasi avvolte avvengono in pochissimi mesi perché le cellule di melanoma sono altamente invasive e una delle sedi preferenziali per il processo di metastatizzazione è al polmone e perché si ha questo processo di metastatizzazione al polmone, com’è che queste cellule attecchiscono al polmone? Queste cellule esprimono un recettore per la chemochina CCR10 i recettori per le chemochine presentano una certa promiscuità cioè riescono a legare diversi tipi di ligando. Il recettore CCR10 lega due tipi di chemochine: la CCL27 nella pelle, nella pelle questo recettore che è espresso sulle cellule di melanoma lega CCL27; nel polmone come mai queste cellule vanno a metastatizzare? Perché a livello polmonare il recettore CCR10 lega la chemochina CXCL12 che viene secreta nel microambiente polmonare quindi il recettore in ambedue i casi viene attivato, sia nella pelle sia nei polmoni e l’attivazione di questo recettore a che cosa porta? Porta a motilità, migrazione, invasività, formazione di pseudopodi, polimerizzazione dell’actina intracellulare ma soprattutto all’attivazione di vie di sopravvivenza che sono le vie mediate dall’attivazione del oncogene RAS e delle MAP chinasi. Nella maggior parte dei melanomi metastatici è presente una mutazione di b-RAF in posizione 600 questa mutazione è stata trovata nel 50% di pazienti con melanoma metastatico quindi il processo di metastatizzazione può essere dovuto all’attivazione di un oncogene che in questo caso la chinasi RAF che sta a valle di RAS ed è un intermedio molecolare che viene attivato dall’oncogene RAS, viene portata


vicino le membrane e una volta che è stata attivata va ad attivare le chinasi a valle che sono le MAP chinasi. Per molti anni i ricercatori hanno lavorato su di una sostanza, un farmaco che si chiama Vemurafenib che è stato il primo farmaco approvato sia negli USA che nell'UE per la cura dei melanomi metastatici, e che cosa fa questo farmaco? Va ad agire sul mutante di RAF che viene espresso nei melanomi metastatici e fino a un po’ di tempo fa tutti i ricercatori erano contentissimi perché avevano trovato una “mano dal cielo” per curare il melanoma metastatico ma un gruppo di ricercatori inglesi scoprì che in questi pazienti che erano trattati con questo farmaco dopo pochi mesi si sviluppava un effetto Paradosso, e in che cosa consisteva? Nella comparsa nel 30% dei pazienti di carcinomi a cellule squamose o dei cheratoacantomi della pelle e queste recidive non si trattava di melanomi ma si trattava di un effetto paradosso perché in questi pazienti nel giro di 90 giorni dalla somministrazione del Vemurafenib comparivano questi altri tipi di tumori sempre della pelle. Quindi si sono chiesti a che cosa potessero essere dovuti questi effetti paradossi e che cosa hanno osservato? Hanno osservato che in questi pazienti resistenti all’inibitore di RAF che cosa erano presenti? Erano presenti delle mutazioni di RAS quindi essendo presenti delle mutazioni di RAS queste mutazioni di RAS attivanti a che cosa portavano? Ad un’attivazione di una via di sopravvivenza di proliferazione delle MAP chinasi per cui quando andavano a prendere quei pezzi da pazienti che avevano avuto questa recidiva non melanomatosa, e andavano a vedere lo stato di fosforilazione di Erk e quindi andavano a vedere questa iperattivazione di queste MAP chinasi, ma in realtà questo paradosso a cosa era dovuto ad punto di vista molecolare? In questi pazienti non solo esisteva una mutazione di RAF ma c’era anche una preesistente mutazione di un altro oncogene RAS, quando si inibisce clinicamente RAF con l’inibitore si ha l’effetto paradosso perché RAS comunque attivo induce dal punto di vista molecolare la dimerizzazione di un'altra isoforma di b-RAF che è c-RAF e il quale dimerizza e va ad attivare costitutivamente la MAP chinasi. Quindi anche se si va ad inibire b-RAF si ha un “cortocircuito” nella cellula e quindi RAS, essendo attivo quindi è oncogene, utilizza c-RAF lo fa dimerizzare e consente l’attivazione di MAP chinasi, e questo significa che questi


pazienti devono essere trattati non solo con l’inibitore di RAF ma devono essere trattati anche con un inibitore di MAP chinasi.Il messaggio fondamentale è che non basta una sola trasformazione di un oncogene per poter dare il processo di metastatizzazione ma anche in questo caso ci vogliono due tipi di mutazioni di RAF e di RAS e quindi anche il processo di metastasi è un processo piuttosto complesso.Nelle altre lezioni parleremo soprattutto (la prof dice che da qui in genere inizia il corso) della Risposta al Danno nella maniera nella quale una cellula risponde al danno che può essere di natura fisica come le radiazioni, di natura chimica, di natura biologica, può essere di tipo endogeno o esogeno come le malattie autoimmuni sono un danno di origine endogeno è un alterazione del sistema immunitario che induce nel nostro corpo una risposta, ma queste risposte come possono essere? Possono essere di tipo Adattativo e di tipo Non Adattativo, ma perché c’è questa risposta da parte dell’organismo? Perché la cellula tende all’omeostasi quindi al bilancio, alla regolazione tra l’ambiente intracellulare e l’ambiente extracellulare.Le cellule sono sempre sottoposte a degli stress di varie natura e in questo essere esposte allo stress possono essere danneggiate in maniera reversibile oppure andare incontro ad una risposta di tipo Adattativo oppure andare incontro alla morte cellulare e quindi ad una risposta di tipo irreversibile.Quali sono le risposta adattative più importanti quando una cellula normale è sottoposta allo stress oppure ad un danno? Sono l’atrofia, l’ipertrofia, iperplasia, e la metaplasia.Quando il danno diventa irreversibile, tipo il rigonfiamento cellulare, o dopo le modificazioni vacuolari cosa si può avere? Si ha un danno di natura irreversibile che può essere la necrosi o l’apoptosi. Ci occuperemo soprattutto della necrosi in quanto dell’apoptosi non riusciremo a trattarla.Vediamo come la cellula si adatta alle varie risposte.Cosa intendiamo per Atrofia ed Ipertrofia ed Iperplasia e per Metaplasia.L’atrofia è la Diminuzione delle dimensioni delle funzioni di una cellula cioè se un soggetto ha un incidente con conseguenza ingessatura di un arto, quei muscoli che si hanno a riposo per tanto


tempo vanno incontro ad un’atrofia e i questo caso che tipo di risposta si ha? Una risposta Adattativa perché si può ripristinare, dopo quella fase di stasi, la normale funzione di quel tessuto e questa risposta è fisiologica ed adattativa.Per Ipertrofia intendiamo l’aumento delle dimensioni cellulari, ad es quando si fa continuamente in palestra e si fa attività fisica i muscoli diventano ipertrofici perché hanno bisogno di una maggiore quantità di apporto sanguino e di ossigeno, è una risposta patologica? No! Perché è una risposta fisiologica ad uno stimolo fisiologico quindi è un'ipertrofia.Per Iperplasia intendiamo l’aumento del numero delle cellule, anche qui si può avere un iperplasia che è del tutto fisiologica per esempio l’iperplasia della ghiandola mammaria durante l’allattamento e una cosa fisiologica che è regolata da ormoni.La Metaplasia è un alterazione del differenziamento cellulare come ad esempio avviene negli epiteli delle vie respiratorie dei fumatori dove l’epitelio che normalmente è cilindrico diventa pavimentoso per una risposta ad uno stimolo irritante esercitato dal fumo ma questa risposta di tipo adattativo può essere contemporaneamente vista come l’inizio di un processo di Displasia e quindi di trasformazione neoplastica del tessuto. Esempi di atrofia fisiologica diminuzione del utero dopo il parto, atrofia della notocorda durante lo sviluppo fetale, atrofie patologiche sono la ridotta utilizzazione di un tessuto ad esempio dopo un processo ipossico o ischemico in questo caso l’atrofia non è più adattativa ma diventa patologica, oppure perdita di innervazione, oppure inadeguata nutrizione di apporto di sangue (ischemia o ipossia sono sinonimi) perdita della stimolazione endocrina per una patologia oppure durante l’invecchiamento cellulare, quindi esistono risposte di tipo adattative e altre in cui si hanno risposte di tipo patologiche.L’ipertrofia anch’essa può essere fisiologica o patologica, muscoli scheletrici che lavorano molto come negli atleti che è un ipertrofia Adattativa, muscolatura liscia dell’utero delle donne gravide, ipertrofia del muscolo cardiaco nell’ipertensione ma questa non è una risposta di tipo adattativa ma è una risposta patologica, il rene che rimane dopo una nefrictomia quindi all’ablazione di un rene che va incontro a dei processi di ipertrofia.


Ora parliamo di questi vari tipi di ipertrofia patologica soprattutto in relazione alla funzione del muscolo cardiaco: ipertrofia da sopraccarico emodinamico quindi da ipertensione, ma si può avare anche come processo opposto ischemico, è caratterizzato da un cambiamento delle dimensioni e del fenotipo dei cardiomiociti, osservando un cuore normale ed esattamente il setto interventricolare presenta un suo mezzore, mentre se osserviamo la sezione di un cuore di un atleta si nota l’aumento del setto interventricolare e questa è una risposta di tipo adattativa è una risposta fisiologica di un muscolo cardiaco a una maggiore richiesta di sangue e di ossigeno, mentre se si osserva un cuore con una lesione ischemia, dovuta all’occlusione di un vaso terminale, si noterà anche qui un ispessimento ma in questo caso da morte cellulare e quindi qui si parlerà di una risposta patologica, ma cosa avviene durante l’ipertrofia cardiaca? Si ha la riespressione di geni, l’espressione della catena pesante β della miosina, l’attivazione di geni precoci Jun, Fos e l’attivazione di geni che codificano per i fattori di crescita.


Castoria 1.5 (Venerdì 19 Aprile 2013)

Risposta al dannoNecrosi

Una Risposta può essere considerata di di tipo Adattativo oppure di tipo Patologica, adattativo quando tende a mantenere l’omeostasi e questo accade ad es. nell’ipertrofia cardiaca in un atleta in cui aumenta il fabbisogno di ossigeno e di apporto sanguigno; allo stesso modo si ha ipertrofia cardiaca in un paziente che ha avuto una necrosi ischemica del miocardio con un aria infartuale e in questo caso si parla di una risposta a un danno ischemico quindi patologica, mentre nel primo caso si parla di una risposta adattativa.L’Ipertrofia cardiaca è caratterizzata da riespressione di geni, da espressione della catena pesante beta della miosina attivazione di geni precoci tra cui Jun e Fos e attivazione di gene che codificano per fattori di crescita.L’Iperplasia è l’aumento del numero delle cellule che compongono un tessuto quindi il temine ipertrofia si riferiscono a cellule che non possono duplicarsi e che possono solo aumentare in volume e in grandezza e ci riferiamo alle cellule del cuore i cardiomiociti, i neuroni quindi a tutte le cellule perenni che vanno incontro a una risposta di tipo ipertrofico perché quelle cellule non possono proliferare, presentano hanno un basso potenziale proliferativo. Quando invece le cellule hanno capacità di proliferare in risposta ad un danno vanno incontro ad Iperplasia ovviamente risulta da un incremento notevole di divisione cellulare e può essere un fattore predisponente per la trasformazione neoplastica di un tessuto quindi le cellule che maggiormente andranno incontro a processi di iperplasia sono le cellule dell’epidermide oppure le cellule degli epiteli intestinali, gli epatociti che sono abbastanza differenziati ma quando il fegato subisce un danno queste cellule pur essendo ben differenziate vanno in attiva proliferazione, i fibroblasti poi vi sono cellule che hanno bassissima capacità replicativa e delle cellule che non ne hanno affatto. L’iperplasia può essere compensatoria e in questo caso non parliamo di una risposta patologica ma adattativa oppure può essere patologica come conseguenza di un danno ad es. l’utero che diventa iperplastico durante la gravidanza o la


ghiandola mammaria durante la gravidanza e l’allattamento o iperplasia compensatoria che si può avere nel fegato e soprattutto l’allargamento dell’utero e la crescita della ghiandola mamamria nella donna sono delle condizioni che sono sollecitate da stimoli ormonali, gli ormoni steroidei femminili controllano questi due processi. Diventa patologica quando invece è conseguente ad una risposta a un danno ad es quando si ha una stimolazione ormonale eccessiva come nell’endometriosi si ha un iperplasia dell’endometrio oppure durante i processi di guarigione delle ferite per effetto dei fattori di crescita oppure si ha un iperplasia che è conseguente ad un infezione da papilloma virus e questi sono es di risposte iperplasica patologica non adattativa.La Metaplasia è una modificazione in cui un fenotipo ben differenziato viene sostituito con un altro fenotipo ugualmente differenziato, uno degli es è la sostituzione per es degli epiteli bronchiali soprattutto nei grossi fumatori e questo tipo di cambiamento può risultare successivamente la prima lesione di una trasformazione in senso neoplastico del tessuto infatti se il segnale persiste ad. es dal fumo di sigarette si ha la progressione della metaplasia verso la displasia e possibilmente l’adenocarcinoma, la metaplasia procede quasi sempre gli adenocarcinomi bronchiali.La Displasia invece consiste in un cambiamento anomalo del volume, del fenotipo e dell’organizzazione strutturale delle cellule, molto spesso precede il processo di trasformazione neoplastica, ed è causato da un danno persistente di tipo irritativo e può interessare la cavità orale, la cervice uterina, la colecisti, il tratto respiratorio, le cellule in questo tipo di lesione sono riarrangiate in maniera anomala quindi si perde anche l’architettura normale del tessuto.La risposta più importante che la cellula adotta in risposta al danno è la Necrosi. Che cosa è la necrosi? Insieme all’apoptosi è un tipo di morte cellulare, e quale è la differenza tra la necrosi e l’apoptosi, e quanti sono i vari tipi di morte in cui la cellula può andare incontro? La necrosi è caratterizzata da una degradazione casuale del DNA quindi non si ha il DNA laddering nel processo di necrosi, si ha dilatazione e rottura della membrana cellulare, vacuolizzazione del citoplasma e rigonfiamento dei mitocondri e non si conoscono dei processi biochimici salienti che caratterizzano questo processo. Per cui si parla di una morte occasionale, a che


cosa da luogo questo tipo di morte cellulare? Da luogo ad una reazione infiammatoria dovuta al fatto che le cellule infiammatorie, prevalentemente i fagociti cioè i macrofagi, vengono attivati durante questo processo e si ha come conseguenza di questa attivazione una cascata di eventi mediati dal rilascio di alcune sostanze chimiche che sono i mediatori dell’infiammazione.L’altro tipo di morte cellulare è l’Apoptosi, l’apoptosi è un processo non conservato filogeneticamente si trova solo negli organismi superiori, i processi biologici che invece sono conservati dagli organismi più semplici a quelli più complessi sono il ciclo cellulare e la migrazione cellulare, l’apoptosi invece non è un processo conservato per cui negli organismi più semplici non si ha questo tipo di morte che è un suicidio programmato della cellula controllato da alcune proteine molte delle quali sono considerate degli oncosoppressori, quali sono i cambiamenti morfologici che si hanno in questo processo? La frammentazione del nucleo in tanti corpi apoptoci, il DNA laddering e significa che il DNA laddering avviene in questo processo perché si ha una degradazione discreta del DNA in frammenti delle stesso peso quindi questo significa che questo processo è regolato specificamente da endonucleasi che non sono quelle attivate durante la necrosi ma sono delle endonucleasi che hanno una regolazione abbastanza fine del nucleo, una delle endonucleasi più importanti è la Cad attivata dalle caspasi, una DNAsi attivata dalle caspasi che normalmente sta in complesso nel compartimento nucleare con un suo inibitore. Il segnale apoptotico che attiva le caspasi dissocia questo complesso per cui la DNAsi è libera di funzionare mentre l’inibitore viene portato dal nucleo al citoplasma della cellula quindi la cellula contiene all’interno del compartimento nucleare questo complesso DNAsi associata con il suo inibitore quando il complesso viene attivato da uno stimolo apoptotico l’inibitore si dissocia dalla DNAsi la DNAsi è libera di funzionare e avete questo laddering, taglio, ben preciso del DNA in alcuni punti precisi. Quindi se voi caricate questo DNA con il gel di agarofio si vedrà una successione di bande di DNA ben precise, nel caso della necrosi se si va ad analizzare il DNA non vi vedranno le bande ben precise ma si vedrà uno “snib” di DNA dal punto in cui si è caricato il campione fino alla fine del gel con cui si analizza il DNA. Quindi il DNA viene tagliato


in maniera casuale nel processo di necrosi ovviamente anche in questo caso viene tagliato da DNAsi.Altra caratteristica del processo apoptotico è il rigonfiamento della membrana cellulare con la formazione di tante bolle di questa membrana e infine la frammentazione della cellula e di tutto il citoplasma con la formazione di questi corpi apoptotici che come vengono rimossi? Dai macrofagi, però in questo caso non si ha una reazione infiammatoria in quanto i macrofagi rimuovono questi corpi apoptotici senza essere attivati ad es. quando si va al mare e prendiamo il sole, le prima volte che ci esponiamo al sole, quella pelle che cade, quello strato superficiale che si perde, lo si perde perché si ha apoptosi. È diverso quando ci esponiamo al sole per un tempo prolungato dove si ha l’eritema solare che è una reazione di tipo infiammatoria invece la perdita dello strato superficiale di pelle è un processo apoptotico.L’apoptosi regola una serie di processi è importanti durante il differenziamento cioè nella vita embrionaria, e perché? Perché il sistema immunitario viene regolato da questo processo, avviene anche nel differenziamento del sistema nervoso centrale, ma è un processo che regola la sopravvivenza delle nostre cellule anche durante la vita adulta, ad es. vi sono delle cellule come quelle della prostata che vanno incontro a dei processi di apoptosi se si sottraggono degli stimoli ormonali come la sottrazione di Testosterone che è importante per la sopravvivenza di quelle cellule, quindi un processo importante durante il differenziamento, durante la vita adulta e soprattutto nella risposta al danno genotossico. È importante anche in alcune patologie umane che sono i tumori, ma questo processo riguarda anche altre due patologie importanti come quelle neurodegenerative come la malattia di Alzheimer si ha un apoptosi spiccata delle cellule del sistema nervoso come il ruolo della β-amiloide e soprattutto della β-amiloide 42 che si va ad accumulare nei neuroni e soprattutto nella zona dell’ippocampo ed attiva, probabilmente attraverso l’azione di un recettore per l’acetilcolina, una serie di segnali all’interno della cellula che poi portano a morte per apoptosi, quindi questa è una patologia che è molto coinvolta. Altra patologia in cui questo processo è coinvolto è la HIV, come conseguenza dell’infezione da parte del HIV si ha la perdita per apoptosi delle cellule immuno


competenti, quindi oltre ai tumori esistono anche altre patologie umane che coinvolgono questo tipo di processo. Ma quel è l’aspetto biochimico più importante di questo processo biologico? Questo processo è dipendente dalle caspasi quindi durante il processo apoptotico si ha l’attivazione di caspasi che vengono divise in Caspasi Iniziatrici che sono quelle che percepiscono il segnale apoptotico, lo trasmettono all’interno della cellula e attivano una serie di eventi intracellulari che a loro volta culmina nell’attivazione delle Caspasi Effettrici che sono quelle che eseguono il suicidio della cellula, ovviamente si sta parlando di una decisione di morte di una cellula che è caratterizzata anch’essa da un punto di non ritorno, così come nel ciclo cellulare si ha il punto di restrizione in cui la cellula è commissionata al ciclo così pure nell’apoptosi si ha un punto di non ritorno cioè la cellula sottoposta ad uno stimolo genotossico apoptotico ci mette molto tempo se eseguire o meno questo processo di suicidio, può durare anche giorni questa decisione. Arriva a questo punto preciso che viene detto Punto di Non ritorno dopo il quale la cellula esegue attraverso l’attivazione delle caspasi effettrici esegue tutto il processo di suicidio cellulare. Esistono anche altri tipi di morte cellulare come l’autofagia che è caratterizzato da un parziale condensamento della cromatina è indipendente dalle caspasi ed è dovuto ad un aumento dell’attività degli enzimi lisosomiali, in oltre l’autofagia è molto importante ad es. in alcune cellule che sono trattate con cellule neoplastiche trattate con delle molecole chemioterapiche oppure nei tumori mammari che vengono trattati con gli antiestrogeni tipo Tamoxifen le cellule possono andare incontro a dei processi di auto autofagia ed è un processo che viene molto studiato proprio per le implicazioni nei tumori umani.La Catastrofe Mitotica che è un tipo di morte che avviene durante la divisione cellulare, quando la cellula fa l’ultimo checkpoint durante la mitosi per vedere se veramente riesce a duplicarsi perfettamente ma se si accorge di non avere materiale a sufficienza per poter procedere con la divisione mitotica va in contro alla catastrofe mitotica quindi si frantuma la cellula si ha la formazione di multipli micro nuclei e questo tipo di morte è caratterizzato da un azione anomala dei complessi ciclinaB/CDK1. Infine l’Invecchiamento Cellulare, che di recente è stato scoperto che in cellule in cultura è


caratterizzato morfologicamente da granulazioni citoplasmatiche ed è associato all’aumento di un enzima lisosomiale che è la β-galattosidasi, parleremo di questo processo perché si parla in associazione ai tumori quindi ai processi di trasformazione neoplastica, invece l’invecchiamento cellulare ha un ruolo ad es nella progressione della fibrosi epatica in cirrosi, e come vedremo le cellule stellate di ITO che sono dei lipociti che però durante il processo cirrotico si mettono a produrre matrice extracellulare, ed è questo il meccanismo patogenetico della cirrosi, e come l’invecchiamento di queste cellule preserva dalla cirrosi epatica, quindi lo si studierà in relazione a cirrosi epatica e anche nelle complicanze del diabete mellito.Incominciamo a parlare della Necrosi. Da che cosa può essere causata la necrosi? Può essere causata dall’ipossia che significa mancanza di ossigeno, da agenti fisici, da sostanze chimiche, farmaci, agenti biologici come batteri virus parassiti, reazioni immunitarie, difetti genetici e sbilanci nutrizionali quindi alterazioni della nutrizione.Che cosa significa Ipossia? Significa che i livelli di ossigeni sono bassi o sono assenti per cui non si avrà la normale funzione dell’emoglobina quindi non si ha ossigenazione dei tessuti si ha un decremento dell’eritropoiesi e quand’è che si può avere questa ipossia? Nelle malattie respiratorie, nella malattie cardiovascolari, nelle ischemie in cui si ha riduzione dell’apporto sanguigno, qual e la differenza tra ipossia e ischemia e quel è il danno più severo per la cellula? L’ipossia è l’assenza o decremento dell’ossigeno, l’ischemia è l’assenza o decremento di apporto sanguigno, la risposta al danno da che cosa dipende? Dalla durata dello stimolo dannoso, dipende dalla capacità di quel tessuto di allontanare tutti i detriti cellulari o le cellule che sono andate incontro a necrosi quindi se si ha l’ipossia si ha sono una riduzione dell’apporto di ossigeno se si ha l’ischemia si ha anche una riduzione dell’apporto sanguigno per cui tutte le cellule che vanno incontro a delle modificazioni in senso necrotico cosa fanno? Lasciano li i loro prodotti perché non potendo arrivare il sangue questi prodotti tossici non possono essere allontanati dal sito del danno, quindi questo è il motivo per cui il danno ischemico è più severo rispetto al danno ipossico.


Esiste anche un altro danno che porta a necrosi della cellula e che è il Danno da Radicali Liberi i quali sono coinvolti nei processi di trasformazione neoplastica, coinvolti nell’invecchiamento. Ma questi radicali liberi cosa sono? Sono delle specie chimiche estremamente instabili perché hanno un unico elettrone non appaiato nell’orbitale più esterno e quindi tendono a complessarsi con altre sostanze, nel complessarsi con queste sostanze nel tentativo di raggiungere una stabilità, cosa fanno? Sprigionano durante queste reazioni di accoppiamento moltissima energia all’interno della cellula ed è questa energia che viene generata in queste modificazioni chimiche che è responsabile del danno, e perché si ha il danno? Perché i radicali che si formano si legano alle proteine modificandole, ai carboidrati e ai lipidi, e in questa maniera viene prodotto il danno e anche di questo ne parleremo quando parleremo del danno microvascolare che si produce ad es nel diabete mellito.Gli Aggetti Chimici ad es cosa fanno? Ad es basi forti, acidi forti, numerosissimi farmaci possono essere tossici dando necrosi, e come fanno ad indurre il danno alla cellula? O hanno un azione diretta come gli acidi e cosa fanno? Vanno a distruggere tutti gli epiteli del tratto gastrointestinale come ad es. se accidentalmente si ingerisce una certa quantità di acido forte. Però ci sono sostanze che producono il danno in maniera indiretta, e che significa? Che non sono di per se direttamente dannosi ma producono dei metaboliti tossici quando vengono elaborate dalla cellula epatica, la maggior parte dei farmaci ad es che si assumono e somministreremo ai pazienti possono indurre il danno perché è la trasformazione da parte del fegato che fa produrre delle sostanze tossiche e in genere questa trasformazione cosa coinvolge? La formazione di radicali liberi ad es il tetracloruro di carbonio quando viene trasformato in tricloruro di carbonio da parte della cellula epatica produce, durante questa trasformazione, una quantità enorme di radicali liberi, l’alcool come fa da essere tossico? Esistono le cirrosi di tipo alcolico, questo non è tossico di per se, ma sono tossici i prodotti che vengono liberati in seguito al metabolismo dell’alcool da parte delle cellule epatiche e sono questi prodotti che sono poi tossici per la cellule epatiche che danno la statosi epatica prima che è la degenerazione dei grassi e poi la cirrosi.


Vi sono anche degli Agenti Fisici che sono cause di danno ad es durante le esplosioni si ha distruzione delle cellule oppure le radiazioni ionizzanti, oppure le temperature estreme come ipotermia, ipertermia quindi le basse e le alte temperature, le variazioni della pressione atmosferica possono dare danno cellulare.Gli Agenti Biologici sono i batteri che producono endotossine oppure producono il rilascio di esotossine, i virus che fanno diminuire la capacità da parte delle cellule di sintetizzare proteine oppure cambiano le caratteristiche antigeniche delle cellule parassitate questo per es è un meccanismo che è responsabile del diabete di tipo uno.Reazioni Immunitarie sono presenti come quelle che si hanno nelle malattie autoimmuni in cui le membrane cellulari sono danneggiate dal contatto con componenti del sistema immunitario come linfociti, macrofagi oppure i tessuti vengono danneggiati direttamente dal deposito di immunocomplessi, perché nelle malattie autoimmuni abbiamo la produzione di auto anticorpi che sono diretti contro componenti della cellula stessi incluso il DNA nativo. L’esposizione a questi agenti causa dei cambiamenti nella permeabilità di membrana.Poi, Malattie Genetiche in tutte le malattie in cui si hanno deficit enzimatici oppure malattie ad es alcune tipi di anemie che sono a cellule falciforme e quest’anemia è dovuta alla sostituzione di un singolo aminoacido nelle catene globiniche e anche in questi casi si hanno modificazioni nella funzione cellulare e quindi anche nel corso di malattie genetiche si hanno modificazioni e quindi un danno della cellulare ovviamente induce o può indurre un processo di necrosi cellulare.Poi Sbilanci Nutrizionali e quali sono? I più importanti sono quelli dovuti alla riduzione dei livelli di plasmatici delle proteine soprattutto dell’albumina, che cosa succede quando si ha un ridotto livello di albumina? Si ha una situazione edema perché l’albumina è responsabile della pressione oncotica, le proteine plasmatiche sono responsabili della pressione oncotica per cui si creano situazioni di edema cioè liquido che fuoriesce negli spazi extravascolari. Altre situazioni di squilibrio nutrizionale quali sono? Iperglicemia e Ipoglicemia, l’iperglicemia è tipica del diabete mellito sia di tipo 1


che di tipo 2, deficienze di vitamine come la V. E, D, K, A, Acido Folico (B9) e ovviamente l’eccessiva introduzione di alimenti viene considerata, l’obesità, viene considerato un fattore molto importante per causare dei danni cellulari seri.Da che cosa dipende la risposta di una cellula al danno? Dipende dal tipo di danno, dalla sua durata e dalla sua gravità, e cosa significa il tipo di danno? Come detto prima un danno ipossico è sicuramente meno severo rispetto ischemico perché il danno ischemico i prodotti tossici che vengono liberati in sito non possono essere allontanati dal sito del danno. La risposta cellulare dipende dalla durata del danno e cosa vuol dire questo? Se si ha un ischemia delle cellule cardiache quindi un assenza del apporto sanguigno e questa ischemia dura illimitata nel tempo cioè dura 20 30 secondi il cuore, la cellula cardiaca non risente di questa diminuzione dell’apporto sanguigno, se invece questo processo di riduzione dell’apporto sanguigno si protrae e si incomincia ad avere in 60 120 secondi questo processo ischemico si avrà sicuramente una conseguenza in risposta a questa ischemia e dalla sua gravità cioè che se si ha un ischemia cardiaca si può avere un ischemia parziale oppure un ischemia totale, se si ha un ischemia parziale che è dovuta per esempio da un trombo che occlude parzialmente un ramo della coronaria si ha sicuramente un danno meno grave rispetto ad un trombo che occlude completamente il vaso e quando si ha un occlusione completa di un arteria terminale a valle di quella arteria si ha un area di necrosi e poi un tentativo di riparazione di quel tessuto con la formazione di una cicatrice che viene chiamato Infarto, quindi quando si parla di infarto si parla una di cicatrice che rimane nel cuore a livello cardiaco in seguito ad un processo necrotico.Le conseguenze del danno cellulare dipendo dal tipo, stato e adattabilità della cellula, se si ha una colite per es che è un infiammazione dell’epitelio del colon si ha una risposta “molto facile” da parte di quelle cellule perché hanno un elevato potenziale proliferativo quindi si ha facilmente la guarigione di quel tessuto e la riparazione, ma se si ha un danno a livello cardiaco, al sistema nervoso centrale il danno non è riparabile e allora le cellule cosa fanno come possono sopperire questo danno? Nel cuore si ha l’ipertrofia delle aree circostanti alla zona di necrosi, come abbiamo


visto prima, e quello è un tentativo da parte di quelle cellule di rispondere ad un danno ischemico, nel sistema nervoso centrale aumenta ad es il metabolismo delle cellule circostanti alla zone di necrosi, alla zona ischemica e questo si ha nel ictus celebrale. Ancora altro concetto importante è che il danno in una sede porta ad un ampio spettro di effetti secondari e questo da che cosa dipende? Dipende molto dall’organo che ha subito quel danno ad es. se si ha un danno ai due sistemi critici del nostro organismo come fegato che svolge le sue funzioni metaboliche oppure il rene che controlla l’omeostasi idrosalina cosa si ha come conseguenza? Ad es. in un epatite virale si hanno una serie di disturbi come alimentari, anoressia, febbre, stanchezza e questa sequela di eventi accompagna il paziente per moltissimo tempo e questo perché? Il fegato perde le sue capacità metaboliche, nel caso ad es di una glomerulonefrite che è l’infiammazione del glomerulo renale cosa si osserva? Un alterazione del bilancio idrico ma soprattutto si ha la perdita della funzione del glomerulo renale e la perdita delle proteine attraverso l’urina quindi la proteinuria e quindi si hanno delle alterazioni nella composizione delle proteine plasmatiche e questo è uno delle fattori che induce l’edema renale, quindi una serie una sequela di eventi clinici come febbre, stanchezza, alterazioni della risposta infiammatoria che sono dovuti dall’alterazione dell’omeostasi idrosalina che è controllata dal rene, quindi un ampio spettro di effetti secondari. Altra cosa importante è che le modificazioni morfologiche diventano evidenti solo dopo il danno di alcuni sistemi critici all’interno della cellula e quali sono i sistemi critici che quando vengono intaccati fanno comparire morfologicamente il danno? Le membrane cellulari e il citoscheletro quando si ha la perdita di queste due funzioni importanti i cambiamenti morfologici che accompagnano la necrosi diventano del tutto evidenti, prima di questi due eventi non si hanno delle modificazioni morfologiche molto grosse nella cellula che sta andando incontro a necrosi. Quindi abbiamo detto che meccanismi di danno di tipo ischemico o dovuti ai radicali liberi quindi prodotti in seguito a radiazioni, processi infiammatori dovuti alla tossicità dell’ossigeno a sostanze chimiche e un danno molto importante è il Danno Riperfusione, che cosa succede? Quando si ha un infarto del miocardio, come un'ischemia totale si ha una zona di necrosi


cellulare e intorno a questa zona di necrosi, quindi cellule che sono morte, si ha una penombra di cellule quindi intorno alla zona necrotica si ha un certo numero di cellule che hanno subito il danno ma che non sono andate incontro a necrosi e cosa succede? Succede che quel paziente lo si fa ricoverare immediatamente in un reparto dove c’è l’unità coronaria e a questo paziente cosa vengono somministrate? Oggi vengono somministrati dei farmaci che servono a disgregare il trombo quindi dei trombolitici e allora cosa succede? Succede che il vaso riesce a recuperare la sua funzione perché si ha la dissoluzione del trombo e cosa succede? Succede che arriva del sangue al tessuto leso e insieme al sangue cosa arrivano? Arrivano anche il Calcio quindi si ha un effetto Paradossale cioè si va a praticare la terapia e l’aria di necrosi si estende e il paziente muore perché si ha la Riperfusione di quel tessuto per un danno da riperfusione che cosa fa? Fa entrare del calcio nelle cellule in maniera massiva e il calcio come fa ad entrare? Perché si è disgregato il trombo liberato attraverso dei farmaci il vaso quindi insieme al sangue al tessuto leso arriva anche il calcio e le cellule che prima avevano subito il danno e non erano morte e non erano andate incontro a necrosi vanno incontro a necrosi successivamente per cui l’area di necrosi si estende e si ha la morte, per cui la morte si ha in un secondo memento e paradossalmente dopo la somministrazione delle terapie, quindi le terapie non sono sempre benefiche ma danno molto spesso effetti paradossali. Infatti oggi quando si portano i pazienti nelle unità coronariche o quando ai pazienti vengono praticate delle indagini strumentali a livello cardiaco tipo cateterismi etc… vengono somministrati, oltre ai farmaci, vengono somministrate dosi massive di antiossidanti proprio per evitare che ci possa essere il danno da riperfusione.Dal punto di vista grossolano che la funzione di un tessuto è persa dopo che avvengono dei cambiamenti morfologici e i cambiamenti come possono essere in una cellula che va incontro a necrosi? Cambiamenti Micro o Macroscopici.Ma qual è il meccanismo con cui si ha questo danno in un tessuto necrotico? In un tessuto necrotico si ha delle alterazioni biochimiche che portano alla morte della cellula e quindi quali sono queste alterazioni? Una cellula che ha subito un danno o ipossico o


ischemico non ha i nutrienti per poter funzionare e quindi che cosa aumenterà in questa cellula? Aumenteranno i processi metabolici che si svolgono in anaerobiosi punto primo, perché alla cellula che ha subito un danno epossico ischemico è una cellula che non ha sufficiente ossigeno per svolgere dei processi in aerobiosi per cui si ha un aumento della glicolisi anaerobia in questa cellula; altra cosa importante che si ha durante il processo di necrosi è l’aumento delle fosforilazioni ossidative e soprattutto le alterazioni di che cosa? Si hanno alterazioni nella produzione dell’ATP e si hanno alterazioni di che cosa? Di tutte quelle attività che dipendono dall’ATP. Tutto questo perché la cellula non é una cellula si trova in un microambiente, non è ossigenata, non riceve nutrienti, ora la cosa più importante che avviene in queste cellule è che si ha l’aumento del calcio intracellulare e da che cosa deriva questo calcio intracellulare? Vengono innanzitutto attivate a livello della membrana plasmatica i canali che servono a veicolare il calcio dall’esterno all’interno della cellula, ma nella cellula che ha subito il danno ischemico ipossico viene liberato il calcio da alcune strutture che vengono dette Calciosomi e che servono a conservare il calcio. Una volta che il calcio si è liberato che cosa succede? Si ha un aumento del calcio citosolico che va ad attivare alcuni enzimi e quali? ATPasi che producono un decremento dell’ATP e quindi una ulteriore funzioni della cellula le fosfolipasi che vanno ad attaccare i fosfolipidi di membrana e quindi si ha il danno delle membrane plasmatiche, le proteasi che servono a distruggere le proteine associate al cistoscheletro e le endonucleasi che sono responsabili del danno al DNA, quindi uno dei meccanismi con cui la cellula risponde al danno ipossico ischemico è l’aumento della concentrazione di calcio intracellulare e questo aumento avviene perché? Perché vengono attivati i canali del calcio a livello della membrana e quindi si ha il passaggio di calcio dall’esterno all’interno ma avviene favorito dal calcio dei calciosomi come conseguenza si ha l’attivazione di questi quattro tipi di enzimi che sono responsabili poi dei processi morfologici che si hanno nella necrosi cellule. In questa fase che viene detta anche fase reversibile quali sono i cambiamenti che si hanno, cambiamenti più evidenti dal punto di visto microscopico? Il distacco dei ribosomi con una riduzione della sintesi proteica, alterazioni delle funzioni


mitocondriali, aumento della permeabilità cellulare, alterazioni del citoscheletro, rigonfiamento dei mitocondri del reticolo endoplasmatico e dell’intera cellula e che cosa succede in questa cellula? La cellula che va incontro a necrosi subisce un rigonfiamento e questa condizione veniva anche chiamata di idropinica perché in questa cellula che va incontro a necrosi che cosa succede? Che aumenta l’afflusso di acqua dall’esterno all’interno per cui si ha questo Swelling o Rigonfiamento cellulare quindi una idropinosi. Il danno diventa invece irreversibile quando si incomincia ad avere all’interno della cellula severe vacuolizzazioni mitocondriali con la formazione di densità amorfe che sono ricche di calcio infatti quando si ha un danno esteso alle membrane plasmatiche si ha un influsso massivo di calcio dall’esterno all’interno della cellula e un rigonfiamento prominente dei lisosomi e di tutto il corpo cellulare. Che cosa succede durante questa fase di irreversibilità? La cellula si incomincia ad alterare talmente che libera all’esterno alcuni enzimi che normalmente sono costipati all’interno della cellula, ad es. quali sono questi enzimi? Nel caso della cellula epatica gli enzimi che vengono liberati sono le transaminasi e questo anche nel caso del danno al muscolo cardiaco per cui quando si ha un epatite un danno epatico vengono rilasciati dalla cellula questi enzimi che si possono andare a dosare nel siero del paziente e sono marcatori di danno epatico oppure di danno cardiaco, le transaminasi ad es vengono rilasciate anche nell’infarto del miocardio. Quindi si ha un danno ipossico ischemico ad una cellula normale, una fase reversibili di necrosi e una fase irreversibie e la irreversibilità è dovuta al danno che subisce la membrana plasmatica e il citoscheletro, di questo danno è responsabile la diminuzione della disponibilità di ossigeno da parte della cellula quindi del normale metabolismo intracellulare ma è dovuto anche all’aumento del calcio intracitoplasmatico che va ad attivare gli enzimi visti prima. Il danno a questa cellula diventa evidente quando morfologicamente che man mano che passa il tempo la membrana plasmatica risulta sempre più alterata, aumenta ancora la concentrazione di calcio intracellulare ed si ha il rigonfiamento di tutta la cellula, si ha irregolarità a livello delle funzioni mitocondriali fino ad avere la lisi della cellula e la distruzione della cellula con la risposta infiammatoria.


La necrosi può essere mediata dai radicali liberi e come vengono prodotti questi radicali liberi? Vengono prodotti o dalle radiazioni oppure dalle sostanze chimiche o vengono prodotti durante l’invecchiamento cellulare o durante il processo infiammatorio quando si ha il processo di fagocitosi da parte dei macrofagi dei corpi estranei oppure quando si ha la distruzione delle cellule tumorali da parte dei macrofagi; questi radicali sono specie instabili con un elettrone non appaiato nell’orbitale più esterno e questi radicali liberi tendono ad accoppiarsi con delle altre sostanze nel nostro corpo e sprigionano energia durante questo processo e questa energia sarebbe responsabile del danno nella cellula. Questi radicali liberi vengono prodotti dal nostro corpo durante alcune reazioni che vengono dette reazioni di ossido-riduzione, nella transizione dei metalli ad es. nella reazione di Fenton il passaggio del ferro dallo stato ferrico allo stato ferroso quindi possono essere prodotti normalmente dal nostro organismo però possono essere prodotti perché per effetti di farmaci o di sostanze chimiche o radiazioni ionizzanti, la cosa importante è che possono essere generati per es. durante il processo infiammatorio oppure possono essere generati durante i processi di respirazione mitocondriale questo significa che sono prodotti o per delle normali funzioni della cellula quindi sono fisiologici però possono essere sprigionati anche durante alcuni processi patologici. Come fanno a indurre danno alla cellula? Perché provocano la perossidazione dei lipidi oppure possono distruggere le proteine attraverso dei meccanismi dei cross-linking quindi attraverso la formazioni di ponti di solfuro oppure ancora possono alterare il DNA perché producono delle modificazioni sulla singola elica e in questa maniera vanno ad interferire, possono indurre delle mutazioni che interferiscono con la crescita normale della cellula. Normalmente questi radicali essendo molto instabili tendono a decadere rapidissimamente quindi hanno un’emivita molto rapida ma il loro decadimento viene anche accelerato da sostanze dette antiossidanti che sono la vitamina E, la ceruloplasmina e questi antiossidanti o bloccano la formazione di questi radicali liberi oppure li spazzano dal nostro organismo. Il decadimento di questi radicali è accelerato da tre complessi enzimatici che sono: la superossido dismutasi, la glutatione perossidasi e la catalasi e questi tre complessi agiscono a livello


della cellula epatica quindi hanno un emivita brevissima, il loro decadimento è accelerato da sistemi enzimatici che operano soprattutto a livello epatico e il decadimento può essere anche accelerato da questi antiossidanti naturali. Il danno delle sostanze chimiche può essere diretto ad es il mercurio è tossico perché si lega direttamente ai gruppi sulfidrilici delle membrane plasmatiche e delle proteine, oppure il danno può essere indiretto delle sostanze chimiche perché non è le sostanza che produce il danno ma sono i prodotti di quella sostanza, questi prodotti delle sostanze tossiche vengono liberate nell’organismo attraverso la funzione della cellula epatica e attraverso la funzione del complesso p450-ossidasi e quando le sostanze chimiche vengono modificate dalla cellula epatica attraverso questo complesso si producono dei radicali liberi quindi le sostanze chimiche agiscono inducendo il danno in maniera indiretta perché durante la loro conversione vengono rilasciati dei radicali liberi e questo radicali liberi vengono rilasciati attraverso l’azioni di complessi enzimatici della cellula epatica. Per es. i cianuri vanno ad agire sulla citocromo-ossidasi, il mercurio lega direttamente delle proteine della membrana plasmatica e quindi avete un danno alle membrane cellulari e un aumento della permeabilità della cellula, i chemioterapici e gli antibiotici possono agire allo stesso modo alterando la permeabilità cellulare, il monossido di carbonio è un’altra sostanza tossica quindi ci sono una serie di sostanze che inducono il danno cellulare ed eventualmente la necrosi.Gli aspetti microscopici del danno reversibile è il rigonfiamento cellulare cioè la cellula assume acqua dall’esterno e questa modificazione viene detta anche modificazione idropinica ma in conseguenza del danno alcune cellule vanno incontro ad una degenerazione grassa cioè accumulano nel loro interno grassi e questo processo viene detto steatosi e avviene soprattutto a carico degli epatociti e dei cardiomiociti, la necrosi invece diventa irreversibile quindi non si ha più rigonfiamento della cellula e ne accumulo di grasso all’interno di questa cellula ma si ha un autodigestione ed eventualmente lisi della cellula nella fase irreversibile e i cambiamenti morfologici che si hanno in questa fase sono: aumento dell’eosinofilia della cellula, la picnosi dei nuclei (il nucleo si restringe e la cromatina si condensa diventando


omogenea), la carioressi (il nucleo viene frammentato, quindi i frammenti son ben visibili), cariolisi (il nucleo viene appunto lisato quindi dissolto, non si vedono i frammenti) che è la distruzione dei nuclei da parte di enzimi idrolitici, rilascio degli enzimi catalitici da parte dei lisosomi che può causare l’autolisi della cellula o la lisi delle cellule vicine. La necrosi può essere di tipo Coagulativo, Colliquativo, Necrosi Caseosa, Necrosi Gommosa, Necrosi Fibrinoide e Necrosi Grassa e quelle che maggiormente si riconoscono e che sono state descritte sono la necrosi Coagulativa e la necrosi Colliquativa.La Necrosi Coagulativa è dovuta ad una denaturazione delle proteine del tessuto ed è tipica nell’infarto del miocardio e nell’infarto del miocardio si ha denaturazione delle proteine nel tessuto leso cioè necrotico ma il tessuto non perde la sua architettura cioè la sua organizzazione.Invece nella necrosi del sistema nervoso centrale cioè conseguente ad un ictus cerebrale si ha generalmente la digestione enzimatica delle cellule con la formazione di una “pappetta” che rimane al posto delle cellule e vengono liquefatte enzimaticamente e quindi si parla di una necrosi di tipo Colliquativa che è tipica dell’ictus cerebrale.Per concludere si hanno danni di origine fisica, chimica, biologica, di natura genetica quindi una serie di danni che generalmente provocano delle risposte patologiche nella cellula quindi non risposte adattative ma risposte patologiche, uno degli es. di questa risposta patologica è la Necrosi Della Cellula che è un tipo di morte casuale dovuta ad alterazioni della membrana plasmatica della cellula e queste alterazioni portano ad alterazioni del metabolismo intracellulare e soprattutto alterazioni del calcio intracellulare quindi si ha un aumento del calcio intracellulare e vengono attivati una serie di enzimi che sono responsabili dei processi che si hanno durante la morte della cellula quindi sono responsabili della degradazione del DNA, dell’alterazione delle membrane plasmatiche e alterazione delle proteine citoscheletriche e alterazioni dei livelli di ATP questa fase è detta fase reversibile mentre il danno viene detto irreversibile quando le alterazioni della membrana plasmatica sono così gravi e violente da consentire l’ulteriore afflusso di calcio all’interno della cellula per cui si ha


rigonfiamento della cellula e degli organuli e la lisi della cellula e come si risolve questo processo? Questi corpi litici che la cellula produce come vengono rimossi? Vengono rimossi dalle cellule infiammatorie quindi il processo di necrosi cellulare dà luogo ad una risposta infiammatoria.



Infiammazione Acuta e Cronica

Quando parlammo della necrosi a differenza dell’apoptosi il processo di necrosi da origine ad una risposta infiammatoria e che cosa è la risposa infiammatoria? È una risposta di cui sono dotati gli organismi superiori e serve ad evitare il danno di un organo o tessuto, quindi il concetto di risposta infiammatoria intimamente è legato ad un altro che è quello della rigenerazione del tessuto e quindi della guarigione del tessuto leso. Come può essere un processo infiammatorio? Può essere Acuta detta anche Angioflogosi perché i fenomeni che prevalgono in questo tipo di risposta sono dei fenomeni vascolari soprattutto del micro circolo; una risposta Cronica che viene detta anche Istoflogosi la risposta che prevale in questo tipo di infiammazione è di tipo tissutale e in questo processo di infiammazione cronica si osserva un tentativo da parte del tessuto di guarire e di riorganizzarsi contemporaneamente quindi di ripararsi e di rigenerarsi e questo processo da generalmente fenomeni di fibrosi.Quindi la prima distinzione è questa: l’infiammazione Acuta eventi vascolari, infiammazione Cronica eventi tissutali.Altra differenza è il Tempo quindi la durata di questi due processi. L’infiammazione acuta può evolvere anche in maniera molto rapida e portare alla guarigione del tessuto nel giro di 6/7 giorni ma anche meno, a volte quindi ha una durata molto limitata nel tempo. Mentre il processo infiammatorio cronico può persistere per tutta la vita e accompagnare quel paziente sino alla morte ad es. è il caso delle malattie autoimmuni dell’artrite reumatoide o di un Lupus Eritematoso Sistemico che insorgono in questi pazienti sono dei processi di tipo cronico e che persistono per tutta la vita del paziente, quindi l’infiammazione cronica ha una durata lunghissima. Può insorgere l’infiammazione cronica ad inizio come tale oppure può essere una conseguenza di un infiammazione acuta che non è stata trattata, che non è stata curata in maniera efficiente e che evolve verso l’infiammazione di tipo subacuta e poi infiammazione cronica.Ma qual'è l’altra caratteristica importante? Sono gli elementi cellulari che caratterizzano questi processi. Nel processo infiammatorio


acuto è caratterizzato soprattutto dalla presenza dell’intervento di polimorfo mononucleati (neutrofili ma anche monociti), mentre l’infiammazione cronica è caratterizzata da cosa? Dalla presenza delle cellule mononucleate quindi soprattutto macrofagi residenti o dei monociti che vengono reclutati dal sangue periferico e differenzia nel senso macrofagico l’altra cellula che partecipa al processo infiammatorio cronico come vedremo sono i linfociti e esiste un interazione tra macrofagi linfociti che spiega anche il persistere di questa risposta infiammatoria. Quindi tempo è la prima delle caratteristiche che le contraddistingue, fenomeni vascolari e tessutali e poi il tipo di cellule che vengono reclutati in questi due tipi di infiammazione.L’infiammazione a che cosa serve? Serve ad eliminare il danno quindi ad eliminare il virus, batteri che hanno indotto questo danno o un corpo estraneo e qual è il punto fondamentale? È quello di portare nel più breve tempo possibile le cellule figurate del sangue sul sito del danno e questo è quello che la risposta infiammatoria si prefigge di fare. Ma come attua questo processo? Quali sono le componenti fondamentali di una risposta infiammatoria? Abbiamo detto che si parla di angioflogosi quindi è un processo che è caratterizzato da alterazioni a carico del circolo ematico, e quali sono queste alterazioni? La prima è la Vaso Dilatazione poi Alterazioni Della Permeabilità degli epiteli vasali e poi ancora si ha il passaggio dei polimorfi nucleati (neutrofili) dall’interno del vaso e quindi dalla porzione intravascolare alla porzione extra vascolare, queste caratteristiche sono responsabili dei 5 segni cardinali del processo infiammatorio per la verità i primi 4 sono identificati dai latini e successivamente da Mirchoff fu aggiunto questo quindi segno e quali sono? Sono rubor, tumor, calor, dolor, functio lesa e a che cosa sono dovuti? Il Calor è il calore che si sente, quindi l’aumento della temperatura nel luogo del danno ma non solo perché il processo infiammatorio in genere è accompagnato da febbre; poi l’arrossamento del tessuto, la tumefazione e il dolore e la perdita della funzione di quel tessuto. A che cosa sono dovuti questi segni cardinali? Il calore è dovuto alla vasodilatazione, l’arrossamento alla vasodilatazione, il rigonfiamento cioè la tumefazione è dovuta all’alterazione della permeabilità vascolare, il dolore e la perdita della funzione di quel tessuto sono dovuti al


rilascio di mediatori chimici nell’infiammazione da parte di polimorfo nucleati (neutrofili), quindi questi sono gli eventi più importanti che si hanno nel processo infiammatorio acuto. Ma quali sono i punti fondamentali? Cambiamento vascolare, e in che cosa consiste? Consiste in questi 5 processi e che sono la vaso dilatazione, l’essudato di un fluido ricco di proteine e quindi la formazione di un Essudato infiammatorio, la stasi del sangue, la emarginazione degli elementi figurati del sangue che viaggiano in sospensione cioè viaggiamo al centro del vaso ma nel processo infiammatorio vengono marginati quindi incominciano a spostarsi verso la periferia del vaso per poi attaccarsi agli endoteli basali, attraversarli e per chemiotassi raggiungono il sito del danno per andare a fagocitare l’agente estraneo cioè l’agente che ha prodotto il danno ed eventualmente a rimuoverlo. Quindi esistono degli eventi di tipo vascolare, degli eventi di tipo cellulare e poi ancora esistono dei mediatori chimici che vengono prodotti localmente e che sono responsabili di tutti questi cambiamenti vascolo ematici e cellulare che si hanno nella risposta infiammatoria.Questa classificazione la si fa in maniera molto schematica ma gli eventi non bisogna pensarli in maniera dissociata ma sono intimamente correlati tra di loro.Iniziamo con il processo di vasodilatazione che si ha e vediamo perché una delle prime risposte che si hanno è la formazione di un edema, ma che cos’è l’edema? Quando si ha un processo infiammatorio, anche con la semplice puntura di una zanzara, si ha una tumefazione, un rossore, è un edema molto localizzato, che cos’è l’edema? È la fuoriuscita di liquido dai vasi verso gli spazi extravascolari, quanti tipi di edema si conoscono? Un edema che non è infiammatorio e un edema che è di tipo infiammatorio; l’edema di tipo non infiammatorio lo si ha quando si hanno delle alterazioni del nostro organismo di due tipi pressioni quella Oncotica o la Pressione Idrostatica, ma qual è la pressione oncotica? È quella che tende a trattenere i liquidi all’interno del vaso e da chi è determinata questa pressione? Dalle proteine plasmatiche prevalentemente dall’albumina plasmatica. La pressione idrostatica è quella pressione che tende a far fuori uscire i liquidi da un vaso quindi si oppone a quella oncotica, nel nostro organismo quando si può avere edema, la fuoriuscita di liquidi negli


spazi interstiziali? O perché si ha un alterazione della pressione oncotica o perché si ha un alterazione della pressione idrostatica, ma quando si ha un alterazione della pressione oncotica? Nelle malattie epatiche croniche e perché? Perché nelle malattie epatiche si ha una ridotta sintesi delle proteine legate alla disfunzione dell’epatocita quindi nelle epatopatie croniche nella cirrosi si osserva un edema, liquido che si versa nel peritoneo (ascite caratterizza la cirrosi epatica) edemi agli arti inferiori, quindi come se fosse interessato in questo processo il rene, infatti è interessato anche il rene in questa patogenesi. Un altro es. di edema è quando le proteine normalmente non vengono riutilizzate ma perse con le urine, quindi tutte le patologie renali come nelle glomerulonefriti si osserva l’alterazione della pressione oncotica per un eccessiva perdita delle proteine. Quindi la pressione oncotica può variare o perché si ha una ridotta sintesi epatica è per disfunzione epatica o perché si ha un aumento della secrezione di queste proteine con le urine quindi aumento della perdita delle proteine (proteinuria) che avviene in alcune patologia renali soprattutto quelle che interessano il glomerulo e in questo caso cosa si osserva? Una riduzione della pressione oncotica quindi si ha un edema quindi si ha un passaggio di liquidi dall’interno del vaso agli spazi extravascolari ma insieme a questi liquidi cosa passa? Passano pochissime proteine plasmatiche perché? Perché gli endoteli non sono lesi quindi quello che si ha, nell’endotelio vasale, è la formazione di un Trasudato che è un ultrafiltrato del plasma in cui si osserva una scarsissima quantità di proteine quindi un liquido a bassa intensità che è direttamente proporzionale alla concentrazione proteica. Nel processo infiammatorio acuto cosa si osserva? Si osserva non solo un alterazione di queste pressioni idrostatica e oncotica ma si ha anche una lesione degli endoteli vasali per cui cosa succede? Che insieme ai liquidi negli spazi extravascolari passano anche le proteine, quindi si ha perdita di proteine quindi l’essudato infiammatorio da che cosa è caratterizzato? Dalla presenza di una certa quantità di proteine. Quindi Trasudato Scarsa presenza di proteine bassa densità, l’essudato è caratterizzato da una certa quantità di proteine quindi presenta una certa densità, per cui nel primo caso parleremo di un edema non infiammatorio nel secondo caso quando si osserva una reazione infiammatoria, un alterazione


degli endoteli vasali parleremo di un edema di tipo infiammatorio. Ma cosa succede più specificatamente nel processo infiammatorio? Si osserva un aumento dell’afflusso di sangue nella regione infiammata si ha un espansione della matrice extracellulare dovuta al passaggio di liquidi perché aumentando la pressione del sangue si ha un aumento della pressione idrostatica quindi i liquidi incominciano a fuoriuscire dal vaso per cui si osserva un espansione della matrice extracellulare, ma oltre a questo si osserva una trasmigrazione degli elementi figurati del sangue, precisamente dei Neutrofili ma a che cosa sono dovute questi processi? Sono dovute ad una legge ben precisa che regola la fuoriuscita dei liquidi dai vasi ed il loro riassorbimento, quindi cosa succede? In condizioni normali di un vaso la pressione idrostatica passa da 32mmHg sul versante arteriolare a 12mmHg sul versante post capillare e che cosa significa questo? Significa che la pressione colloido osmotica si mantiene costante ed è di 25mmHg sia sul versante arteriolare che sul versante delle venule post capillare, quindi che cosa vuol dire? Che tutti i liquidi che vengono persi sul versante arteriolare in condizioni normali vengono riassorbiti sul versante post capillare perché sul versante post capillare la pressione idrostatica è inferiore a quella colloido osmotica e questo è quello che succede quando si sta in piedi per una giornata in piedi e che cosa succede? Si ha una vasodilatazione periferica quindi si ha un gonfiore agli arti inferiori e la perdita di liquidi c’è una certa quantità di liquidi che sfuggono al circolo e quindi si perdono negli spazi extra vascolare, ma se si mette l’arto a riposo i liquidi vengono immediatamente riassorbiti per cui dopo il riposo si ha il riassorbimento e il gonfiore si riduce del tutto e si ha il ritorno alla condizione normale e questo perché? Perché in condizioni fisiologiche si hanno questi equilibri tra le due pressioni. Ma durante il processo infiammatorio cosa succede? Si ha un incremento della pressione idrostatica su tutti i versanti quindi sia sul versante arteriolare sia a livello capillare sia a livello delle venule post capillari quindi la pressione idrostatica cambia e passa da 50mmHg sul versante arteriolare a 30mmHg sul versante delle venule post capillare contemporaneamente poiché si ha perdita delle proteine plasmatiche perché sono lesi gli endoteli nel processo infiammatorio si ha anche una riduzione della pressione


colloido osmotica che passa da 25 a 20mmHg quindi cosa significa questo? Significa che il bilancio pressorio è spostato sempre verso l’esterno quindi in qualsiasi punto del microcircolo i liquidi tenderanno a fuoriuscire dal tessuto perché la pressione idrostatica in ogni punto è superiore alla pressione colloido osmotica e questa alterazione vaso dinamica è responsabile dell’edema che si ha nel processo infiammatorio acuto. Ma com’è stato detto non esistono solo queste alterazioni infatti insieme ai liquidi vengono perse delle proteine e perché vengono perse?Perché si hanno dei danni agli endoteli dei vasi e a che cosa è conseguente questo danno degli endoteli? Può essere conseguenza perché le cellule endoteliali si contraggono oppure si può una retrazione giuzionale oppure si ha un danno diretto endoteliale o indiretto mediato dal rilascio alcuni di mediatori chimici che vengono secreti dai leucociti quindi degli elementi figurati del sangue. Questi due eventi sono maggiormente coinvolti nei cambiamenti delle cellule endoteliali infatti queste diventano più lasse tra loro, perdono le loro giunzioni e attraverso queste finestre che si formano tra una cellula endoteliale e l’altra si ha il passaggio delle proteine dall’interno all’esterno del vaso.Com’è stato detto il danno può essere Diretto e questa risposta endoteliale è detta Risposta Immediata e Sostenuta, quando parleremo dell’aterosclerosi dell’endotelio può subire due tipi di risposta una Rapida Transiente che però è reversibile in seguito ad un danno se questo danno viene rimosso come il fumo di sigaretta può esercitare un danno all’endotelio che è transiente se si rimuove lo stimolo, ma se lo stimolo persiste il danno diventa Immediata perché la risposta endoteliale è immediata però è anche persistente e quando è persistente come avviene nella risposta infiammatoria cosa si osserva? O una necrosi delle cellule endoteliali oppure un alterazione severa delle cellule endoteliali e questa risposta da parte degli endoteli è immediata nel tempo, rapida e persiste fino a che non viene rimosso il danno endoteliale e in che cosa consiste questa risposta da parte degli endoteli? Consiste nel fatto che gli endoteli lesi incominciano a secernere mediatori chimici e queste sono le risposte più immediate da parte delle cellule endoteliali, oppure viene attivata la trascrizione di alcuni geni ma queste sono delle risposte un po più tardive che si hanno nelle cellule endoteliale e perché? La risposta trascrizionale richiede delle ore


per potersi manifestare, una sintesi di nuove proteine richiede del tempo per potersi attuare e quali sono queste proteine che vengono espresse? Sono delle molecole di adesione, molecole che servono a riconoscere, a reclutare una cellula infiammatoria per esempio nel sito del danno oppure dei geni precoci come Myc o FOS o Jun quindi si hanno delle risposte rapide da parte di queste cellule attivate che consistono nel rilascio di sostanze chimiche, di mediatori chimici oppure delle risposte tardive che consistono nell’attivazione di nuovi geni e nella trascrizione di nuovi geni e nella sintesi di nuove proteine.Com’è stato detto il danno endoteliale oltre ad essere diretto può essere anche mediato dai leucociti cioè significa che questi una volta reclutati sul sito del danno a loro volta possono rilasciare delle molecole, dei mediatori chimici, una batteria di mediatori chimici per l’infiammazione che vanno ad attivare le cellule endoteliali in quanto sono espressi dei recettori per questi mediatori chimici e quindi si parla di una attivazione di tipo Indiretto, i lecucociti, gli elementi figurati del sangue, quando sono attivati rilasciano enzimi proteolitici specie reattive del l’ossigeno che possono indurre delle risposte da parte delle cellule endoteliali.Quindi ricapitoliamo: fenomeni vascolari, cambiamenti della pressione idrostatica ed oncotica e quindi aumenta la pressione idrostatica diminuisce la pressione oncotica e questo porta alla perdita di liquidi quindi all’edema e da cosa è formato nel processo infiammatorio? È caratterizzato dalla formazione di un Essudato quindi è caratterizzato da una densità cioè da una quantità di proteine, questo è l’evento più importante, ma perché fuoriescono le proteine? Perché nel processo infiammatorio vengono danneggiate le cellule endoteliali o perché subiscono un danno diretto che persiste fino a che lo stimolo non viene rimosso o perché il danno è indiretto che è causato dal rilascio da parte degli elementi figurati del sangue di mediatori chimici dell’infiammazione o di specie reattive dell’ossigeno o di enzimi proteolitici, ma accanto a questi eventi vascolari però che cosa si innesca nel processo infiammatorio? Si innescano degli eventi di tipo cellulare, come abbiamo visto qual è lo scopo della risposta infiammatoria cioè è quella di portare sul sito del danno quante più cellule competenti possibili e quali sono queste cellule competenti? Sono gli elementi


figurati del sangue e come fanno ad arrivare sul sito del danno? Debbono modificarsi moltissimo perché questi elementi, quali neutrofili e monociti che intervengono soprattutto nella risposta infiammatoria acuta sono delle cellule, come già detto, viaggiano al centro del vaso e durante il processo infiammatorio cosa debbono avere? Delle modificazioni molecolari le quali consentono di fare la Marginazione cioè gli elementi figurati del sangue dal centro del vaso si spostano verso la periferia del vaso. Accanto a questo processo di emarginazione, di spostamento verso la periferia si osserva il Rotolamento sugli endoteli vasali quindi si ha una prima fase di emarginazione e rotolamento. Una seconda fase in cui, una cellula che viaggia in sospensione, deve aderire su questi endoteli lesi quindi si osserva un'altra fase importante di Adesione agli endoteli lesi ed è un adesione ferma in cui l’elemento figurato del sangue decide di “azzeccarsi” o non “azzeccarsi” sugli endoteli lesi. Poi si osserva un processo di Trasmigrazione cioè un passaggio di questi elementi figurati attraverso l’endotelio leso cioè attraverso queste finestre che trovano tra le cellule endoteliali e quindi gli elementi figurati del sangue trasmigrano e questo processo lo si trova scritto con il termine di Diapedesi o trasmigrazione, queste cellule fanno diapedesi o trasmigrazione ed infine c'è la migrazione nei tessuti interstiziali questo processo di migrazione si chiama chemiotassi ed è un po' diverso della migrazione di cui abbiamo parlato nei tumori e nel processo di invasività e di metastasi perchè questo processo è un processo di migrazione direzionale lungo un gradiente chimico e il gradiente chimico è fatto dai mediatori chimici dell'infiammazione oppure ancora dai prodotti modificati dalla parete batterica e tutte queste sostanze sono definite anche sostanze chemiotattiche e servono a creare quel gradiente chimico che fa spostare questi elementi figurati del sangue verso il sito del danno quindi migrazione direzionale lungo un gradiente chimico e questo processo serve a portare queste cellule sul sito del danno dove poi avviene la fagocitosi quindi la distruzione del corpo estraneo o dei batteri o dei virus a secondo dell'agente che ha provocato il processo infiammatorio quindi questi sono gli eventi cellulari. Come avviene il processo di rotolamento, di marginazione, di adesione e di chemiotassi?Si ha una marginazione cioè lo spostamento dal centro del vaso


verso la periferia cioè verso gli elementi figurati del sangue, poi questi elementi figurati del sangue cominciano a rotolare sugli endoteli e le molecole responsabili di questo processo di rotolamento sono le selectine, sono delle proteine che legano gli zuccheri e che viene dato il nome di selectine, dopo di che avete l'adesione di queste cellule sulla parete vasale quindi sulle cellule degli endoteli e questa adesione ferma è mediata dalle integrine e dalle molecole di adesione, poi si ha un processo di trasmigrazione che è mediato da specifiche molecole di adesione che vengono espresse sulla superficie endoteliale o sulla superficie di un neutrofilo o dei monociti poi si ha la chemiotassi e quindi il movimento verso il sito del danno e poi la fagocitosi con l'eliminazione di questo danno. La marginazione rallenta il flusso del sangue durante il processo infiammatorio per cui queste cellule dal centro del vaso si spostano verso la periferia e questo processo è dovuto soprattutto all'alterazione pressoria che avete durante la risposta infiammatoria, le altre fasi invece sono dovute all'espressione di alcune molecole specifiche e queste varie fasi del processo infiammatorio richiedono l'interazione tra molecole che vengono attivate ed espresse sulla superficie dei globuli bianchi e molecole che vengono attivate ed espresse sulle cellule endoteliali, quindi abbiamo il rotolamento, perchè? Perchè le cellule figurate del sangue esprimono delle glicoproteine, una delle proteine è la “Sialyl Lewis X Modified Glicoprotein” esistono delle L-selectine e ancora succede che a livello degli endoteli avviene questo riconoscimento perchè a livello degli endoteli avete l'espressione di selectine di tipo E, quindi E sta per selectine degli endoteli L per le selectine espresse dei leucociti poi ci sono delle selectine espresse dalla piastrine e queste sono le componenti più importanti che intervengono nella risposta infiammatoria quindi avete un riconoscimento tra selectine espresse sui leucociti e selectine espresse sulle cellule endoteliali attivate dal danno o in maniera diretta o in maniera indiretta quindi avete il rotolamento di questi polimorfo nucleari sugli endoteli vasali e dopo si ha l'adesione di queste cellule. L'adesione è mediata dalle integrine e da due molecole di adesione ICAM 1 e VCAM 2, quindi gli le cellule endoteliali attivate si mettono ad esprimere delle molecole di adesione le quali vanno a riconoscere le integrine attivate sulla


superficie dei leucociti quindi anche in questo caso avete il riconoscimento tra molecole di adesione espresse dalla superficie delle cellule endoteliali e molecole di adesione che vengono espresse dalla superficie dei leucociti quindi è un riconoscimento specifico che avviene tra questi due tipi cellulari. Dopo di che si ha la trasmigrazione cioè la diapedesi quindi il passaggio di queste cellule attraverso le cellule endoteliali e questo processo di trasmigrazione è mediato da PeCAM 1, molecole di adesione, e si ha il passaggio di monociti o leucociti attraverso le cellule endoteliali, nel caso che si tratti di monociti questi passano attraverso le cellule endoteliali e una volta arrivati ai tessuti si differenziano come macrofagi. Arrivati a questi tessuti queste cellule devono andare a fare chemiotassi e si devono direzionare verso il sito del danno quindi cambia in queste cellule l'espressione di alcune molecole che sono elementi figurati, da cellule in sospensione diventano cellule adese ma trasmigrano quindi attraversano le cellule endoteliali e recuperano negli spazi extravascolari i loro fenotipi migratori e vanno sul sito del danno e fanno la fagocitosi. Questi processi di cui si è parlato sono importanti perchè la deficienza di molecole coinvolte nei processi di adesione, trasmigrazione sono responsabili di alcune malattie che sono la LAD di tipo 1 e la LAD di tipo 2, sono delle malattie dovute alla compromissione del rotolamento della diapedesi degli elementi figurati del sangue, queste malattie sono state studiate in topi transgenici ma in realtà sono tipici in alcuni bambini che dopo pochi mesi dalla nascita manifestano alcune disfunzioni e soprattutto la compromissione consiste nel fatto che questi bambini non hanno un efficiente risposta infiammatoria, cioè hanno infezioni ricorrenti, perchè i neutrofili non possono fare adesione e trasmigrazione in maniera efficace, i neutrofili di questi pazienti possono rotolare ma non aderire agli endoteli lesi, e se si trasfonde in questi pazienti dei neutrofili normali questi bambini recuperano a pieno la risposta infiammatoria. A che cosa sono dovute queste malattie? Sono dovute a delle alterazioni delle integrine, la Lad di tipo 1 è caratterizzata dall'assenza delle integrine sui neutrofili oppure può essere caratterizzata da mutazioni nella regione N terminale delle Beta integrine, mutazioni in queste regione impediscono il cluster delle integrine per cui le integrine non possono essere attivate, la


funzione normale è recuperata in seguito alla trascrizione delle cellule di pazienti di Cdna che codifica per la catena beta delle integrine. Dopo di che queste cellule una volta che hanno trasmigrato fanno questa chemiotassi, questa migrazione direzionale. La trasmigrazione è coinvolta nella patogenesi delle metastasi ma anche in altre malattie umane come l’aterosclerosi, l’osteoporosi e alterazioni di questo processo sono coinvolte anche in anomalie congenite nel differenziamento del sistema nervoso centrale e del cuore, nel fenomeno di guarigione delle ferite rigenerazione tissutale e il processo di migrazione cellule è coinvolto nel modellamento dei tessuti quindi sono una miriade i processi in è coinvolta la migrazione della cellula, è un processo altamente conservato dalle specie più semplici alle specie più conservate e questo processo serve ai globuli bianchi, ai neutrofili e ai monociti perchè è un processo della migrazione che serve a portare questi elementi figurati del sangue sul sito del danno e come avviene questo processo durante la risposta infiammatoria? Avviene mediante chemiotassi e cosa significa chemiotassi? La chemiotassi è un processo di migrazione direzionale lungo un gradiente chimico, il gradiente chimico in caso dell’infiammazione è fatto da segnali chimici e quali sono questi segnali chimici ? Sono le chemiochine le quali si legano a dei specifici recettori che sono i recettori per le chemiochine, le chemiochine e i recettori per le chemiochine costituiscono dei bersagli terapeutici importanti soprattutto per la cura delle malattie infiammatorie non tanto a quelle acute ma quelle croniche che oggi vengono trattate solo con degli antiinfiammatori di tipo steroideo per es. i cortisonici ma in realtà non esistono delle terapie specifiche per le infiammazioni croniche e questo è uno dei motivi che ha reso sia le chemiochine che i recettori per le chemiochine molto attraenti dal punto di vista farmacologico, l’importanza di queste molecole risale al 1996 quando si è scoperto che un recettore delle chemiochine è il corecettore del virus Hiv di tipo 1 questo significa che questo virus dell’Hiv si serve di un recettore per le chemiochine per poter entrare nelle cellule e poterle infettare quindi trovare la terapia e bloccare questo recettore significava anche trovare una terapia per impedire al virus dell’Hiv di infettare le cellule dell’ospite quindi dar luogo all’AIDS con tutta la sequela di eventi che si ha in questa malattia.


Quindi queste molecole sono coinvolte nei processi di angioflogosi, nei tumori, nella progressione tumorale, nell’Aids, nell’asma, nei processi di angiogenesi e neoangiogenesi quindi guarigione delle ferite e metastasi e nelle infiammazioni croniche come per es. l’artrite reumatoide. Di quante classi sono le chemiochine? Le chemiochine sono innanzitutto di natura peptidica, sono divise in tre classi: le Alfa che hanno un core costituite da due residui di cisteina intervallati da un aminoacido che viene dato la sigla di X perchè può essere un amminoacido a caso e vengono rilasciate dai neutrofili; poi avete le chemiochine di classe Beta che sono costituite da un core centrale di due cisteine e vengono rilasciate dai monociti, dai basofili, dai linfociti, dagli eosinofili e infine dalle chemiochine di tipo gamma che hanno un solo residuo di cisteina e vengono rilasciate dai linfociti. Esistono altre chemiochine e chemio attrattanti in natura, esistono oltre alle chemiochine dei fattori chemiotattici potentissimi vengono liberati durante l’attivazione del complemento, C5a per es che viene liberata in seguito all’attivazione del complemento è uno dei fattori chemiotattici più potenti dal punto di vista chimico. Altri fattori chemiotattici sono i peptidi modificati che derivano dalla parete batterica quindi non sono solo le chemiochine a stimolare questo processo di migrazione direzionale ma anche molecole che derivano o da una parete batterica oppure vengono attivate durante una risposta infiammatoria. Le chemiochine funzionano attraverso dei recettori specifici ma c’è una promiscuità delle chemiochine e dei recettori per le chemiochine e significa che un recettore può legare diverse chemiochine e può essere espresso in più tipi cellulari, una cellula che esprime un sol tipo di recettore può legare diverse chemiochine e questa promiscuità serve a reclutare sul sito del danno quante più cellule infiammatorie possibili proprio perché non esiste il meccanismo specifico che è tipico dei recettori per gli ormoni per es. i quali legano quell’ormone e non un altro e questo non avviene per le chemiochine quindi attraverso questa promiscuità biochimica più tipi cellulari vengono reclutati verso il sito del danno e questo meccanismo serve ad amplificare un reclutamento cellulare. Una volta che queste cellule sono arrivate sul sito del danno come avviene questa attivazione dei recettori per le chemiochine e sono solo le chemiochine che stimolano questo processo chemiotattico?


Esistono anche altri fattori oltre alle chemiochine e sono i fattori di crescita e di sopravvivenza cellulare che inducono la chemiotassi attraverso i propri recettori di membrana e uno di questi va ad agire sui monociti e macrofagi e questo Csf 1 (coling stimulator factor) e riconosce un recettore specifico espresso sulla superficie dei macrofagi, questo fattore è importante perché non solo conferisce ai macrofagi questa capacità di muoversi di fare chemiotassi ma conferisce a queste cellule anche la sopravvivenza quindi i macrofagi in assenza di questo fattore di Csf 1, questo Csf1 non è coinvolto solo nei processi di invasività tumorale ma Csf1 è importantissimo nella patogenesi dell’aterosclerosi in cui questi processi si ripetono allo stesso modo cioè l’aterosclerosi può essere vista una risposta infiammatoria a un danno endoteliale. Il Csf1 è importante e topi che non producono il Csf1 hanno una ridotta capacità di sviluppare le placche ateriose, quindi questo fattore è un fattore chemiotattico e di sopravvivenza per i monociti macrofagi, ma come questo segnale che viene portato dalle chemiochine oppure dai fattori di crescita come viene trasferito all’interno della cellula? Il cambiamento extracellulare cosa induce? Induce un interazione tra il ligando e il recettore di membrana e questa interazione attiva una serie di segnali biochimici della cellula e questi segnali biochimici si modificativo in un processo biologico e quindi di risposte biologiche e in questo caso la risposta biologica qual è? È la migrazione della cellula, ma perché avvenga questa risposta quali sono le modificazioni che la cellula deve subire? Sono delle modificazioni a carico dell’organizzazione del citoscheletro. Come fanno a funzionare le chemiochine e i recettori per le chemiochine? Le chemiochine vengono riconosciute da recettori per i fattori chemiotattici che sono associate a della proteine G eterotrimeriche, sono dei recettori a sette eliche alfa eliche trans membrana che sono associate a delle proteine G eterotrimeriche di membrana, quando si ha il legame tra chemiochina e recettore cosa succede? Succede che si ha l'attivazione della proteina G eterotrimerica per cui la subunità alfa si stacca delle belta-gamma e si ha la produzione di secondi messaggeri intracellulare, ancora che cosa fanno questi recettori per le chemiochine una volta che sono state attivati dalle chemiochine? Vanno ad attivare a loro volta delle specifiche


isoforme di fosfatidilinositolo-3-chinasi e quale in specifico? La fosfatidilinositolo-3-chinasi di classe 1b che è la fosfatidilinositolo-3-chinasi di tipo gamma quindi l’isoforma gamma. Mentre tutte le altre isoforme alfa, beta sono coinvolte nei processi di proliferazione e quindi nei tumori, nelle malattie metaboliche come il diabete e in altri processi, vi è un'altra isoforma fosfatidilinositolo-3-chinasi gamma che è predominante nei leucociti ed è attivata in seguito all’attivazione delle proteine G eterotrimeriche che conseguono al legame tra chemiochine e i recettori per le chemiochine quindi questa molecola che produce anch’essa i fosfolipidi PIP3 a che cosa serve? A mediare il segnale infiammatorio il prodotto indotto dalle chemiochine e soprattutto quale segnale? Quello della chemiotassi. Questa isoforma gamma funziona, in seguito all’attivazione delle proteine G eterotrimeriche, perché viene reclutata dalla subunità beta-gamma sulla membrana delle cellule ad es neutrofili e monociti e quando reclutata vicina la membrana dei neutrofili e monociti produce PIP3 che a sua volta va a reclutare delle molecole che contengono dei domini di PH (Pleckstrin Homology domain) quindi domini di omologia con la plecstrina, ma quali sono queste molecole che contengono i domini PH? sono quasi tutti substrati di questa fosfatidilinositolo-3-chinasi come la serin-tronin-chinasi Akt è una molecola che viene reclutata in seguito alla formazione di PIP3 perché possiede un dominio PH quindi un dominio per l’omologia della plecstrina. Ma se si inibisce questo enzima fosfatidilinositolo-3-chinasi si ha un inibizione della chemiotassi per esempio e nei neutrofili si esegue un knockout fosfatidilinositolo-3-chinasi si ha che nel 50% sono inibiti della loro chemiotassi, la stessa cosa accade ai macrofagi che presentano un isoforma gamma di fosfatidilinositolo-3-chinasi che non funziona, che ha perso la parte catalitica infatti viene definita come Akd e questi macrofagi non sono capaci di fare chemiotassi si ha il 50/70% di inibizione della chemiotassi. Se si microinietta nei macrofagi degli anticorpi che bloccano l’isoforma beta-delta della fosfatidilinositolo-3-chinasi si ha un inibizione della migrazione dei macrofagi indotta da CSF1, lo stesso se si somministra a dei neutrofili degli inibitori chimici si ha l’inibizione della migratine dei necrofili, quindi attraverso degli esperimenti fatti o con degli inibitori chimici o con degli anticorpi bloccanti questi enzimi oppure in


modelli di topo che hanno il knockout delle isoforme di questi enzimi si è visto che in vivo l’attivazione di questi enzimi è coinvolta nei processi di chemiotassi e di migrazione cellulare. Però la cosa non è così semplice in quanto quando si ha il processo di chemiotassi durante la risposta infiammatoria abbiamo detto che avviene lungo un gradiente chimico questo significa che la cellula deve sentire questo gradiente quindi la cellula infiammatoria deve sentire una minima variazione e quindi potrebbe far pensare che i recettori per le chimiochine sulle cellule infiammatorie sono espresse sul versante guida cioè dal lato in cui la cellula deve muoversi, quando una cellula si muove questo il movimento è caratterizzato dal fatto che la cellula ha un versante che è un versante guida di questo movimento poi ha un fronte poi delle porzioni laterali e questo fa pensare che il recettore per le chemiochine sono tutti localizzati dove arriva il segnale chemiotattico, quindi si somministra una sorgente chemiotattica alla cellula e i recettori per le chemiochine si trovano sul fronte guida e la cellula avverte quei segnali perché i recettori stanno disposti lì dal punto di vista spaziale invece non è così. Nella maggior parte delle cellule infiammatorie i recettori per le chemiochine sono distribuiti su tutta la superficie della cellula quindi la chemiochina può andare a funzionare su qualsiasi punto della cellula perché i recettori sono ugualmente distribuiti e cos’è che fa la differenza? Perchè la cellula che si muove che ha questo fronte guida e riesce a muoversi lungo quel gradiente chimico? Non perchè il recettore per le le chemiochine sono localizzati in un certo punto perché è sul fronte guida quindi dove la cellula sente il segnale e attiva i suoi recettori succede che vengono reclutate le proteine che contengono i domini PH, non sono le chemiochine che vengono ad essere modificate spazialmente in seguito all’arrivo del segnale chemiotattico ma quello che cambia è la distribuzione spaziale delle molecole che devono essere reclutate quindi delle molecole che contengono i domini PH.C’è anche un’altra organizzazione importante quindi si ha chemiochina, attivazione dei recettore, attivazione delle GTP eterotrimeriche di membrana, reclutamento della fosfatidilinositolo-3-chinasi isoforma gamma, liberazione di PIP3 e queste PIP3 vanno a reclutare queste proteine che contengono i domini PH, ma c’è solo questa distribuzione? No ma esiste anche la distribuzione


di altre molecole e quale è? Una cellula che sta migrando contiene una fasfatasi Pten la quale si dispone ai bordi delle cellule che stanno migrando e si depone ai bordi e non all’estremità perché questa fosfatasi spegne il segnale della fosfatidiilinositolo-3-chinasi e se durante il processo migratorio fosse disposto sul fronte guida della cellula il segnale delle chemiochine non potrebbe proprio attivarsi perché sarebbe immediatamente spento da questa molecola quindi il processo di chemiotassi non solo richiede l’attivazione di queste molecole ma richiede anche un esatta distribuzione spaziale nella cellula che deve fare la chemiotassi e questo significa che le molecole attivatorie sono tutte posizionate sulle estremità guida della cellula e la cellula che fa migrazione è una cellula molto polarizzata che ha questo fronte e la parte posteriore, le cellule che spengono il segnale invece sono tutte disposte quasi tutti ai bordi della cellula e sul retro della cellula che è responsabile dello scollamento della cellula si ha una serie enzimi proteolitici e delle Map chinasi che sono responsabili dello scollamento della parte posteriore; quindi quando si somministra ad un elemento figurato del sangue e si stimola con dei fattori chemiotattici o alcuni fattori del complemento si ha una ridistribuzione spaziale delle molecole che sono responsabili di questo processo. I recettori per le chemiochine sono diffusi su tutta la superficie cellulare. Questo processo di migrazione richiede diverse tappe e sono: la estensione di lamellipodi, la formazione di nuove adesioni sulla matrice extracellulare, la produzione di enzimi che degrada la matrice extracellulare, la contrazione del corpo cellulare e la ritrazione della parte posteriore e in questa maniera la cellula avanza lungo questo gradiente chimico quindi bisogna pensare a un’interazione dinamica tra matrice, gradiente chimico e cellula che deve muoversi lungo questo gradiente, che cosa richiede tutto questo? Richiede una riorganizzazione dell’actina citoscheletrica e come fa la cellula a riorganizzare questa actina citoscheletrica e quali sono le manifestazioni di questa riorganizzione ? Sono 3: la formazioni di filopodi e questi filopodi sono delle protrusioni della cellula, del citoscheletro e servono a sentire lo stimolo chemiotattico quindi la cellula sente lo stimolo chimico e si muove lungo questo gradiente perché vengono emessi delle estroflessioni della cellula che si chiamano filopodi e sono


formati da protrusioni di actina citoscheletrica; la riorganizzazione del citroscheletro avviene perché nella cellula si formano degli ispessimenti periferici e servono alla cellula per poter stabilire dei contatti con la matrice extracellulare che prendono il nome di lamellipodi e poi ancora la cellula si deve muovere lungo questo gradiente chimico e il movimento lungo questo gradiente chimico e il movimento è garantito dal fatto che si formano dei fascetti di actina che sono chiamate stress fiber e sono fascettini dell’actina che si avvicinano tra loro e fanno da motore dalla cellula quindi i filopodi a servono a sentire il gradiente, i lamellipodi servono a stabilire il contatto con la matrice e le stress fiber servono alla contrazione del corpo cellulare. Quali sono le molecole coinvolte in questo processo? Sono 3: una piccola proteina legante il GTP chiamata Cdc42 responsabile invece della formazione dei lamellipodi è la piccola proteina Rac e responsabile delle stress fiber è la piccola proteina Rho, la prima di queste ad essere identificate è proprio Rho che significa Ras Homology e perché fu definita così perché assomigliava molto a ras e quindi le fu dato il nome di ras homology poi successivamente vennero identificate le altre due e si vide che erano coinvolte nei processi di migrazione cellulare e anche di invasività e metastasi.


Castoria 1.7 (Martedì 23 Aprile 2013)

Chemiotassi, Fagocitosi e DegranulazioneMediatori Chimici Dell'Infiammazione

Il processo di chemiotassi è attivata da diversi segnali e i segnali più importati sono quelli che arrivano dalle chemiochine che funzionano attraverso i loro recettori di membrana a sette alfa eliche che sono accoppiate dalle proteine G eterotrimeriche che vengono attivate in seguito al legame della chemiochina con il recettore queste proteine attivate GTP eterotrimeriche cosa fanno? Dissociano le subunità alfa dalla subunità beta-gamma e la subunità beta-gamma va a reclutare ed attivare un isoforma specifica di fosfatidilinositolo-3-chisani che è la fosfatidilinositolo-3-chisani gamma e proprio su questa isoforma si stanno studiando degli inibitori specifici per poter intervenire sulle terapie dei processi infiammatori cronici, inibitori specifici perché? Esistono varie forme di fosfatidilinositolo-3-chinasi e infatti il problema è proprio di andare ad intervenire specificamente su queste isoforme. Si è detto che questi recettori per queste chemiochine sono disposti lungo tutta la membrana delle cellule infiammatorie quindi non esistono delle zone specifiche di concentrazione di questi recettori ma il punto fondamentale è che quando a queste cellule arriva uno stimolo chemiotattico i recettori vengono attivati, viene attivala la fosfatidilinositolo-3-chinasi e questi fosfolipidi PIP3 reclutano delle proteine specifiche che sono delle proteine che contengono dei domini di plextrina o PH e sono queste proteine che poi vanno ad attivare il processo di migrazione, ma come si svolge il processo di migrazione, come viene trasmesso il segnale? Il segnale viene trasmesso perché queste proteine reclutate dai fosfolipidi prodotti dalla PI3-chinasi vanno ad attivare degli scambiatori guaninici che sono detti anche Gef e cosa fanno questi scambiatori guaninici all’interno della cellula? Vanno ad attivare delle piccole proteine leganti il GTP della famiglia RAS. Il primo membro di queste proteine che fu trovato è stato Rho (RAS homology) è una piccola proteina legante il GTP ed è stato identificato per errore perché si cercavano delle proteine omologhe RAS che intervenissero prevalentemente sulla proliferazione e sulla sopravvivenza delle cellule e in realtà da queste cellule trasformate vennero identificate


prima il capostipite della famiglia delle piccole proteine leganti il GTP simil RAS e a questo membro venne dato il nome di Rho. Successivamente vennero identificate altri membri della famiglia come Cdc42 Rac che sono espresse largamente su tutte le cellule perché queste proteine controllano numerosi processi biologici primo di tutti il processo di migrazione cellulare intervengono anche in altre fai dell’infiammazione come nella fagocitosi. Come fanno queste piccole proteine leganti il GTP ad andare ad agire sul citoscheletro? Perché una cellula si muove quando è capace di migrare quando riorganizza il suo citoscheletro e questo significa che deve essere guidata lungo un gradiente chimico in questo caso, perché stiamo parlando di chemiotassi e quindi dalla superficie cellulare vengono emanate delle protrusioni di filamenti di actina filamentosa che sono i Filopodi che servono a captare il gradiente chimico, poi si formano i Lamellopodi che sono dei fascetti paralleli di actina che si dispongono alla periferia della cellula e che servono alla cellula per stabilire dei punti di contatto con la matrice e poi si formano dei stress fiber che sono sempre dei fascetti actina all’interno del corpo cellulare che fanno da motore alla cellula conferendogli la capacità migratoria. Mediante tecnica di immunofluorescenza si nota che il citoplasma è formato da microtubuli formati da tubulina, microfilamenti formati da actina filamentosa, filamenti intermedi e una delle sostanze che la compongono è la vinculina che ad es. è molto alterata nei tumori invasivi umani e questa proteina è fosforilata in tirosina e riorganizza i filamenti intermedi del citoscheletro così la cellula è più prona alla migrazione e all’invasività, in condizioni normali quando una cellula è a riposo si nota, ad es. in fibroblasti di topo, che l’actina si dispone sotto forma filamentosa e regolare; quando si trattano queste cellule con uno stimolo che induce la migrazione cellulare si nota che i fibroblasti assumono un fenotipo del tutto diverso rispetto alla condizione di quiescenza e infatti si notano delle protrusioni di filopodi che la cellula caccia per captare lo stimolo, in laboratorio per evidenziare l’actina viene colorata con la Falloidina (sostanza tossiche presente nei funghi) fluorescente che viene accoppiata o a dei fluorocromi rossi (texas red) che emanano un colore rosso quando vengono eccitati oppure a dei fluorocromi verdi (fluoresceina verde) che quando vengono eccitati emanano


un colore verde e quindi si ha la visualizzazione dell’actina citoscheletrica. Questi studi di laboratorio sono stati importantissimi in quanto si è andato a vedere come l’attivazione di queste piccole proteine leganti il GTP modifica il citoscheletro delle cellule. Ma come vengono regolate queste 3 proteine? Prendiamo come es. stimolazione da parte di un fattore chemiotattico potentissimo che è il CFS1 il quale riconosce un suo recettore specifico sulla superficie dei macrofagi, è un recettore per il CSF1 è un recettore a tirosinochinasi il quale quando attivato dal CSF1 cosa fa? Si autofosforila nei due residui in tirosina, ingaggia delle docking protein o delle proteine adattatrici e queste proteine adattatrici che contengono domini SH2 vanno ad attivare la fosfatidilinositolo-3-chisani la quale libera i PIP3 e a catena è sempre la stessa, questi PIP3 liberati reclutano degli scambiatori guaninici sulle membrane plasmatiche e tra questi scambiatori uno dei più importanti è Tiam1 e Vav facilitano la conversone di queste proteine in forme attive quindi i legami al GTP in genere questi scambiatori vengono attivati attraverso dei meccanismi di fosforilazione quindi si attivano quando vengono fosforilati e in questa maniera viene facilitata l’attivazione delle tre proteine Cdc42, Rac e Rho con la formazione di filopodi, lamellipodi e complessi focali, la contrattilità del corpo perché si ha la formazione di stress fibres e infine polarizzazione e migrazione cellulare che sono che sono i 2 eventi biologici importanti: la polarizzazione serve alla cellula per essere guidata lungo il gradiente migratorio e gli altri due processi servono proprio alla cellula per muoversi, bisogna immaginare quando noi mettiamo il piede a terra. Quindi la formazione di complessi focali che servono a prendere contatto con la matrice scollamento della parte posteriore e quindi avanzamento della cellula in questo processo migratorio. Quindi il fattore CFS1 è un fattore chemiotattico che interviene durante i processi infiammatori quindi quando si trova scritto nei libri che le chemiochine attivano la chemiotassi lo fanno in questa maniera. È chiaro che tra l’attivazione del fattore CSF1 e l’attivazione di queste piccole proteine leganti il GTP vi è tutta quella catena di eventi di cui si è parlato a proposito dei tumori, delle metastasi.Alcuni anni fa in un laboratorio inglese successe una cosa importantissima in quanto scoprirono la maniera con la quale le


cellule migrano. E che cosa fecero? Presero queste piccole proteine (Rho, Rac e Cdc42) attivate leganti il GTP e quando scoprirono che queste proteine erano molto simili a RAS presero queste proteine, introdussero nel DNA che codificano queste proteine, una mutazione attivante per cui su queste forme di proteine legavano costitutivamente il GTP quindi erano sempre attive, dopo di che le micro iniettarono nelle cellule (fibroblati) e si vide che si aveva la formazione di lamellipodi e si osservava inoltre che le cellule assumevano la forma a “Pizzetta” con il cornicione che serva alla cellula per creare dei punti di contatto, quindi quando micro iniettavano delle forme attive di Rho notavano la formazione di fascetti di actina a cui si diede il nome di Stress Fibers o fibre da stress cellulare o fibre da sforzo cellulare che servono per la contrazione del corpo. Quando micro iniettavano la forma attiva di Cdc42 si notava la formazione di filopodi, quindi con questo esperimento si giunse alla conclusione che per ognuna di queste proteine esisteva una specifica funzione cellulare quindi una di queste proteine mediava un processo biologico specifico e che l’organizzazione di queste proteine nell’attività di queste proteine è indispensabile per coordinare il processo di migrazione cellulare questi 3 eventi non avvengono separatamente, Cdc42 e Rac vengono attivati contemporaneamente nella cellula però bisogna pensare che poiché il processo di migrazione è un processo altamente coordinato l’attivazione di queste proteine non può essere prolungato nel tempo, queste proteine debbono attivarsi e debbono spegnesi continuamente perché l’eccessiva attivazione di queste proteine che cosa può portare? Può portare a due effetti paradossali o al fatto che la cellula si muove e diventa una cellula in sospensione e questo è un processo che avviene nei processi di invasività o di metastasi quindi diventa una cellula non adesa alla matrice, oppure che se si ha un attivazione persistente, l’esempio di Rac, la cellula addirittura si blocca e non riesce più ad avanzare nel processo di migrazione e perché si ha questo effetto paradossale quando si ha Rac attivato in una cellula normale per molto tempo? Perché Rac è responsabile non solo della formazione dei lamellipodi ma anche dell’assemblaggio dei complessi focali che sono quei complessi posti sulle membrane cellulari formate da una serie di proteine tra cui la chinasi factory che servono a stabilire il


contatto con la matrice. Per cui se si ha un attivazione eccessiva di Rac si formano continuamente adesioni focali che servono a far aderire la cellula alla matrice per cui la cellula non è più capace di “scollarsi” dalla matrice e di migrare. Ma come vengono regolate queste 3 proteine leganti il GTP e servono solo migrazione di queste proteine? Prima di tutto queste proteine non servono solo alla migrazione cellulare perché controllano il ciclo cellulare in genere lo controllano positivamente come fa Ras ma ci sono delle condizioni della cellula in cui queste proteine possono agire mandando la cellula in apoptosi ad esempio se si ha una stimolazione eccessiva di una cellula da parte di un fattore di crescita la cellula attivando alcune di queste proteine può andare incontro a dei processi di apoptosi o quanto meno viene arrestato il ciclo cellulare. Generalmente l’attivazione di queste proteine ha una funzione positiva sulla trascrizione di alcuni geni che sono coinvolti nella transizione G1 S, queste piccole proteine agiscono sempre a livello trascrizionale modificando l’espressione di alcuni inibitori del ciclo cellulare e soprattutto di P21 e P27 quindi, hanno sicuramente azione sulla migrazione ma regolano anche il ciclo cellulare, ma sono solo questi i processi? No! Regolano tutto il processo infiammatorio perché intervengono nei processi di fagocitosi, regolano l’apoptosi, la fagocitosi da parte dei macrofagi avviene attraverso l’attivazione delle piccole proteine leganti il GTP; intervengono nel traffico delle vescicole cellulari e questo richiede delle modificazioni del citoscheletro delle cellule e infatti dipendono anche dal segnale dell’insulina perché modulano il passaggio dei trasportatori del glucosio da citoplasma verso la membrana quindi fanno un innumerevole numero di azioni per cui sono coinvolte nei processi metabolici, infiammatori, sono coinvolte nei processi di trasformazione neoplastica. Di questa famiglia ne esistono una miriade e sono espressi in tutti gli organismi da quelli inferiori a quelli superiori quindi sono proteine filogeneticamente conservate proprio perché servono ad un processo che filogeneticamente conservato come quello della migrazione. La super famiglia di proteine Rho presenta una sotto famiglia che sono Rho, Rac, Cdc42, Big2 RhoBTB, all’interno delle varie sottofamiglie esistono varie isoforme di Rho si conoscono almeno 3 isoforme A, B, C di Rac esistono almeno 3 isoforme 1, 2 , 3 e lo stesso vale per Cdc42.


Hanno funzioni diverse nella cellula ed hanno soprattutto la diversità della funzione che non è tanto sul processo di migrazione ma quanto nell’attivazione del ciclo cellulare ad es. Rho B è considerato come un vero e proprio oncosoppressore che blocca il ciclo cellulare. Ma come vengono regolate queste proteine? Vengono regolate ne più ne meno come viene regolata l’attività di RAS, queste proteine sono complessate nel citoplasma della cellula con un inibitore che generalmente viene definito GDI il quale tiene le proteine costrette in una forma inattiva, ma cosa succede quando arriva lo stimolo dall’esterno? E quale può essere? Sia un fattore chemiotattico sia quello delle integrine infatti queste proteine sono anche attivate dalle integrine e in seguito allo stimolo si ha la dissociazione di questi complessi per cui queste piccole proteine si dissociano dall’inibitore e sono libere di funzionare nel citoplasma. Come detto il segnale va ad attivare gli scambiatori guaninici tra cui i più importanti sono VAV e Tiam1, attivare in che senso? Questi scambiatori vengono fosforilati e quindi l’attivazione di questi scambiatori reclutano queste piccole proteine leganti il GTP sulle membrane plasmatiche e qui queste proteine vengono attivate e questo cosa significa? Che si mettono a legare il GTP. Queste proteine sono dotate di un intrinseca attività GTPasica e questa attività viene attivata a sua volta e regolata da un altro gruppo di proteine intracellulare che sono le Gap (GTPase Activating Protein) attivando l’attività GTPasica intrinseca di queste piccole proteine leganti il GTP quindi catalizzano la conversione di Rac GTP in Rac GDP e quindi il ciclo si chiude per cui queste proteine vengono rapidamente attivate e altrettanto rapidamente vengono disattivate, quindi ciclano all’interno della cellula da uno stato di attivazione e inattivazione quando arriva il segnale ovviamente questo ciclo non è costitutivo quindi viene attivato da recettori e quindi da segnali recettori-ligando ma esistono degli inibitori naturali e come sono state studiate con questi meccanismi di regolazione? In realtà se ne conoscono pochi di inibitori naturali, l’unico inibitore che si conosce e viene usato in laboratorio per studiare queste proteine è la tossina botulinica e come fa a portare la morte del paziente in rapidissimo tempo? Questa tossina è inattiva e quindi da tutta quelle sequela di eventi che accompagnano il botulino e quindi si ha un inibizione delle funzioni citoscheletriche e questo è l’unico inibitore che si


conosce al momento gli altri sono quasi tutti di sintesi. Ma ora, come fanno queste proteine una volta attivate ad andare a raggiungere il citoscheletro? Lo fanno attraverso proteine target tra cui le più importanti abbiamo la chinasi Pak che pesa 21mila e che organizza l’actina citoscheletrica. Ma quali sono questi target intracellulari di queste proteine? È stato detto che Rac e Cdc42 vengono attivate simultaneamente nelle cellule ed esiste un crosstalk fra queste due proteine perché riconoscono dei substrati simili e uno dei substrati più importati si di Rac che di Cdc42 è la serinchinasi Pak che è mutata in molti tumori umani, la quale va ad agire sulla chinasi Lim e questa chinasi inibisce la cofillina e quindi inibisce la depolarizzazione dell’actina quindi viene facilitata la polimerizzazione dell’actina; altro substrato importante che viene riconosciuto sia da Rac che da Cdc42 sono due proteine della famiglia VAV come Wasp che è mutata in una malattia da immunodeficienza congenita che si chiama Sindrome di Wiskott Aldrich che si presenta sin dai primi mesi di vita ed è caratterizzata da una mancata efficienza della risposta infiammatoria da parte degli elementi figurati del sangue, proprio in questa malattia il substrato per Cdc42 e di Rac è mutato, e a che cosa serve questa proteina? Serve ad attivare il complesso Arp2-3 che è responsabile della polimerizzazione dall’actina quindi da un lato si ha la polimerizzazione dell’actina attraverso l’attivazione del complesso Arp2-3 da l’altro l’inibizione della cofillina e quindi la inibizione della depolimerizzazione dell’actina poi l’actina si dota di una proteina Capping una specie di “cappuccio” e questo viene facilitato dall’azione di un isoforma di fosfatidilinositolo-2-chinasi che promuove la formazione di PIP2 i quali vanno ad indurre il Capping dei filamenti di actina e questo è il meccanismo di Rac e di Cdc42.Ma quali sono i target più intracellulari di Rho? Sono diversi, soprattutto Rho chinasi che dipende da Rho e nei trailers clinici nei tumori umani vengono usati degli inibitori specifici prodotti da case farmaceutiche e cosa fa Rho chinasi? Va ad agire sulla fosfatasi della catena leggera della miosina inducendo la contrazione delle cellule inoltre la chinasi va ad agire su un'altra chinasi Lia che inibisce la depolimerizzazione dell’actina inoltre Rho attraverso questa molecola Lia va ad agire direttamente facilitando la formazione dello Stress Fibers quindi questo è il meccanismo con


cui Rho induce la contrazione cellulare quindi con questi due intermedi molecolari Lia e Rho.In conclusione, per tornare al discorso del processo infiammatorio, la chemiotassi viene controllata nei leucociti dalle proteine G eterotrimeriche che quando vengono attivate attraverso la stimolazione con le chemiochine reclutano l’isoforma di Pi3-chinasi gamma (anche qui esistono degli inibitori specifici) questa isoforma a sua volta va ad attivare gli scambiatori di gruppi guaninici i quali vanno ad attivare Rac e Cdc42 o anche Rho. L’attivazione di Rac Cdc42 porta da un lato l’attivazione della Pak chinasi che provoca il disassemblaggio della miosina 2, organizzazione dell’actina filamentosa e contrazione della miosina 2; mentre l’attivazione della via di Wasp2-3 porta all’attivazione del complesso Arp2-3 e all’organizzazione dell’actina filamentosa. In fine queste risposte sono responsabili delle modificazioni citoscheletriche e quindi che caratterizzano la chemiotassi.Quindi per concludere questa parte, quali sono gli eventi cellulari? Marginazione, rotolamento, arresto della cellula, adesione sugli endoteli lesi, dopodichè si ha la polarizzazione, la diapedesi la trasmigrazione che avviene perché avviene un riarrangiamento delle funzioni tra le cellule endoteliali dopodiché si ha la migrazione negli spazi interstiziali e il reclutamento di queste cellule infiammatorie sul luogo del danno attraverso questo processo di chemiotassi.A questo punto cosa deve fare questa cellula infiammatoria? Deve riconoscere il corpo estraneo, lo deve attaccare e lo deve distruggere il termine fagocitosi si riferisce al fatto che la cellula infiammatoria o Neutrofili o Macrofagi ingeriscono e distruggono questi corpi estranei, da quante fasi è caratterizzato questo processo? Da tre fasi una fase di attacco, una di ingestione e poi una fase di Esecuzione della morte. Ma cosa avviene durante questi processo di fagocitosi? Avviene che le particelle estranee come batteri, virus vengono distrutti in quale maniera? Attraverso dei processi di Degranulazione da parte dei Neutrofili i quali contengono una serie di granuli, alcuni sono specifici altri aspecifici e soprattutto attraverso la liberazione quantità enorme di specie reattive dell’ossigeno. Quando si è parlato dei ROS si è detto che quando si producono queste specie reattive dell’ossigeno si


possono produrre o durante processi fisiologici come normali processi di respirazione cellulare fanno produrre i ROS ma vendono prodotti anche durante particolari situazioni patologiche e cioè durante la fagocitosi delle cellule neoplastiche oppure durante i processi di invecchiamento cellulare oppure durante i processi infiammatori, e quand’è che vengono prodotte queste specie reattive dell’ossigeno? Soprattutto durante la fagocitosi di quel corpo estraneo. Ma come avvengono questi processi? In primis il processo di fagocitosi è stato descritto nel 1901 a Parigi e si osservava un macrofago che aveva fagocitato un bacillo del carbonchio. I meccanismi che regolano questo processo sono stati solo più recentemente studiati, e come fanno i corpi estranei ad essere fagocitati? Prendiamo il caso dei batteri i quali vengono opsonizzati con degli anticorpi e quindi a livello della cellula che fagocita, questo complesso batteri-opsonizzati viene riconosciuto da un recettore per il frammento cristallizzabile degli anticorpi, oppure questi corpi estranei vengono riconosciuti perché sulle cellule infiammatorie (neutrofili e macrofagi) nei processi acuti, hanno un recettore per il Mannosio oppure un altro recettore importantissimo è un Integrina detta Mak1 che serve a riconoscere i batteri e corpi estranei, poi ancora ci sono dei recettori detti Scavenger che sono dei recettori “spazzini”, questi sono i 4 tipi recettoriali attraverso i quali avviene la fase di riconoscimento tra il corpo estraneo la cellula che deve fare la fagocitosi. Ma quali sono i vari recettori espressi sui fagociti per le opsonine? Possono essere recettori per il frammento Fc, o recettori che riconoscono particelle opsonizzate dalle IgG altre invece riconoscono particelle opsonizzate dalle IgE e altre da particelle opsonizzate dalle IgA, però esistono dei recettori che riconoscono quelle particelle che sono opsonizzate dalle proteine del complemento ed esistono 3 recettori Cr1, 3 e 4, Cr1 riconosce le particelle opsonizzate da C1q, C4b, C3b; Cr3 riconosce le particelle opsonizzate da C1q, C4b, C3b; Cr4 riconosce le particelle opsonizzate da C3b. Quindi sulla superficie delle cellule infiammatorie si trovano ricettori che riconoscono batteri opsonizzati dalle immunoglobuline o che riconoscono batteri opsonizzati da proteine del complemento oltre agli altri recettori che si è menzionato prima quindi integrine e ed altri, ma quali sono questi recettori? Le Integrine riconoscono le


particelle opsonozzati da fibronectina e vitronectina, i recettori per il Mannosio che riconoscono i lipopolisaccaridi, recettori Scavenger o “spazzini” che riconoscono LPS oppure l’Acidolipoico o altre proteine espresse dalla cellula batterica, quindi recettori specifici per componenti opsonizzati e recettori che riconoscono altri componenti del corpo estraneo. Ma cosa avviene come conseguenza dopo questo riconoscimento? Avviene che la membrana del fagocita si chiude, un seguito al riconoscimento ligando-recettore, in torno a questo microbo formano un vacuolo di membrana, questo vacuolo viene internalizzato e per cui si forma una specie di endosoma così il microrganismo si trova all’interno di questa struttura e questo si va a fondere con i lisosomi formando i fagolisosomi e poi cosa succede? Succede che gli enzimi lisosomiali vengono attivati e si ha l’uccisione dei microbi che sono trasportati all’interno del fagosoma. Ma questa uccisione cosa richiede? Richiede un meccanismo così semplice? NO! Perché il killing che si osserva durante la fagocitosi può avvenire in diversi modi: può essere dipendente dall’Ossigeno o può essere indipendente dall’ossigeno, la maggior parte dei corpi estranei vengono distrutti mediante le vie ossigeno dipendenti la via indipendente esercita una scarsissima importanza nel meccanismo della fagocitosi.La via ossigeno-dipendente a sua volta può essere mielo-perossidasi indipendente oppure mielo-perossidasi dipendente quindi esistono due complessi enzimatici che uccidono il corpo estraneo in maniera che dipende dall’ossigeno quindi un sistema enzimatico coinvolto è quello della mielo-perossidasi. Un altro sistema enzimatico coinvolto è NADPH ossidasi quindi killing-ossigeno dipendente e come funziona questo sistema di NADPH-ossidasi? In condizioni normali nei neutrofili, nelle cellule infiammatorie questo sistemza NADPH ossidasi come è organizzato? Non deve funzionare perchè la cellula non ha ricevuto l’imput infiammatorio e come è possibile che in una cellula normale questo complesso non funziona? Non funziona perchè questo complesso è NADPH ossidasi è formato da una parte che è formata da due subunità che sta sulla membrana plasmatica e da un‘altra parte che è formata da 3 proteine che sono P40, P47 e P67, normalmente quando la cellula infiammatoria non deve fare la


fagocitosi questo complesso è dissociato cioè le due proteine stanno sulla membrana, una è una subunità 91mila e l’altra di 22mila invece l’altro complesso si trova nel citoplasma. Quando la cellula viene attivata dal ligando e dal recettore che viene attivato cioè dopo che è avvenuto il riconoscimento del corpo estraneo succede che attiva Rac che passa da uno stato di inattivazione ad uno stato di attivazione, l’attivazione di Rac facilita il trasporto di questo complesso sulla membrana cellulare quindi la NADPH ossidasi diventa attiva, quindi in condizioni normali nella cellula che deve fare la fagocitosi il complesso è dissociato e si hanno 3 subunità P40, P47, P67 che stanno nel citoplasma e due che stanno sulla membrana plasmatica, quando arriva il segnale infiammatorio Rac si attiva e RAC GTP facilita la traslocazione di questo complesso dalla parte citoplasmatica alla parte della membrana cellulare quindi la NADPH si riaggrega nelle varie subunità e si ha come conseguenza dell’attivazione di questo sistema enzimatico induce la formazione dell’anione superossido e questa è la via mielo perossidasi indipendente, l’anione superossido viene convertito in perossido di idrogeno e il perossido di idrogeno viene utilizzato dalla mielo perossidasi per produrre altre sostanze in presenza di alogenuri, come ioni cloro, per produrre altre sostanze che hanno azione battericida. Quindi l’azione battericida è catalizzata dalla mielo-perossidasi e NADPH ossidasi quindi in conclusione l’attivazione di questi due complessi enzimatici produce la formazione di specie reattive dell’ossigeno e di altre potenti sostanze battericide che degradano il corpo estraneo. Esistono difetti di queste funzioni? Si, esistono difetti delle funzioni leucocitarie che possono essere congenite e acquisite e si hanno nel diabete mellito, si ha il deficit della chemiotassi, nella guarigione delle ferite (perchè i prodotti che derivano dalla degradazione del glucosio in eccesso impediscono agli elementi figurati del sangue di funzionare in maniera corretta) i deficit acquisiti si possono avere nelle malattie autoimmuni, negli sbilanci nutrizionali ed esistono anche dei difetti congeniti come la malattia di Wiskott- Aldrich che è dovuta ad una mutazione di una proteina, che è un target intracellulare delle piccole proteine leganti il Gtp, un altro es. di difetto congenito è la LAD che è dovuto a un deficit delle adesione delle cellule infiammatorie ed è dovuta


all’alterazione genetica della catena beta delle integrine ed esistono due isoforme di questa malattia la LAD1 e LAD2 , ma esistono ancora altre sindrome che sono congenite come la sindrome di Chediak Higashi che è dovuta ad un difetto della degranulazione lisosomilale per cui questi bambini non hanno un corretto processo di fagocitosi quindi si ha un marcato decremento nell’abilità di uccidere i microorganismi da parte di questi bambini ed è caratterizzato dalla deficienza di una proteina docking di membrana che è coinvolta nella fusione delle membrane cellulari che si ha quando il fagosoma si deve fondere con il lisosoma per formare il fagolisosoma. Oltre alla sindrome di Chediak Higashi si ha una malattia granulomatosa cronica che consiste nel difetto della NADPH ossidasi e anche in questo caso l’effetto finale sarà che i microrganismi non possono essere fagocitati in maniera efficiente.Quando si ha il processo di fagocitosi si ha non solo la distruzione del corpo estraneo ma anche un danno tissutale ma questo danno tissutale è dovuto al fatto che le sostanze che vengono rilasciate dalle cellule fagocitiche distruggono anche il tessuto vicino, quindi questo danno tissutale è dovuto agli enzimi lisosomiali che sono rilasciati negli spazi extracellulari durante la fagocitosi e questi enzimi vanno a degradare la matrice extracellulare, sono dovuti ancora al rilascio di specie reattive dell’ossigeno da parte dei leucociti e soprattutto dei metaboliti dell’acido arachidonico ma questi eventi se persistono nel tessuto danno origine ad un processo infiammatorio di tipo cronico che è caratterizzato dal reclutamento continuo nuove cellule infiammatorie sul tessuto leso. Questo reclutamento avviene perchè il tessuto tenta di rispondere a questo processo reclutando delle cellule infiammatorie nel tentativo di riparare il danno ma queste cellule infiammatorie arrivano sul sito del danno e cominciano a rilasciare anche’esse altri mediatori per cui alla base di questo processo vi sono alcune malattie come l’artrite reumatoide che è la classica risposta infiammatoria di tipo cronica. Quanti tipi di infiammazioni si possono avere? l’infiammazione può essere eritematosa, l’eziologia è dovuta a stimoli ipertermici, radiazioni ionizzanti, questo tipo di infiammazione riguarda soprattutto gli epiteli di rivestimento oppure può essere sierosa ed è generalmente di origine batterica dovuto al mycobacterium tubercolosis può riguardare la pleura e il peritoneo


oppure può essere fibrinosa ed è dovuta a batteri come lo pneumococco oppure al clostridium della difterite e va a colpire soprattutto la laringe, la faringe, la trachea la pleura, il polmone, il pericardio e il peritoneo, può essere catarrale quindi avete la formazione di un essudato catarrale e questo avviene nelle infezioni batteriche da stafilococchi, streptococchi e sono infezioni tipiche dell’apparato respiratorio, urinario ed intestinale, poi si può avere un infiammazione di tipo purulento dovuto a batteri piogeni o a corpi estranei oppure traumi che riguardano follicoli piliferi, le cavità celomatiche, articolari e la cistifellea oppure si può avere un infiammazione di tipo emorragico o necrotico e questo accade nelle infiammazioni batteriche o virali nel caso del carbonchio, del tifo, o del vaiolo che attacca questa infiammazione ai polmone, all’intestino, e poi ancora infiammazione di tipo allergico che ha una causa immunitaria o immuno-patologica che alla base delle arteriti, riniti e congiuntiviti. Queste sono i tipi di infiammazioni che danno a loro volta origine a dei tipi specifici di essudato come l’essudato catarrale, fibrinoso, sieroso, purulento o emorragico. Un ascesso è una raccolta dell’essudato infiammatorio all’interno di una cavità e quindi una delimitazione ben precisa e la formazione di un ascesso.Dal punto di vista generale si è detto che i vari fenomeni che avvengono non avvengono in successione ma sono sovrapposti tra loro e abbiamo una prima fase del processo infiammatorio acuto che è una fase precoce intorno alle dodicesima ora dallo stimolo infiammatorio si ha l’edema quindi si incomincia a formare l’essudato infiammatorio, dopo la 24esima ora si ha il reclutamento dei neutrofili e in seconda giornata vengono reclutati i monociti e macrofagi, infatti se si ha la puntura di un insetto si ha una prima ondata di prurito intorno alla 12-24 esima ora poi si calma questa situazione e dopo di che nel secondo giorno si ha di nuovo il prurito in quella zona, il prurito è dovuto al rilascio dell’istamina ma la seconda ondata è dovuta al fatto che arrivano i monociti-macrofagi che cominciano a rilasciare anche’essi altri mediatori chimici. Quindi questi sono gli eventi che avvengono nell’infiammazione cioè l’edema, i fenomeni vascolari sono immediati, reclutamento dei neutrofili e successivamente reclutamento dei monociti-macrofagi, tutto questo però richiede la secrezione di mediatori chimici che sono i mediatori chimici dell’infiammazione.


I mediatori chimici sono delle molecole coinvolte nei processi infiammatori e responsabili sia degli eventi vascolari che cellulari che caratterizzano l’infiammazione e si possono dividere: alcuni Derivano dal Plasma e altri delle cellule infiammatorie. Quelli che derivano dal plasma e si trovano sotto forma di precursori e sono le proteine del complemento e fattori della coagulazione e queste proteine altamente specializzate vengono prodotte dal fegato quindi questo spiega perchè nelle malattie epatiche croniche si ha una disfunzione nella risposta infiammatoria perchè le proteine del complemento e dalla cascata coagulativa non possono essere sintetizzate nelle cellule epatiche in maniera efficiente; queste proteine della cascata coagulativa e della cascata del complemento si trovano nel plasma sotto forma di precursori quindi sono proteine che vengono attivate quando si deve avere una risposta infiammatoria quindi se si hanno delle alterazioni nell’espressione delle proteine del complemento vuol dire che quel paziente sicuramente ha un processo infiammatorio in atto perchè il complemento viene attivato. Questi precursori circolanti devono essere attivati per poter attivare la risposta infiammatoria oppure vi sono dei mediatori chimici che Derivano dalle Cellule Infiammatorie e possono essere rilasciate da queste cellule o immediatamente perchè sono costipati in granuli per cui vengono immediatamente messi in circolo oppure vengono sintetizzati ex novo e in questo caso la sintesi richiede delle ore perchè c’è bisogno del controllo dell’espressione genica e sintesi di nuove proteine, quindi è molto più immediata la risposta nel caso in cui questi mediatori vengono rilasciati che non quella che si ha quando questi mediatori devono essere neo sintetizzati. Come funzionano questi mediatori chimici? Funzionano come dei veri e propri segnali ormonali perchè si legano a dei specifici recettori e la maggior parte di questi mediatori si legano a recettori sulla superficie cellulare ma altri hanno azione enzimatica diretta o un’attività tossica diretta ma la loro secrezione la loro sintesi è un processo regolato. I mediatori preformati che sono costipati nei granuli secretori delle cellule infiammatorie sono l’istamina, la serotonia, gli enzimi lisosomiali, mastcellule, piastrine, macrofagi, basofili, neutrofili e poi ci sono mediatori chimici che devono essere sintetizzati ex novo tra questi sono le prostaglandine, i leucotrieni, il paf, le specie reattive dell’ossigeno,


l’ossido nitrico, le citochine e questi mediatori vengono prodotti prevalentemente dai leucociti alcuni anche dai macrofagi, dai linfociti. Poi ci sono mediatori che sono sintetizzati dalla cellula epatica e sono presenti o sotto forma di precursori e sono il fattore XII di Hageman la cui attivazione va ad attivare a sua volta il sistema delle chinine e il sistema coagulativo fibrilonitico; poi ancora le proteine del complemento e attraverso l’attivazione delle proteine del complemento si ha la produzione di anafilotossine e la formazione di un complesso che è il c5b9. Dal punto di vista funzionale questi mediatori chimici si possono dividere in Mediatori Vaso Attivi che sono responsabili dell’aumento della permeabilità vascolare e sono responsabili dell’edema che si ha nel processo infiammatorio, altri sono Responsabili degli Eventi Cellulari che caratterizzano l’infiammazione e quindi sono responsabili del reclutamento dei polimorfonucleati, di piastrine e monociti nell’infiammazione acuta e sono responsabili invece del reclutamento e dell’attivazione di macrofagi, linfociti e plasmacellule nell’infiammazione cronica. Quali sono prevalentemente questi mediatori? Sono fattori chemiotattici che sono prodotti dalla lipo ossigenasi, dai peptidi formilati della parete batterica o linfochine o monochine e alcuni fattori del complemento come C5a, quindi dal punto di vista funzionale vengono distinti in mediatori chimici che sono responsabili degli eventi vascolari e mediatori chimici che sono responsabili degli eventi cellulari.


Castoria 1.8 (Mercoledì 24 Aprile 2013)

Mediatori ChimiciInfiammazione Cronica

In sintesi il processo infiammatorio acuto è regolato da 3 eventi importanti: eventi vascolari, cellulari e che tutti questi eventi che accadono sono dovuti alla liberazione di mediatori chimici, esiste una classificazione dei mediatori chimici in base alla sorgente, alcuni mediatori chimici sono presenti nel plasma sotto forma inattiva e sono attivati in seguito alla risposta infiammatoria, questo succede per i fattori del complemento, per le proteine della cascata coagulativa mentre altri mediatori chimici si trovano già pronti nelle cellule infiammatorie dove vengono costipati sotto forma di granuli per cui vengono rilasciati immediatamente, hanno un’azione molto rapida e sono già pronti nelle cellule, altri invece vengono neo sintetizzati da parte delle cellule infiammatorie e quindi per la sintesi di questi mediatori ci vuole tempo per svolgere la sintesi proteica. C’è una classificazione funzionale in cui i mediatori chimici dell’infiammazione vengono distinti in mediatori vasoattivi che sono responsabili dell’aumento della permeabilità vascolare quindi dell’edema infiammatorio e poi altri mediatori che sono quelli che regolano i fenomeni cellulari del processo infiammatorio quindi i meccanismi di adesione, rotolamento, chemiotassi, fagocitosi e tra questi i più importanti sono i fattori chemiotattici che reclutano e stimolano le cellule infiammatorie come i polimorfonucleati neutrofili, piastrine, monociti nel caso dell’infiammazione acuta, macrofagi, linfociti, plasmacellule nel caso dell’infiammazione cronica. Cominciamo dalle ammine vasoattive, uno dei mediatori più importanti è l’Istamina e si trova nei basofili, mastcellule, nelle piastrine, viene rilasciata immediatamente in risposta agli stimoli infiammatori e promuove la dilatazione arteriolare e la contrazione degli endoteli delle venule post-capillari. L’istamina è responsabile del groviglio che si ha durante il processo infiammatorio infatti molti dei farmaci che si usano sono gli antistaminici. Tra le più importanti ammine vasoattive si ha la serotonina che ha degli effetti simili a quelli dell’istamina e viene rilasciata dalle piastrine quando le piastrine si aggregano per partecipane anche’esse alla risposta


infiammatoria e anche al processo di guarigione delle ferite. Acido arachidonico altro mediatore chimico dell’infiammazione, i metaboliti dell’acido arachidonico dove sono collocati? L’acido arachidonico è un componente dei fosfolipidi delle membrane cellulari ed è la via catabolica dell’acido arachidonico che produce una serie di metaboliti e quindi di mediatori chimici dell’infiammazione che hanno degli effetti biologici, vediamo come può avvenire questo metabolismo dell’acido arachidonico attraverso quali vie enzimatiche e quali sono i farmaci che si utilizzano in clinica per i processi infiammatori. La maggior parte dei farmaci agiscono proprio sul rilascio dei metaboliti dell’acido arachidonico e i metaboliti dell’acido arachidonico possono essere considerati degli ormoni a breve raggio cioè agiscono nelle vicinanze del punto che vengono secrete, questi metaboliti rapidamente decadono o vengono distrutti quindi hanno un’emivita piuttosto breve e quali sono le strade attraverso le quali vengono formate questi metaboliti? Sono 2, una via che viene mediata la 5-lipossigenasi per cui l’acido arachidonico che è prodotto dai fosfolipidi della membrana cellulare viene metabolizzato attraverso questa via enzimatica ma questo acido arachidonico si forma attraverso l’azione delle fosfolipasi che scindono i fosfolipidi delle membrane cellulari e da chi vengono attivate le fosfolipasi? Proteine G eterotrimeriche, però quando abbiamo parlato della necrosi si è detto che durante il processo di necrosi accade dal punto di visto biochimico alterazioni della membrana plasmatica e aumento del calcio intracellulare che arriva sia dall’esterno della cellula e viene anche rilasciato dai calciosomi, l’aumento del calcio intracellulare va ad attivare le atpasi quindi si ha un ulteriore deplezione di atp, si attivano le fosfolipasi quindi distruzione delle membrane cellulari e il blackground dei fosfolipidi delle membrane e si ha l’attivazione delle endonucleasi quindi è il calcio intracellulare che attiva queste fosfolipasi oltre a tutte le vie del segnale che vengono attivate e che convergono sull’attivazione delle fosfolipasi inclusi l’attivazione dei recettori di membrana a tirosino chinasi che anche attivano le fosfolipasi. Gli steroidi inibiscono le fosfolipasi e questo è il motivo per cui in terapia viene utilizzato il cortisone, il cortisone che è un antiinfiammatorio steroideo agisce inibendo la fosfolipasi quindi il


cortisone inibisce la degradazione dell’acido arachidonico e questa è l’arma più potente che i clinici hanno oggi a disposizione per poter curare i processi infiammatori. Succede che dall’acido arachidonico che si è formato per azione della fosfolipasi si hanno 2 vie che possono essere intraprese, una è quella della 5 lipossigenasi che porta alla formazione dei Leucotrieni, leucotrieni c4, leucotriene d4, leucotrieni e4, quindi attraverso la lipossigenasi si formano dei leucotrieni che sono responsabili dell’aumento della permeabilità dei vasi, dall’altro lato attraverso l’azione di una ciclo ossigenasi un altro enzima, che è inibito dall’aspirina e dall’indometacina e questo è il motivo perchè viene usato l’adico salicilico e vanno ad inibire la ciclo ossigenasi, si formano delle Prostaglandine tra cui le più importanti sono la Prostaciclina GL2 che causa vaso dilatazione ed inibisce la delegazione piastrinica e dall’altro avete la formazione di Trombossano A2 che ha un effetto del tutto opposto a quella Prostaciclina GL2 perchè il trombossano causa vaso costrizione e promuove l’aggregazione pistrinica. Si formano attraverso la via della ciclo ossigenasi queste altre 3 prostaglandine la PDG D2, E2, F2, che hanno un effetto vaso dilatativo e potenziano l’edema quindi l’acido arachidonico viene sintetizzato attraverso due vie enzimatiche: la via della ciclo ossigenasi e la via della lipo ossigenasi. La via della ciclo ossigenasi dà luogo alla formazione di prostaglandine intermedi che hanno l’una l’effetto opposto all’altro, una provoca dilatazione l’altra provoca costrizione dei vasi, una promuove l’aggregazione piastrinica l’altra invece inibisce l’aggregazione piastrinica e si hanno anche dei prodotti finali che causano vaso dilatazione e potenziano l’edema. A partire dalla lipossigenasi si ha la formazione di leucotrieni che aumentano la permeabilità vascolare, questa via è bersaglio di farmaci come cortisonici perchè i cortisonici inibiscono la fosfolipasi quindi inibiscono la formazione dell’acido arachidonico e aspirina e indometacina che inibiscono l’enzima ciclo ossigenasi. Un altro fattore importante, un altro mediatore chimico importante è il Paf che è un fattore che attiva le piastrine deriva anch’esso dai fosfolipidi di membrana per azione delle fosfolipasi induce aggregazione delle piastrine ed è da 100 a 1000 volte più potente rispetto all’istamina nell’indurre vasodilatazione per l’alterazione della permeabilità vascolare. Paf ha anche altri effetti importanti


come aumentare l’adesione dei leucociti agli endoteli, promuove la chemiotassi promuove la degranulazione delle cellule infiammatorie quindi dei fagociti e quindi la liberazione delle specie reattive dell’ossigeno e del burst ossidativo quindi interviene anche nei processi di fagocitosi. Poi abbiamo delle citochine che sono dei polipeptidi secreti dalle cellule infiammatorie le quali servono a regolare i processi di migrazione e chemiotassi servono a regolare i processi di fagocitosi quindi fenomeni cellulari nel processo infiammatorio ma hanno anche azione sulla proliferazione sulle cellule e perché sono studiate? Perché sono degli ottimi bersagli terapeutici sia per la terapia dei processi infiammatori sia per le terapie dei tumori perché il processo infiammatorio partecipa alla progressione tumorale. Altro mediatore importantissimo è l’Ossido Nitrico (NO) il quale è un gas solubile con un ampio spettro di funzione che però sono a breve raggio quindi si comporta come un ormone a breve raggio e a che cosa serve quest’ossido nitrico e da chi viene sintetizzato? Viene sintetizzato a partire da L-arginina, ossigeno molecolare e da NADPH la sintesi è catalizzata da un enzima che è l’ossido di azoto sintetasi o ossido nitrico sintetasi, quante forme esistono di ossido nitrico sintetasi? Una endoteliale che viene detta E-nos, una forma che è presente nel tessuto cerebrale, nelle cellule nervose detta N-nos, e una detta I-nos (I sta per inducibile) quindi è una forma che viene indotta, durante il processo infiammatorio si osserva l’induzione di questa forma enzimatica e si ha la sintesi di quest’ossido nitrico durante il processo di fagocitosi quando viene attivato il complesso NADPH ossidasi. Mentre nella forma endoteliale è coinvolta nella patogenesi dell’aterosclerosi e vi sono per esempio alcuni ormoni come i non steroidei come estrogeni che facilitano l’attivazione o inducono l’attivazione di questa forma endoteliale dell’ossido nitrico sintetasi quindi gli estrogeni hanno un azione positiva sul processo di ossido riduzione promuovendo il rilascio di NO negli endoteli e questo cosa spiega? Il motivo in cui le donne sono molto più protette ai processi ateromasici e quindi dalle malattie cardiocircolatorie quindi dai processi trombotici ma fino a quando? Fino alla menopausa dove si ha un declino dei livelli ormonali soprattutto degli estrogeni e quindi viene persa questa azione protettiva che è dovuta dal fatto che l’estradiolo agisce


positivamente su questo tipo di NO-sintetasi promuovendo il rilascio di NO e quindi il rilascio di NO da parte delle cellule endoteliali che cosa fa, cosa favorisce? Il rilassamento dei vasi quindi gli endoteli dei vasi non si presentano rigidi e hanno una certa plasticità e quindi in questa maniera si oppongono alla formazione di placche ateromasiche ed eventualmente al distacco di trombi da queste placche ateromasiche. Ma perché è importante l’NO? Regola la funzione dei vasi durante la risposta infiammatoria, riduce l’aggregazione piastrinica infatti la placca ateromasica si complica quando si ha l’aggregazione delle piastrine sulla placca; poi modula la risposta dell’ospite all’infezione ed alterazione della produzione di NO sono presenti in alcune malattie come il diabete mellito e aterosclerosi e nell’ipertensione arteriosa.Altri mediatori importanti sono i radicali liberi come anione superossido, perossido di idrogeno, radicali ossidativi e da chi vengono liberati questi radicali liberi? Vengono liberati dal leucociti in seguito alla stimolazione chemiotattici oppure vengono liberati in seguito all’esposizione di immunocomplessi ma soprattutto liberati durante i processi di fagocitosi mediante il complesso enzimatico NADPH ossidasi ma vengono liberati anche attraverso la liberazione della mieloperossidasi (contenuto nei leucociti polimorfonucleati) durante i processi di fagocitosi ossigeno dipendenti viene liberato un enorme quantità di specie reattive dell’ossigeno. Queste specie reattive dell’ossigeno cosa fanno? Si combinano con NO formando degli intermedi reattivi per dell’azoto e sono questi intermedi che danno un azione anti microbica inducendo ulteriore rilascio di chemiochine e citochine e regolano le molecole di adesione e di questo aspetto ne parleremo quando parleremo delle ipercolesterolemie. Queste specie reattive dell’ossigeno per fortuna hanno un rapido decadimento che viene accelerato da sostanze come alcune vitamine oppure il decadimento viene accelerato attraverso degli scavengers e che cosa inducono? Inducono danno tessutale o perché vanno ad agire direttamente sulle cellule degli endoteli dei vasi, oppure attivando delle proteasi vanno ad indurre a un danno alla matrice extracellulare perché promuovono la degradazione della matrice extracellulare. Altri mediatori chimici sono i costituenti lisosomiali come granuli specifici dei lisosomi che contengono lisozima,


collagenasi, elastasi, gelatinosi sono tutti enzimi che a che cosa servono? A degradare delle macro molecole, gli enzimi lisosomiali agiscono a pH acido; in oltre vi sono granuli azzurrofili detti anche specifici che contengono la mieloperossidasi che è l’enzima che si attiva durante il processo di fagocitosi, poi idrolisi ed altri fattori battericidici. Quindi i costituenti lisosomiali intervengono soprattutto durante il processori fagocitosi. Poi ancora, abbiamo le proteine del complemento e come può essere attivata questa via? Può essere attivata in due modi via Classica che viene attivata dai complessi antigene-anticorpo, oppure può essere attivata da una via Alternativa che coinvolge i polisaccaridi della superficie batterica quindi la via classica è quella via immunitaria di attivazione dei fattori del complemento quindi questa via viene attivata in seguito alla formazione dei complessi antigene-anticorpo oppure via alternativa attivata direttamente dai polisaccaridi della parete batterica, ma qual è il concetto di questa via (che è lo stesso concetto dell’attivazione della cascata del complemento)? È che a partire da un precursore inattivo si formano, vengono rilasciati, dei prodotti proteici specializzate che da chi vengono sintetizzati? Dal fegato, dalle cellule epatiche, quindi a partire da precursori inattivi ed uno dei più importanti è C3 che viene convertito attraverso degradazione proteolitiche, attraverso convertasi, viene degradato e da questa degradazione vengono rilasciate delle forme attive come la C3a soprattutto, e C3b e a partire da C3a e C3b vengono formate, per azione di un altro enzima che è la C5 convertasi viene formatoli C5 il quale a sua volta viene attivato e quest’attivazione da origine al C5a che è uno dei fattori chemiotattici più potenti e il C5b che in ultima analisi va a favorire l’assemblaggio di un complesso che è formato da fattori quali C5b, C6, 7, 8, 9, che formano il complesso di attacco alle membrane quindi a che cosa serve questo complesso di attacco alle membrane? A riconoscere il corpo estraneo batterico soprattutto ed attaccarlo, quindi durante l’attivazione della via del complemento vengono rilasciate a partire da molecole inattive vengono rilasciate attivate delle molecole che hanno o una potente azione chemiotattica oppure servono al riconoscimento del corpo estraneo che ha indotto il danno e quindi da attaccarlo.Per quanto riguarda il sistema del complemento quel è la proteina


capostipite dell’attivazione di questa cascata? È il fattore 12 Hageman che è una proteina specializzata che viene prodotta dalla cellula epatica e da chi vene attivato il fattore 12 Hageman? Dal collagene, dalle membrane basali e dall’attivazione piastrinica quindi tutte le volte che si hanno modificazioni della matrice extracellulare o si ha l’attivazione delle piastrine, come accade durante il processo infiammatorio, si ha l’attivazione del fattore 12, però questo fattore che viene attivato per proteolisi infatti la cascata coagulativa è una serie di processi proteolitici per cui da un precursore inattivo si forma una molecola attiva un pò come succede nell’attivazione delle caspasi durante il processo apoptotico e questo fatto 12 viene attivato in presenza di un cofattore che è il Chininogeno ad alto peso molecolare (HMWK) e l’attivazione avviene da parte di collageno, membrane basali e piastrine attivate quindi si forma un fattore 12 attivato e cosa succede quando viene attivato? Da un lato questo fattore attiva la cascata delle chinine cioè che cosa fa? Trasforma la Precallicreina che è inattiva in Callicreina questa a sua volta va ad attivare un sistema fibrinolitico oppure converte il chininogeno in Bradichinina è un potente mediatore chimico rilasciato il processo infiammatorio, ha una potentissima azione sulla permeabilità dei vasi e quindi è coinvolto nei processi vascolari dell’infiammazione. Ma l’attivazione di questo fattore 12 non attiva solo la Bradichinina quindi non è coinvolto solo nella risposta infiammatoria ma è coinvolto anche nei processi di fibrinolisi quindi dissoluzione del tappo di fibrina quindi l’attivazione questo processo è coinvolto anche nei processi nelle patologie cardiovascolari o cardiocircolatorie quindi nei processi di trombosi. In che cosa consiste l’attivazione di questo fibrinolitico? Consiste che la Callicreina che si forma a partire dal fattore 12 attivato va a convertire il plasminogeno in plasmina che a sua volta da un lato va ad attivare la cascata del complemento perché favorisce la conversione di C3 in C3a quindi si ha un amplificazione della risposta infiammatoria perché a partire dall’attivazione del


fattore 12 si ha la liberazione di Bradichinina che è un potentissimo mediatore che media le risposte vascolari però si ha anche l’attivazione della cascata del complemento la conversione di C3 in C3a e quindi si ha anche l’attivazione dei processi cellulari infiammatori perché il fattore C3a insieme al C5a è un potente chemiotattico e serve alla formazione del complesso di attacco alla membrane. Quindi la plasmino da un lato va ad attivare la cascata del complemento dall’altro lato che cosa fa? Va ad attivare la fibrina con la produzione dei prodotti, quando si ha l’aggregazione piastrinica, questa fibrina cosa fa? Va a scindere questi aggregati piastrinici per cui si parla di processi di fibrinolisi. Ma che cosa significa questo che abbiamo detto fin ora? Significa che negli organismi superiori due sistemi importanti, specializzati, via del complemento quindi proteine nella cascata del complemento e proteine della cascata coagulativa sono intimamente correlate tra di loro, l’attivazione della via della coagulazione porta all’attivazione della cascata del complemento e questo serve ad amplificare la risposta infiammatoria ed acconsentire di far si che le cellule infiammatorie vengano portate al più presto sul sito del danno e questo avviene solo attraverso l’amplificazione di una risposta mediata da questi mediatori chimici. Dall’altro lato cosa succede? Succede che il fattore 12a (attivato) controlla la cascata coagulativa cioè controlla la formazione del coagulo del sangue quindi l’attivazione di un fattore cosa va a fare? Da una parte controlla la fibrinolisi quindi la disgregazione del tappo fibrinico e quindi si oppone ai processi trombotici perché il trombo è formato anche da aggregazioni di piastrine e dall’altro va ad attivare la coagulazione del sangue e come? Il fattore 12a va ad attivare il fattore 11 il quale converte la protrombina in trombina la quale va ad attivare il fibrinogeno e questo va a formare il tappo di fibrina e cosa serve questo tappo? Serve alla formazione del coagulo. Quindi l’attivazione di questa via da un lato serve alla formazione del coagulo dall’altro lato attraverso la cascata delle chinine serve a


convertire il plasminogeno in plasmima che a sua volta va ad agire sulla fibrina inattivandola, disaggregando il coagulo e dall’altro mediante l’attivazione di questa cascata delle chinine dove si ha la liberazione della bradichinina e l’attivazione della cascata del complemento quindi l’attivazione del fattore 12 serve: 1) Alla risposta infiammatoria 2) serve a mantenere un equilibrio in un sistema importantissimo che è il sistema coagulativo e fibrinolitico e l’alterazione di una di queste proteine è sufficiente per indurre o una coagulazione disseminata oppure per indurre la formazione di tappi di fibrina e quindi di trombi che portano alle malattie cardiocircolatorie, ictus cerebrale, infarto del miocardio, trombi che si fermano agli arti inferiori inoltre rientrano anche nel processo alterosclerotico, quindi la liberazione di questi mediatori chimici dell’infiammazione cosa produce dal punto di vista clinico? Produce alcuni segni del processo infiammatorio che sono le reazioni della fase acuta e quali sono le reazioni della fase acuta o degli effetti sistemici dell’infiammazione? La febbre, aumento della temperatura corporea, anoressia che è la stanchezza che accompagna sempre i processi infiammatori, la sintesi delle proteine della fase acuta cioè si trovano dei marcatori specifici del processo infiammatorio come i fattori del complemento infatti se si eseguono degli esami di laboratorio nel corso di un infiammazione acuta si troveranno valori elevati delle proteine del sistema del complemento, alterazioni del numero dei globuli bianchi. Da che cosa sono dovute queste manifestazioni, questi effetti acuti del processo infiammatorio? Sono dovuti soprattutto dal rilascio delle citochine e chemiochine ma sono dovute dal TNF che induce la produzione di un interleuchina di tipo 1 la quale a sua volta consente la sintesi e il rilascio dell’interleuchina 6 quindi la febbre e le altre alterazioni cliniche che sono dovute soprattutto dal rilascio di citochine e dal fattore TNF, la luecocitosi, l'aumento del numero dei globuli bianchi che accompagna i processi infiammatori come può cambiare? I globuli bianchi aumentano da 5-10 volte fino a 15-20 volte rispetto


alla norma alcune volte si possono avere delle reazioni di tipo leucimoide che mimano una leucemia, con un aumento del numero dei globuli bianchi da 40 a 100 volte fino alla norma e questi globuli bianchi vengono rilasciati direttamente dal midollo osseo in seguito al danno e come cambiano? Si ha un aumento dei polimorfonucleati neutrofili nelle infezioni batteriche quindi quasi sempre i batteri inducono un aumento dei neutrofili. Poi si ha un aumento degli eosinofili nelle parassitosi, alcuni virus inducono un aumento dei linfociti mentre altri virus invece inducono una diminuzione del numero dei globuli bianchi. In tutti processi infiammatori in seguito ad una necrosi si ha un aumento dei polimorfonucleati soprattutto i neutrofili, anche se si ha un infarto del miocardio e si va a fare l'esame microbocitometrico del paziente si troveranno i segni sistemici del processo infiammatorio quindi aumento dei globuli bianchi nel sangue oltre agli enzimi cardiaci che vengono rilasciati in circolo. Come può evolvere il processo infiammatorio acuto? Il processo infiammatorio acuto può risolvere e in questo caso si ha una restitutio ad integrum del tessuto che riprende le sue funzioni quindi avete la guarigione di quelle ferita perchè ogni processo infiammatorio genera una ferita che deve essere guarita oppure si può avere un processo di fibrosi e cosa significa e quando lo si ha? Lo si ha quando lo stimolo o il danno non viene rimosso per cui si ha continuamente il reclutamento sul sito del danno di cellule infiammatorie soprattutto dei monociti che si trasformano in macrofagi per cui in questo caso si ha contemporaneamente il tentativo del tessuto di guarire però attraverso il reclutamento di macrofagi e linfociti ma si ha anche il danno tissutale che rimane e persiste perchè quando i macrofagi vengono reclutati rilasciano una serie di mediatori chimici dell'infiammazione e quindi in questo caso si ha la fibrosi e che significa questo alla fine? Significa che il tessuto parenchimale viene sostituito con del tessuto connettivale perchè entrano in gioco i fibroblasti e i fibroblasti cominciano a depositare matrice


extracellulare e si ha la degenerazione fibrotica di quel tessuto, questo è quello che avviene nella fibrosi epatica quando il virus dell'epatite C non viene allontanato ma permane e questo virus tende a dare un epatite che cronicizza quindi avete un epatite cronica e quindi si ha intervento di macrofagi, di fibroblasti, deposizione di matrice per cui si ha scompaginamento dei tessuti. Oppure si può avere la formazione di un ascesso che è una collezione di pus (liquido di aspetto cremoso, viscoso, in cui sono presenti in grande quantità polimorfonucleati che hanno subito lisi) che è un essudato purulento che si va ad accogliere in una cavità ben organizzata, organizzata che può rimanere lì anche per anni, oppure si può avere la progressione verso il processo infiammatorio di tipo cronico.Quando si ha la risoluzione del processo infiammatorio che cosa succede? Si ha il ripristino della normale permeabilità vascolare, il drenaggio dei liquidi e delle proteine dell'essudato da parte dei linfatici oppure avviene tutto per pinocitosi e si ha ancora la fagocitosi dei neutrofili apoptotici, dei detriti necrotici e questa fagocitosi avviene ad opera delle cellule del sistema fagocitico e la eliminazione dei macrofagi che hanno fagocitato queste cellule apoptotiche e questi detriti necrotici e quindi si ha la risoluzione del processo infiammatorio. Questo processo piuttosto che risolversi può portare alla fibrosi e quindi alla perdita di funzione del tessuto oppure ancora alla formazione dell'ascesso o ancora può progredire verso un processo di infiammazione cronica. Da che cosa è caratterizzato e quali sono i fenomeni grossolani che caratterizzano l'infiammazione cronica? Sono l' infiltrato di cellule mononucleate quindi i macrofagi, l'angiogenesi quindi la formazione di nuovi vasi a partire da vasi preesistenti e poi ancora la formazione di una fibrosi ed eventualmente di una cicatrice.Quali sono le caratteristiche del processo infiammatorio cronico? Dura mesi o anni ed è caratterizzato da fenomeni tissutali, la cronicizzazione da che cosa è causata? E' caratterizzata da fenomeni tissutali, e la cronicizzazione da che cosa è causata? è


causata dal fatto che l'agente che ha causato il danno non viene eliminato in maniera efficace oppure dal fatto che si ha un esposizione perseverante all'agente oppure ancora perchè si hanno delle reazioni autoimmuni perchè alcuni elementi delle nostre cellule, dei nostri tessuti non vengono riconosciuti dal sistema immunitario quindi si ha la perdita del self e quindi in questo modo si creano dei complessi che vanno ad agire contro le cellule dell'organismo addirittura in alcune patologie contro il DNA nativo delle cellule.Si distinguono due forme diverse di infiammazione cronica un infiammazione cronica Non Granulomatosa, la maggior parte delle infiammazioni croniche non sono granulomatose ad es. la bronchite cronica non è granulomatosa, non è caratterizzata da questa lesione tipica che viene detta granuloma. Esistono altre forme come l’epatite cronica non è granulomatosa, ci sono una miriade di infiammazioni croniche che non sono granulomatose cioè non sono caratterizzate da una lesione che viene detta Granuloma. Esistono delle infiammazioni croniche che vengono dette Granulomatose in quanto sono caratterizzate da una lesione anatomopatologica ben specifica che è il Granuloma ma quali sono questi? Tubercolosi, Sifilide, malattie contratte in ambienti di lavoro in seguito l’ingestione di polveri sottili come Asbestosi (o asbesto o amianto) Silicosi che, soprattutto a livello polmonare, danno formazione di Granulomi tipici; Granulomi da Corpi Estranei che si trovano tra i tossici dipendenti nei punti di iniezione delle sostanze perché insieme a queste sostanze vengono iniettate anche corpi estranei come Talco o altre macro molecole oppure granulomi da corpi estranei si possono avere quando ad es. in seguito ad un trauma penetra un corpo estraneo al disotto della cute come schegge di legno o vetro in questo caso si forma un granuloma attorno a questo corpo, e a che cosa serve? È il tentativo, da parte del nostro corpo di eliminare un corpo estraneo che però non può essere facilmente digerito o fagocitato dai macrofagi. Ma cosa hanno in comune? La mancanza di fenomeni essudativi, quindi noi non troveremo dell’essudato nel processo infiammatorio cronico e la mancanza di neutrofili quindi tipi cellulari diversi rispetto all’infiammazione acuta. L’infiltrato cellulare da chi è composto? Da macrofagi e linfociti, raramente in alcuni tipi di granulomi si possono


trovare degli eosinofili, in alcune forme di parassitosi croniche possono essere reclutati anche gli eosinofili ma l’evento è abbastanza raro.Quindi se volessimo definire il processo infiammatorio cronico possiamo dire che questo processo è un processo in cui il danno e il tentativo del nostro organismo di rispondere a qual danno quindi di ricostituire l’integrità tissutale procedono di pari passo, quindi si ha da un lato il processo infiammatorio e dall’altro si ha il tentativo del tessuto di guarire, questi due eventi avvengono Contemporaneamente. Questi due eventi ovviamente portano, nella maggior parte dei casi, alla fibrosi del tessuto e da che cosa è caratterizzata la lesione infiammazione cronica? Da un infiltrato di cellule mononucleate, dalla distruzione del tessuto e dalla riparazione del tessuto che coinvolge l’angiogenesi e il deposito di nuova matrice extracellulare quindi la Fibrosi.L’infiammazione Non Granulomatose sono delle infiammazioni che presentano una composizione dell’infiltrato infiammatorio costante nel tempo, hanno un aspetto aspecifico, talora possono dare delle complicanze dovute a compressione meccaniche dei vasi, per via dell’infiltrato e possono portare all’insorgenza di fibrosi con sclerosi quando si ha un eccesso di deposito di matrice cioè eccesso di connettivo, l’eziologia è diversa infatti può essere dovuta da fenomeni auto immunitari oppure da organismi che hanno bassa virulenza ma con elevata resistenza oppure dal persistente contatto con allergeni e queste sono le cause dell’infiammazione Non Granulomatose.L’infiammazione di tipo Granulomatosa è caratterizzata da un eziologia dovuta al fatto che nei fagolisosomi persistono dei micro organismi o persistono a lungo delle sostanze che sono indigeribili da parte dei macrofagi. Ma quali sono le caratteristiche di questa infiammazione? Che nei tessuti compaiono delle formazioni sferiche che vengono detti Granulomi che sono caratterizzati sempre dalla presenza dei macrofagi, quindi la cellula che si trova in queste lesioni sferiche è il macrofago. È specifica, la morfologia del granuloma dipende dall’agente che lo ha indotto infatti il granuloma tubercolare è diverso da quello specifico, infatti in quello tubercolare si ha la necrosi del granuloma al centro e viene detto anche caseoso infatti viene detta anche detta necrosi caseosa;


mentre nel granuloma luetico, dovuto alla sifilide, si ha la formazione di una gomma all’interno del granuloma che viene detta anche Gomma Luetica. Quindi ogni granuloma è diverso dal punto di vista anatomopatologico mentre dall’altro è specifico dell’agente che lo ha indotto. L’evoluzione di questo processo qual è? La sostituzione fibrotica del tessuto, la deposizione di Sali di calcio al interno del granuloma o l’incapsulamento, la delimitazione del granuloma da parte di una capsula e quindi il granuloma compare capsulato.Ma quali sono le cellule più importanti che caratterizzano l’infiammazione cronica? Macrofagi, Linfociti e occasionalmente si trovano Eosinofili che non sono caratteristici del processo infiammatorio cronico.La Funzione dei Macrofagi, questi derivano da cellule staminali detti Blasti che dal midollo osseo vengono reclutati nel sangue e differenziano in senso Monocitico quindi a livello del sangue periferico si trovano monociti che vengono reclutati, durante il processo infiammatorio acuto, dai tessuti e differenziano in senso macrofagico, a livello tissutale i macrofagi che cosa fanno? O possono essere attivati e quindi a provvedere ai processi di chemiotassi, fagocitosi in seguito all’attivazione o possono ulteriormente differenziarsi questi vengono chiamati Macrofagi Residenti, e quali sono quelli più importanti? Quelli della microglia del SNC che hanno un ruolo importantissimo nella patogenesi delle malattie neurodegenerative oppure le cellule del kupffer del fegato che sono importanti nel processo delle cirrosi (fibrosi cirrosi) i macrofagi alveolari del polmone e gli osteoclasti che sono importantissimi quando in tumore metastatizza a livello osseo. Quindi questi sono dei macrofagi ben differenziati che si trovano in questi tessuti che vengono detti residenti perché si trovano gia differenziati in questi tessuti dove vanno ad esplicare le funzioni importantissime nella fisiologia di questi tessuti. Ma come vengono attivati i macrofagi che vengono reclutati dal sangue periferico ai tessuti? I meccanismi di attivazione dei macrofago sono 2: o attivati per via immunitaria quindi attraverso le cellule T oppure per via non immunitaria. Iniziamo da come i T attivano i macrofagi, li attivano attraverso il rilascio di una citochina detta Interferone Gamma (INF) quindi i T secernano INF che va ad attivare per via immunitaria la


cellula macrofagica, ma l’attivazione di macrofagi però può avvenire anche per via non immunitaria infatti i macrofagi possono essere attivati dall’endotossine che si liberano durante i processi infiammatori, dalle proteine della matrice extracallulare soprattutto la fibronectina e da mediatori chimici perché posseggono una batteria di recettori per i mediatori chimici tra cui CSF1 (colony stimulating factor). Il macrofago quando viene attivato, qualsiasi sia il meccanismo di azione che cosa fa? Produce, rilascia delle sostanze, che sono indispensabili per il danno tissutale e per il processo di fibrosi. Specificatamente fa: rilascia sostanze che intervengono nel danno tissutale, metaboliti tossici dell’ossigeno, proteasi, fattori chemiotattaci per i neutrofili, fattori che attivano la cascata coagulativa, metabolici dell’acido arachidonico e NO quindi in questa maniera, attraverso il rilascio di queste sostanze inducono il danno alla cellula, ma oltre ad indurre danno tissutale che fanno? Promuovono anche la fibrosi del tessuto quindi deposito di matrice perché rilasciano delle collagenasi che rimodellano la matrice extra cellulare, rilasciano delle citochine fibrogeniche cioè facilitano il deposito della matrice extracellulare quindi tutto questo che significa? Che in seguito all’attivazione del macrofago si ha la distruzione del tessuto e contemporaneamente una serie di processi biochimici che contribuiscono alla deposizione e rimodellamento della matrice extracellulare quindi una sola cellula promuove contemporaneamente danno tessutale e fibrosi, questo è il motivo per cui il macrofago è considerato la cellula principe del processo infiammatorio cronico.Nell’infiammazione Acuta abbiamo la scomparsa dei macrofagi quando il danno viene rimosso nell’infiammazione Cronica si ha un reclutamento continuo dei macrofagi, ed è questa la differenza sostanziale fra questi due tipi di infiammazioni. Ad es.come nei fumatori i macrofagi vengono continuamente reclutati al livello degli epiteli bronchiali e li inducono la secrezione di mediatori chimici importantissimi che sono responsabili della proliferazione incontrollata delle cellule ed è questo il motivo per cui la maggior parte dei processi infiammatori cronici sono associati alla comparsa di neoplasie, bronchiti croniche, tumori dei bronchi, infezioni croniche delle vie urinarie, tumori delle vie urinarie, infezioni croniche della colecisti, tumori della colecisti o tumori delle vie biliari


danni infiammatori sulla pelle per es. possono indurre tumori della pelle quindi tutto questo per dire che i rapporti tra infiammazione e tumori sono importantissimi e oggi si pensa che il processo infiammatorio è importante nella progressione del tumore quindi nei meccanismi che regolano l’invasività, metastasi etc… precedentemente parlammo di un nuovo farmaco “trabectedin” che non è altro che un anti infiammatorio che va ad inibire l’azione dei macrofagi ma viene usato anche nella terapia dei tumori.



Infiammazione CronicaAspetti Caratteristici Della Guarigione Di Una Ferita

La lezione scorsa abbiamo cominciato a parlare dell’infiammazione cronica e una delle cellule più importanti che partecipa a questo processo è il macrofago, quali sono i macrofagi che intervengono in questo processo? Sono i macrofagi residenti oppure sono quelli che vengono reclutati attraverso il sangue periferico cioè vengono reclutati i monociti i quali quando trasmigrano per diapedesi dai vasi agli spazi interstiziali differenziano in senso macrofagico ed è chiaro che durante il processo infiammatorio cronico questi macrofagi devono essere attivati e come possono essere attivati? Possono essere attivati per due strade, una strada detta immunitaria e che prevede l’intervento dei linfociti ed un’altra invece che non è di tipo immunitario. La via immunitaria prevede che le cellule T attivate rilasciando delle citochine infiammatorie evidentemente l’interferone gamma vadano ad attivare i monociti-macrofagi quando una volta attivati si mettono a secernere delle sostanze che sono responsabili o del danno tissutale o della fibrosi. Il danno tissutale perché queste sostanze sono le specie reattive dell’ossigeno, le proteasi, i fattori chemiotattici per i neutrofili, alcuni precursori dei fattori di coagulazione, metaboliti dell’acido arachidonico e ossido-nitrico, naturalmente i macrofagi non secernono i fattori della coagulazione ma vanno ad attivare i fattori della coagulazione, e ancora i macrofagi attivati possono secernere delle sostanze che sono responsabili della fibrosi tissutali che sono i fattori di crescita oppure ancora le citochine fibrogeniche oppure ancora dei fattori che regolano i processi di angiogenesi o ancora delle collagenasi che rimodellano il tessuto. Dicemmo pure che la differenza importante tra il processo infiammatorio acuto e quello cronico è che nel processo infiammatorio cronico vengono reclutati sul sito continuamente dei macrofagi invece nel processo infiammatorio acuto le cellule infiammatorie vengono rimosse, i neutrofili apoptotici vengono rimossi attraverso i macrofagi e i macrofagi vengono allontanati dal sito del danno una volta che il processo si è risolto, che il danno è stato rimosso appunto dalle cellule fagocitiche e questo è la differenza fondamentale. Solo i macrofagi


partecipano a questo processo? No! Partecipano a questo processo anche i linfociti che vengono immobilizzati sia nelle reazione immunitarie di tipo umorale che nelle reazioni immunitarie cellulo-mediata e soprattutto quello che si ha in questo tipo di risposta infiammatoria è la cooperazione tra linfociti e macrofagi. I linfociti una volta che sono stati attivati rilasciano dei madiatori chimici linfochine, soprattutto, oppure rilasciano l’interferone gamma che va ad attivare i macrofagi, i macrofagi attivati che cosa fanno a loro volta? Da un lato secernono dei mediatori chimici e dall’altro si mettono a secernere due fattori importanti che sono l’interleuchina1 e il Tnf (tumor necrosis factor) che a loro volta vanno ad attivare i linfociti, quindi cosa abbiamo? Abbiamo una cooperazione positiva tra due tipi cellulari cioè linfociti e macrofagi quindi un loop che si crea nell’infiammazione cronica per cui i linfociti attivati attraverso l’interferone gamma va ad attivare il macrofago il quale una volta attivato dall’interferone gamma secerne dei fattori l’interleuchina1 e Tnf che vanno ad attivare i linfociti. Quindi attraverso questo circuito che si crea tra questi due tipi cellulari e questo processo infiammatorio che cosa fa ? Si auto mantiene e questa è la base della cronicizzazione del processo il fatto che il processo si auto mantiene. Abbiamo visto la volta scorsa come l’infiammazione cronica è di due tipi, di tipo granulomatosa o di tipo non granulomatosa. Che cosa significa infiammazione granulomatosa? Significa che questa infiammazione cronica è caratterizzata dalla presenza di una lesione specifica che viene detta granuloma. Che cosa è un granuloma? Il granuloma è un aggregato di macrofagi che hanno un fenotipo simile a quello delle cellule epiteliali e questi macrofagi vengono detti anche macrofagi epitelioidi e che cosa significa che questi macrofagi sono epiteliodi? Significa che hanno un fenotipo allargato simile a quello delle cellule epiteliali, normalmente anche i macrofagi sono cellule che si muovono ed hanno un fenotipo piuttosto allungato e polarizzato quindi differenziano in senso epiteliale cioè hanno un aspetto che le differenziano, assumono un aspetto di tipo epiteliale per cui questi macrofagi vengono detti macrofagi epitelioidi a volte si possono fondere tra loro a formare dei sincizi, degli aggregati di cellule che hanno anche 40-50 nuclei quindi che derivano dalla fusione di 40-50 macrofagi e queste cellule sono delle cellule giganti. Il


granuloma quindi è una collezione di macrofagi epiteliodi che sono circondati da linfociti quindi in questa maniera si ha interazione tra macrofagi e linfociti e al centro del granuloma si trova questa raccolta di questi macrofagi e in periferia si trova questa rima di linfociti che circonda questa lesione granulomatosa. Da chi possono essere indotte queste lesioni granulomatose? Possono essere indotti da agenti biologici e possono essere indotti anche da corpi estranei, generalmente quando si ha questa lesione granulomatosa? Nel caso di un batterio che stimola dei processi di ipersensibilità ritardata quindi si parla in questo caso di batteri che hanno bassa virulenza ma hanno grossa resistenza quindi sono batteri che permangono a lungo nel nostro organismo ma che hanno bassa intensità di virulenza e quali sono questi batteri? Sono i mycobacterium leprae e mycobacterium tubercolosis cioè sono gli agenti eziologici della lebbra e della tubercolosi e poi ancora il treponema pallidum responsabile della sifilide umana e questi sono gli agenti biologici più importanti che causano delle lesioni di tipo granulomatose, nel caso del batterio della tubercolosi il granuloma che si forma è un granuloma tubercolare, nel caso della treponema pallidum quindi della sifilide si ha un granuloma luetico che viene detta anche gomma luetica (la sifilide si chiamava lue un tempo) ancora alcuni parassiti per es gli schistosomi possono dare luogo a un processo infiammatorio cronico caratterizzato anch’esso da un granuloma. Ancora durante alcune micosi istoplasmosi, blastomicosi che tendono a cronicizzare quindi infezioni funginee si hanno granulomi ed ancora per azioni dei metalli per es. la silicosi oppure ancora si può avere dei granulomi da corpi estranei in seguito a delle suture chirurgiche oppure per la penetrazione di materiale estraneo per es. schegge di legno o di vetro piuttosto grosse al di sotto della cute danno in genere una lesione granulomatosa quindi la risposta di granulomatosa è caratterizzata da che cosa? E’ caratterizzata dal fatto che l’agente estraneo non può essere rimosso o perché è persistente nel tempo quindi parliamo di batteri, fughi, parassiti che sono resistenti oppure perché il corpo estraneo è così ingombrante che i macrofagi non riesco ad ingerirlo e quindi riescono solo a circondarlo senza riuscire a fagocitarlo per cui in questo caso si ha una lesione granulomatosa. Una delle lesioni che si trova di più è il granuloma


tubercolare e tramite colorazione istochimica di un granuloma e nella colorazione si può trovare intorno al granuloma dei puntini e sono cellule colorate in nero che sono i linfociti che stanno nella parte più esterna del granuloma , al centro del granuloma si trova un’aria necrotica e questa necrosi che si produce all’interno del tessuto viene detta necrosi caseosa perchè il tessuto viene degradato talmente che assume l’aspetto di formaggio fuso quindi necrosi caseosa; poi all’interno del granuloma si trovano delle cellule giganti che vengono dette cellule di Langhans, queste cellule di Langhans derivano dalla fusione di 30-40 macrofagi quindi sono cellule polinucleate e ancora all’interno del granuloma si trovano dei macrofagi epiteliodi quindi dei macrofagi che assumono questa caratteristica delle cellule epiteliali e al centro la necrosi caseosa, questo è il granuloma più tipico che è stato studiato.La scorsa volta si è visto già quali sono gli effetti sistemici del processo infiammatorio: febbre, anoressia, sintesi delle proteine della fase acuta, alterazioni all’esame cromocitometrico dove si ha un aumento del globuli bianchi soprattutto dei neutrofili, queste reazioni sono prodotte dal rilascio di alcuni mediatori chimici e citochine soprattutto Tnf e interleuchina 1 che poi inducono la produzione di interleuchina 6. Come si conclude il processo infiammatorio? Il processo infiammatorio si conclude con una fase che viene detta di riparazione del tessuto e che serve a restituire all’organo le sue funzioni e questa riparazione quindi consiste nella sostituzione di tessuto parenchimale con del tessuto della stessa origine quindi con del nuovo tessuto parenchimale quando il tessuto parenchimale viene rimpiazzato da tessuto connettivo si può avere fibrosi o cicatrice e questo è alla base di notevole numero di patologie umane come la cirrosi epatica, la fibrosi polmonare, poi ancora la cicatrice dove si forma? Si forma in seguito ad un’ischemia cardiaca quindi in seguito ad un occlusione totale del quadro della coronaria o di rami della coronaria e quindi si ha la formazione di queste cicatrici. Generalmente si ha un processo di rigenerazione del tessuto e in cosa consistono questi processi riparativi? I processi riparativi sono una combinazione di due eventi importanti: la rigenerazione del tessuto e la riparazione del tessuto tutto questo viene chiamato Processo di guarigione di una ferita. Da


che cosa dipende processo di guarigione di una ferita? Dipende da 3 fattori importanti: dalla capacità proliferativa delle cellule che sono state danneggiate, dall’intenerità della matrice extracellulare che fa da scaffold per queste cellule che devono riprodursi e proliferare, e dalla risoluzione o cicatrizzazione della lesione dell’infiammazione es. nel diabete mellito si possono avere delle alterazioni metaboliche importanti e i prodotti di comunicazione prodotti in eccesso impediscono la corretta guarigione delle ferite per cui nel diabetico si ha in seguito ad una lesione minima all’arto inferiore il piede diabetico con la gangrena e prima si ricorreva tanto all’amputazione degli arti inferiori nei pazienti diabetici proprio perchè si ha un alterazione del processo di guarigione delle ferite, quindi è un processo che dipende da una serie di eventi ed è un processo importantissimo perchè in tutto il mondo si spendono milioni di dollari per affrontare questo processo perchè la guarigione delle ferite è sicuramente non più normale negli anziani, negli individui affetti da patologie metaboliche come diabete, aterosclerosi, dagli individui che hanno ostruzioni dei vasi di grosso calibro quindi tutti gli individui.Che cosa significa potenziale proliferativo? La capacità di una cellula di essere commissionata in ciclo da questo punti di vista le cellule si dividono in: cellule che hanno un’elevata capacità replicativa, le cellule del tratto gasto-intestinale, del derma, dell’epidermide, degli epiteli di rivestimenti, cellule stabili che hanno un basso livello di replicazione ad es. gli epatociti, cellule degli epiteli tubulari renali, gli acini pancreatici che sono cellule ben specializzate e ben differenziate ma che in seguito al danno in uno di questi organi vengono commissionate in ciclo, oppure ancora cellule permanenti che non si dividono mai come le cellule del sistema nervoso, cardiomiociti e le cellule della muscolatura scheletrica. Quindi se si ha un processo ischemico a livello del cuore o un danno alla muscolatura scheletrica o un danno a livello del sistema nervoso centrale come conseguenza di un ischemia cerebrale si ha in queste cellule un fattore limitante per la replicazione di queste cellule quindi lì non si può avere la guarigione di quella ferita ma si può avere l’attivazione di vie collaterali come nel caso dell’ischemia del miocardio che si attivano dei circoli collaterali e come risposta cosa si ha da parte del


tessuto? Il rilascio degli enzimi perchè quelle cellule vanno incontro a necrosi ischemica ma come risposta da parte del tessuto si ha l’ipertrofia che è un aumento del volume delle cellule cardiache, perchè si ha un aumento del volume? Perchè si ha un’aria di necrosi, a quest’aria di necrosi le cellule che stanno intorno cercano di supplire aumentando la loro attività e alla fine queste cellule diventano ipertrofiche perchè in una cellula ipertrofica si hanno dei processi metabolici acceleratissimi questo accade anche nel sistema nervoso in seguito a un danno ischemico quindi si ha ipertrofia di queste cellule? Che tipo di risposta è? Adattativa o patologica? Patologica!! Quindi nel caso all’ischemia si ha una risposta a un danno perchè è un danno ischemico che ha generato quella risposta e non è l’aumento della richiesta di ossigeno e di sangue da parte dei tessuti cosa che si verifica negli sportivi. Questo potenziale proliferativo dipende dalla capacità della cellula di duplicare o da fattori solubili che sono i fattori di crescita polipeptidici che sono presenti nel siero, sono prodotti localmente come EGF (epidermal growth factor) esercitano degli effetti pleiotropici quindi controllano la proliferazione, la migrazione, differenziamento delle cellule e il rimodellamento dei tessuti, che è importante nella guarigione delle ferite perché se non si ha il rimodellamento delle ferite il tessuto la ferita non guarisce bene e si ha la formazione di cheloidi (escrescenze di tessuto di granulazione in un tessuto di riparazione) e sono dovuti dal fatto che il tessuto non è stato rimodellato bene. Poi, questi fattori di crescita regolano la crescita delle cellule e in quale maniera? Controllando l’espressione di geni che regolano la proliferazione cellulare e questi fattori di crescita funzionano come fattori solubili che arrivano alla cellula e come funzionano questi segnali? Perché si legano ad un loro recettore di membrana questi recettori sono formati da una porzione extra cellulare che è destinata con il legame con il ligando, una porzione idrofobic a che è destinata con il legame con la membrana plasmatica, una porzione intracitoplasmatica che codifica e ha un intrinseca attività tirosina-chinasica e quando arriva il segnale di crescita questi recettori cosa fanno? Dimerizzano sulla membrana quindi si avvicinano e si ha la formazione di Omodimeri cioè significa che sono due molecole uguali tra di loro e quindi si parla di omodimerizzazione e questo porta ad una modificazione


conformazionale della porzione intracitoplasmatica di questi recettori che si auto fosforilano in tirosina dopodichè vanno a reclutare delle proteine che contengono dei domini SH2 che sono proteine adattatrici come Garb2 oppure delle chinasi come la Pi3k (fosfatidilinositolo-3-chinasi) oppure la tirosina chinasi Sarc e quando questi adattatori sono reclutati da questi recettori per i fattori di crescita cosa accade? Ras, la piccola proteina legante il GTP viene reclutata sulla membrana e viene attivata e quindi la si trova transientemente quindi si trova RAS sotto forma di GTP quindi legata al GTP e questo scatena, all’interno della cellula, una serie di eventi che portano alla fosforilazione, attivazione di chinasi attivate da Mitogeni o MAP chinasi contemporaneamente si ha il reclutamento, da parte di questi recettori, della fosfolipasi C gamma che contiene domini SH2 e quando viene reclutata della fosfolipasi C gamma cosa fa? Da un lato produce Pi3 e dall’altro succede che si va ad attivare, liberare il DAG (diacil glicerolo) che a sua volta va ad attivare le protein chinasi C e il Pi3 (o iP3) va a stimolare il rilascio di calcio dai calciosomi quindi in ultima analisi cosa vengono favoriti all’interno della cellula? Vengono favoriti i processi di fosforilazioni che vengono attivate delle cascate fosforilative che vanno ad attivare il fattore di trascrizione nucleare come Jun, Fos, Myc e questi fattori di trascrizione insieme ai fattori che regolano positivamente il ciclo cellulare cioè le cicline, che pure vengono attivate come la ciclina D ed E che spingono la cellula verso la duplicazione e quindi verso la mitosi. Questa è la maniera con cui funzionano questi fattori di crescita.Oltre a fattori solubili la proliferazione delle cellule durante il processo di guarigione delle ferite è controllata anche dai segnali che vengono attivati dalla Matrice Extracellulare (intenerità) per cui questa matrice cellulare non è uno scaffold, un ancoraggio per far crescere le cellule ma regola direttamente anch’essa la crescita, la motilità e differenziamento delle cellule ed include, è formata da elementi insolubili che regolano positivamente la proliferazione cellulare che sono collagene, laminine e fibronectine quindi il processo di guarigione di una ferita dipende: 1) dal potenziale proliferativo della cellula cioè significa che se si deve avere la guarigione di una lesione a livello gastrointestinale questa guarigione sarà molto più rapida alla guarigione di un danno al


fegato per es; poi 2) questo processo di proliferazione dipende dai segnali che arrivano a quella cellula cioè tanti più segnali proliferativi arrivano a quella cellula tanto maggiore sarà la capacità di rigenerare quel tessuto in maniera corretta; 3) questi segnali arrivano sia con il siero quindi sono fattori solubili che sono presenti nel siero e che vanno ad attivare dei complessi trascrizionali come gli elementi di risposta al siero come SRE che sono dei complessi genici molto importanti nel controllo della proliferazione, sia dipende da fattori insolubili quindi dalla proteine che si trovano nella matrice extracellulare che vanno ad attivare, attraverso i complessi focali cioè soprattutto le integrine e le chinasi che sono presenti nei complessi focali come la chinasi Fac, vanno ad attivare le vie di trasduzione del segnale che anch’esse poi portano alla regolazione positiva del ciclo cellulare. Le stesse vie coinvolgono anche il processo di migrazione cellulare da parte delle proteine della matrice che vengono attivate similmente per trasmettere dei segnali di tipo proliferativo ora, qual è la differenza sostanziale? Mentre i segnali migratori si fermano al citoscheletro le vie migratorie traducono il segnale all'actina citoscheletrica che si modifica e permette alla cellula di muoversi, queste vie oltre a fare questo possono portare questo segnale al compartimento nucleare dove vanno stimolare la sintesi di cicline come la D e E per cui in questa maniera va a controllare il ciclo cellulare cioè i segnali, le vie sono sempre le stesse e qual è la differenza? Che queste vie possono ingaggiare degli effettori che sono posizionati sul citoschetro e quindi in questa maniera vanno ad indurre le modificazioni citoscheletriche quindi la migrazione, oppure possono ingaggiare degli effettori terminali che traslocano nel compartimento nucleare e vanno a indurre, stimolare l’espressione di nuovi geni, quindi uno stesso segale ingaggiando la stessa via intracellulare, lo stesso circuito di trasmissione può controllare diversi fenotipi cellulari come migrazione, differenziamento, guarigione della ferita oppure la via proliferativa. Quali sono gli aspetti caratteristici di una guarigione di una ferita? Vi è una prima fase che è una fase Rapida che avviene durante il processo di guarigione di una ferita; Altra fase è quella Infiammatoria o dell’infiammazione ed è caratterizzata soprattutto dall’adesione, aggregazione e attivazione delle piastrine; una terza fase detta fase di Proliferazione in cui si forma il tessuto di


granulazione; una questa fase detta di Maturazione di una ferita che è caratterizzata da deposito di matrice extracellulare, rimodellamento tissutale che è dato dalle metalloproteasi (dove ne parlammo a proposito delle metastasi, dove le cellule neoplastiche invasive o metastatiche riescono a sintetizzare una grandissima quantità di metalloproteasi che servono a degradare le proteine della matrice cellulare). Quando si ha la guarigione di una ferita si ha, da un lato deposito di nuova matrice e dall’altro si ha il rimodellamento di questa ferita e quindi questo significa che tutta la matrice che viene depositata in eccesso deve essere rimossa attraverso queste metalloproteasi quindi si ha un equilibrio ben preciso quando il tessuto si deve rigenerare tra sintesi di collagene perché è questo che generalmente viene sintetizzato e degradazione del collagene che viene depositato in eccesso e l’alterazione di questo equilibrio è responsabile ad es. di una patologia molto importante come la cirrosi epatica. Quindi il processo di Maturazione è caratterizzato da Deposito e Rimodellamento della matrice e dopodiché dopo un certo periodo di tempo il tessuto leso riesce ad avere una certa contrattilità ma questo succede dopo mesi dall’induzione del danno. Prendiamo come esempio un tessuto banale leso come la cute dove facciamo una ferita un bisturi e andiamo a studiare cosa succede, questi studi sono fatti soprattutto attraverso l’aiuto di tecniche specifiche dove viene preso del tessuto preso ai margini della ferita, i due lembi della ferita, e si analizza questo tessuto per l’espressione di DNA quindi geni differenziamente espressi qui si studiano geni espressi ai lembi della ferita quindi sui due margini della ferita e i geni espressi immediatamente vicino della cute sana e attraverso questa tecnica si è potuta fare la valutazione di migliaia di geni che vengono differenzialmente espressi. Attraverso questa tecnica si è scoperto che vi è una certa differenza tra i lembi di una ferita di un individuo diabetico e si è visto che qui viene maggiormente espresso è il gene che codifica per il fattore di trascrizione Myc che è anche un oncogene e che in questo caso si comporterebbe rallentando moltissimo la chiusura di quella ferita e l’iperespressione di Myc è stato messo in relazione al fatto che nel diabete si ha un ritardo notevole nel processo di guarigione.Ma cosa succede specificatamente in queste fasi? Come detto


durante una guarigione di una ferita abbiamo una prima fase che è detta Rapida questa fase a che cosa è dovuta? È dovuta al danno che viene direttamente esercitato sulla cute, come quella dovuta dal bisturi, si ha una risposta immediata che è provocata, in genere, da uno stimolo meccanico e dall’interruzione del lembo di cellule non che dalla rottura dei vasi quindi danno endotiale e che cosa si attiva in questa prima fase? Si attiva la via dello stress cioè la via della Jun chinasi e P38 che è una piccola proteina di 38mila dalton che appartengono alla famiglia delle MAP chinasi che sono delle chinasi attivate da mitogeni che non solo intervengono nella proliferazione cellulare ma alcuni membri di questa super famiglia di chinasi intervengono direttamente nella risposta al danno, allo stress cellulare che si può indurre con le radiazioni UV, il fumo di sigarette, mediante le basse temperature oppure i cambiamenti della concentrazione di liquidi all’interno della cellula come ad esempio durante il processo di necrosi quando si incomincia ad avere lo swilling della cellula quindi il rigonfiamento cellulare si attivano questi enzimi che sono due chinasi soprattutto che vengono attivate e vengono attivate anche nella risposta immediata che si ha nella guarigione della ferita quindi quali sono? P38 e Jun chinasi ma che cosa fanno queste che una volta sono state attivate? Fanno ne più ne meno quello che fanno le MAP chinasi ERK1 e ERK 2 che sono quelle di tipo proliferativo e vanno ad agire sulla trascrizione di alcuni geni che sono dei geni molto precoci in questo caso che si attivano immediatamente dopo che si è indotta una ferita e sono i geni che codificano alcuni fattori per la trascrizione come Jun, Fos, complesso Ap1 sono tutti geni che si attivano dopo che si è avuto il danno quindi dopo l’induzione della ferita, quindi dopo 30min quindi si ha l’attivazione genica rapida dovuta da una risposta immediata e da chi è generata questa risposta immediata? E’ generato da un danno di tipo meccanico quindi l’interruzione del layer delle cellule quindi dello strato dell’epidermide perchè si sta facendo l’es. di un taglio netto e dall’interruzione anche dei vasi sottostanti e dei vasellini sottostanti e quindi si ha questa risposta dei geni precoci di Jun, Fos nel giro di 30 min ma dopodiche che cosa avete? Si ha una fase che può durare giorni o anche settimane dipende dal tessuto leso e dalla sede del danno che viene detta risposta infiammatoria, questa risposta infiammatoria da chi viene attivata?


La risposta infiammatoria viene attivata dalle piastrine che vengono attivate e reclutate e perchè devono essere attivate e reclutate queste piastrine nel processo di guarigione delle ferite? Se vi fate un taglio con una lama che cosa succede dopo 24 h se questo taglio è abbastanza perfetto? Si forma la crosta e la crosta da cosa è fatta? La crosta è dovuta al fatto che vengono reclutate sulla sede della ferita delle piastrine che vengono attivate ma soprattutto queste piastrine contribuiscono alla formazione del tappo di fibrina quindi del coagulo e quello che si vede altro non è che un coagulo che si è disidratato a contatto con l’aria, quindi la formazione della crosta è dovuta alla disidratazione di questo coagulo che viene formato in seguito al reclutamento e all’attivazione delle piastrine. Quando le piastrine arrivano, vengono reclutate da chi? Vengono reclutate dal circolo perché i vasi vengono danneggiati e vengono danneggiati o perché si è inciso con una lama o perché si hanno ferite di altra natura quindi vengono reclutate dal sangue periferico da questi vasellini danneggiati, ma queste piastrine che si trovano il loco che cosa fanno? Le piastrine secernono un fattore importantissimo che è il PDFG che è il fattore si derivazione piastrinico e questo è uno dei fattori più importanti che viene secreto dalle piastrine ma che cosa fa questo fattore? PDGF è un fattore di derivazione piastrinica che riconosce un recettore che è abbondantemente espresso dai fibroblasti, il PDGF è il mitogeno più potente che esiste in vivo , una cellula che viene stimolata con PDGF riesce a duplicare in una maniera enorme e se si stimola dei fibroblasti quiescenti che sono arrestate nella fase G0 con il PDGF l’80-90% delle cellule vanno in ciclo e duplicano il DNA e vanno incontro alla mitosi ed è molto più potente dello stesso EGF queste piastrine che trovate durante la fase infiammatoria che cosa fanno? Secernono del PDGF! E il PDFG che cosa fa? Va ad attivare i fibroblasti e perchè li va ad attivare? Perchè si lega al recettore specifico che è presente sulla membrana dei fibroblasti, e che tipo di recettore è il recettore del PDGF? A che cosa si lega questo PDGF? Si lega al proprio recettore e che cosa è questo recettore del PDGF? E’ un recettore a tirosino-chinasi che una volta che è attivato va ad attivare tutta quella serie di eventi di cui si è parlato poco fa. Ma cosa succede anche? Succede che sempre dai vasi lesi quali altre cellule vengono reclutate? (Stiamo parlando della


fase infiammatoria della guarigione di una ferita). Vengono reclutati gli elementi figurati del sangue e quali vengono reclutati prima? (E’ molto strano che un tessuto per guarire ha bisogno di essere infiammato). E le cellule che vengono reclutate prima sono i neutrofili infatti nel punto della ferita si trovano prima le piastrine che si aggregano e si attivano, poi si trovano i neutrofili che vengono reclutati dai vasellini che sono rotti, poi dopo quali altre cellule vengono reclutate? Vengono reclutati i monociti che quando arrivano nell’aria lesa, nell’aria della ferita differenziano in senso macrofagico e quali macrofagi si trovano? Si trovano del macrofagi pro-infiammatori e che vengono detti M1 e si trovano all’inizio nelle prime 48h del processo di guarigione, dei macrofagi che vengono detti anti-infiammatori che sono gli M2, mano mano i pro-infiammatori sono quelli che secernono le citochine infiammatorie e che quindi partecipano attivamente al processo infiammatorio, lo stimolano, e quindi tutte le citochine pro-infiammatorie vengono rilasciate in questa fase da macrofagi di tipo M1. Successivamente succede che i macrofagi di tipo M1 scompaiono e rimangono prevalentemente i macrofagi di tipo M2 e a che cosa sono destinati questi macrofagi anti-infiammatori? Sono responsabili del rimodellamento del tessuto quindi favoriscono il deposito e rimodellamento della matrice quindi se non si ha prima l’intervento dei macrofagi pro-infiammatori e poi quelli anti-infiammatori anche in questo caso si ha un alterazione della guarigione della ferita. Poi si ha una terza fase e questa è una fase di proliferazione e migrazione dei fibroblasti, si è visto che nella zona della ferita vengono reclutate le piastrine e attivate si mettono a secernere il PDGF e il PDGF che cosa fa? Va ad attivare i fibroblasti ma questi fibroblasti da dove arrivano? Una certa parte dei fibroblasti sono residenti ma è una minima quota di cellule che quindi vengono attivate dal PDGF e si mettono a secernere matrice extracellulare, il collagene viene prodotto prevalentemente dai fibroblasti. Questi fibroblasti non sono solo residenti, i fibroblasti residenti sono pochi ma molti derivano da precursori che subiscono un differenziamento in senso fibroblastico, altri derivano dai fibrociti che si trovano nel luogo della ferita, altri ancora derivano da periciti. Quindi alcuni fibroblasti arrivano sul sito della ferita perchè vengono portati là a partire da precursori altri invece si trovano pochi per la verità sul


luogo stesso della ferita, in ogni caso questi fibroblasti stimolati con il PDGF rilasciato dalle piastrine attivate si mettono a secernere e produrre matrice extracellulare e si mettono anche a proliferare. Quindi questo PDGF che cosa fa? Fa proliferare i fibroblasti che già si trovano nel luogo della ferita, fa migrare i fibroblasti per cui funziona anche da fattore chemiotattico per i fibroblasti per portare anche quelli che stanno più in periferia verso il centro dell’area della ferita dove questi fibroblasti che diventano attivissimi vanno a produrre matrice extracellulare. Questa è la terza fase che è caratterizzata da proliferazione, migrazione dei fibroblasti e deposito di matrice. Infine una quarta fase in cui si ha deposito di matrice e rimodellamento del tessuto, il rimodellamento di questo tessuto avviene attraverso il rilascio delle metallo-proteasi e si ha contemporaneamente produzione di collagene e distruzione della matrice che c’era e contrazione del tessuto, il tessuto incomincia a riacquisire la sua resistenza e la resistenza viene acquisita dopo mesi da che il tessuto ha subito il danno e dopo una settimana si ha la restitutio ad integrum del tessuto quindi una prima fase immediata, una seconda fase infiammatoria che dura 2 o 3 giorni che vede prima l’intervento dei neutrofili e poi dei macrofagi, terza fase di proliferazione e migrazione dei fibroblasti e fase che è attivata che è attivata dal PDGF, e quarta fase di risoluzione della ferita in cui si riforma un nuovo tessuto quello che la matrice extracellulare che viene depositata in eccesso viene degradata dalle metello-proteasi e si ha la riacquisizione della contrazione, della resistenza di quel tessuto. Questo tipo di ferita di cui abbiamo parlato viene anche detta Guarigione per prima intenzione e che cosa significa? Significa che si ha durante questo processo una guarigione di prima intenzione perchè non si ha perdita di sostanza quindi i 2 lembi della ferita combaciano l’uno con l’altro e quindi questo tipo di guarigione viene detta guarigione per prima intenzione, ma accade sempre così che i due lembi della ferita combaciano? No! Nella maggior parte dei casi si ha perdita della sostanza e in questo caso la guarigione viene detta Guarigione per seconda intenzione, in realtà i processi di cui si è parlato sono uguali sia che si ha una guarigione per prima intenzione che per seconda intenzione, le fasi del processo sono simili e uguali tra loro. Quale è la differenza? Quando si hanno due lembi di una ferita


che sono molto larghi, i due lembi della ferita come fanno a combaciare tra loro? Lo fanno attraverso la contrazione del tessuto sottostante quindi la contrazione della ferita. Quindi il processo di contrazione della ferita è tanto più grande quanto maggiore è l’aria della ferita, quindi nell’ultima fase quando si ha la contrazione di questa aria si ha un enorme contrazione del tessuto quando si è persa moltissima sostanza e in questo caso si parla di una guarigione per seconda intenzione, la contrazione delle cellule serve ad avvicinare i margini e i lembi di quest’aria. Quindi i due processi non differiscono tra loro tranne per questo aspetto cioè della contrazione delle cellule.Altro processo importante che avviene durante la guarigione di una ferita non è solo la migrazione e la proliferazione dei fibroblasti che si mettono a secernere la matrice ma è anche la formazione di nuovi vasi che devono irrorare la ferita. Attraverso quale processo avviene la formazione di questi nuovi vasi? Attraverso un processo di angiogenesi o neo vascolarizzazione che è l’estensione o ramificazione di vasi preesistenti oppure al reclutamento di progenitori endoteliali dal midollo osseo. Quindi insieme alla proliferazione e migrazione dei fibroblasti, alla secrezione e al deposito della matrice extracellulare affinchè il tessuto guarisca c’è bisogno anche quel tessuto venga irrorato con dei nuovi vasi perchè i vasi preesistenti sono stati lesi e questo può avvenire o perchè gemmano dei nuovi capillari da capillari già esistenti in loco o perchè vengono reclutati dei precursori da progenitori endoteliali del midollo osseo, da chi è regolato questo processo? E’ regolato da un fattore il VEGF che è il Vascolar Endotelian Growth Factor il quale riconosce un recettore specifico il VEFGr, anche in questo caso si parla di un recettore di membrana che ha attività tirosino-chinasica, questo recettore interviene tutte le volte che si hanno dei processi di rigenerazione del tessuto e che prevede una neo vascolarizzazione. Alterazioni di questo processo dove si trovano? Nei tumori, durante le metastasi tumorali e perchè? Nei processi di metastasi tumorale si ha alterazione del signalling del VEFG e del recettore del VEFG, e le cellule metastatiche iperesprimono il recettore per il VEFG e perche? Perchè anche durante le metastasi non si ha solo l’attecchimento di una cellula in una sede distante ma anche un processo di neo vascolarizzazione e questo processo


è stimolato da questo fattore di crescita degli endoteli vasali, infatti molte terapie antitumorali come il carcinoma polmonare sono basate sugli inibitori specifici del recettore del VEFG. Quindi si ha proliferazione, migrazione dei fibroblasti e processi di angiogenesi e nell’insieme questi due eventi proliferazione dei fibroblasti e deposito di matrice e formazione di nuovi vasi che sono molto deboli e che non hanno molta resistenza proprio perchè sono neoformati e non si sono formati organizzati in un network ben preciso e cosa fanno? Formano un tessuto che viene detto tessuto di granulazione e che cosa è un tessuto di granulazione? E’ quel tessuto che si forma durante il processo di guarigione durante la ferita, un tessuto rosaceo e da che cosa è formato questo tessuto di granulazione? E’ formato da fibroblasti e vasi neoformati, quando si subisce una ferita,un taglio, prima si forma un tessuto rosaceo sulla ferita e quel tessuto che si forma viene detto tessuto di granulazione. Che cosa è questo tessuto di granulazione? E’ un tessuto di passaggio e vuole dire che è un tessuto che poi porta alla formazione del tessuto originario o dal rimodellamento della cicatrice che è regolata dalla metallo-proteasi e dai loro inibitori. Se la cellula è stimolato ad es. con il PDGF, EGF, IL1, TNF succede che le cellule, fibroblasti o altre cellule che producono matrice si mettono a secernere insieme alle proteine che compongono la matrice, degli enzimi che rimodellano la matrice sotto forma di precursori per es. le pro-collagenasi e le pro-collagenasi vengono attivate soprattutto dalla plasmina, la plasmina viene liberata attraverso la via di attivazione del sistema coagulativo e la plasmina cosa fa? Attiva le collagenasi in pro-collagenasi per cui queste collagenasi vanno a degradare la matrice quindi da un lato si ha il deposito della matrice, dall’altro l’attivazione delle metallo-proteasi che degradano la matrice; vi sono della sostanze come gli steroidi o TGF beta che inibiscono la secrezione di queste metallo-proteasi e quindi inibiscono il rimodellamento della ferita, i cortisonici infatti non vengono utilizzati se si ha una lesione cutanea o una ferita. Accanto a questi enzimi che degradano la matrice vi sono anche degli inibitori tissutali delle metallo-proteasi quindi il rimodellamento della ferita è regolato da tre eventi: deposito della matrice, secrezione e attivazioni delle metallo-proteasi, presenza degli inibitori tissutali delle metallo-proteasi quindi esistono in natura delle


molecole che vengono detti TIMP che vanno ad inibire la degradazione della matrice quindi alterazioni di questi tre eventi possono portare alterazioni nel rimodellamento della ferita. Infine in cosa consiste questa resistenza della ferita? Dopo che per es. i punti della sutura sono rimossi la resistenza della ferita è solo un 10% rispetto al tessuto sano, al tessuto che non ha subito la ferita questa è la legge di Walker cioè le cellule che compongono il tessuto rigenerato non hanno la stessa resistenza del tessuto sano, dopo una settimana la resistenza della ferita è solo il 10% rispetto alla pelle sana per es. di una ferita che guarisce per prima intenzione in cui non si ha perdita di sostanza mentre nel giro di 3-4 mesi la resistenza della ferita riesce a raggiungere l’80% circa. Questo processo di guarigione della ferita è correlato anche dei fattori sistemici e quali sono i fattori sistemici che influenzano la guarigione delle ferite? Lo stato nutrizionale, lo stato metabolico, metalli e metaboliche come l’aterosclerosi, il diabete e altre malattie che rallentano lo stato di guarigione, lo stato del circolo soprattutto il circolo periferico per cui se si hanno placche ateromasiche o ipertensione essenziale si hanno turbolenze nel flusso sanguigneo o delle ostruzioni nel flusso sanguigno che rallentano questo processo. Ancora gli ormoni steroidei influenzano negativamente il processo di guarigione delle ferite anche se non tutti perchè ve ne sono alcuni che invece facilitano la guarigione delle ferite per es. gli estrogeni mentre gli androgeni si oppongono e lo stesso vale per i glucocorticoidi e questo è anche uno dei motivi perchè gli antiinfiammatori di tipo steroidei non vengono usati per una ferita ancora aperta perchè inibiscono la secrezione dei precursori delle metallo-proteasi; durante una infezione se una ferita è infetta e si ha la formazione di pus o raccolta purulenta al di sotto della ferita e sicuramente ci sarà un ritardo nella ferita fino a che non vengono rimossi gli agenti biologici nelle ferite infettate da batteri. Poi ancora fattori meccanici possono impedire la guarigione per es. se si ha una ferita sotto la pianta del piede in quel caso sarà molto più difficile che la ferita si chiuda, perchè? Perchè comunque viene esercitata una forza meccanica su quella ferita. E poi ancora la presenza di corpi estranei e perchè? Perchè i corpi estranei riflettono quelle cellule del sistema fagocitico per poter essere rimosse e quindi si ha una fase infiammatoria della guarigione ferita


che persiste a lungo fin tanto che lo stimolo del corpo estraneo non viene rimosso e alcune volte bisogna ricorrere alla rimozione chirurgica del corpo estraneo altrimenti la ferita non si chiude. Quali sono gli aspetti patologici della guarigione delle ferite? Si può avere una ferita patologica quando si ha una una inadeguata formazione di tessuto di granulazione ed una cicatrizzazione inefficiente o perchè la ferita si rompe o perchè si formano delle ulcere. Un altro aspetto patologico è l’eccessiva sintesi di matrice in questo caso si parla di cicatrici ipertrofiche o rilevate o cheloidi che diventano delle escrescenze sulla cute, oppure si può avere una retrazione della ferita per es. dovuta alla deformazione di una ferita in regione plantare o palmare oppure in conseguenza di ustioni perchè nelle ustioni si ha una perdita della sostanza quindi si hanno dei processi di contrazioni molto gravi per poter avere la guarigione. Quando si ha una guarigione in cui il tessuto parenchimale viene sostituito con del tessuto connettivale si parla in questo caso di un processo di fibrosi. Questi processi sono dovuti a uno stimolo persistente che attiva macrofagi e linfociti i quali secernono fattori di crescita, citochine, si ha una riduzione delle metallo proteasi per cui alla fine si ha una proliferazione dei fibroblasti con aumento della sintesi del collagene ed una riduzione della degradazione del collagene e delle altre proteine della matrice. Quali sono gli es. di fibrosi? Sono la cirrosi epatica, la pancreatite cronica, la fibrosi polmonare e la fibrosi renale.Quindi per concludere cosa succede in conseguenza di un danno? Si hanno risposte vascolari o cellulari, a queste risposte generalmente segue un processo infiammatorio acuto con la formazione di un essudato vascolare quindi eventi vascolari, edema di tipo infiammatorio, danno endoteliale formazione dell’essudato. Se lo stimolo che ha indotto questo processo infiammatorio viene prontamente distrutto cosa si ha ? Si ha una minima necrosi delle cellule o non si ha affatto, come conseguenza di questa minima necrosi della cellula si può avere due conseguenze: se si ha la risoluzione dell’essudato, si ha la restituzione del tessuto alla normale struttura quindi la cosiddetta resitutio ad integrum quindi se si ha un danno di natura media o di forte intensità; se invece l’essudato si organizza si può avere delle infiammazione di tipo fibrino-purulenta come le pericarditi e peritoniti questo nel caso in


cui la necrosi del tessuto è minima e quando lo stimolo che ha indotto il danno viene rimosso immediatamente. Se invece lo stimolo non è rimosso immediatamente si ha la necrosi estesa delle cellule del tessuti, se questa necrosi riguarda tessuti di cellule che non dividono mai come cellule differenziate si ha la formazione di una cicatrice ed uno di questi es. è l’infarto del miocardio. Se invece la necrosi delle cellule riguarda dei tessuti stabili o labili si possono avere due situazioni: che l’architettura del tessuto è intatta e quindi si ha la rigenerazione e il ritorno alla struttura normale per es. le broncopolmoniti dovute a pneumoniae, se invece l’architettura del tessuto è distrutta si ha la formazione di una cicatrice per es. negli ascessi batterici che poi si organizzano sono circondati da una capsula e rimangono nel tessuto in maniera cronica.


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