Scopo delle tecniche di separazione per … Una centrifuga è uno strumento progettato per produrre...
Transcript of Scopo delle tecniche di separazione per … Una centrifuga è uno strumento progettato per produrre...
CENTRIFUGAZIONE
Una centrifuga è uno strumento progettato per produrre una forza centrifuga superiore alla forza di gravità terrestre
Le particelle in soluzione se lasciate in condizioni di quiete tenderanno a sedimentare per effetto della gravità.
Per ogni particella la velocità alla quale essa sedimenta è proporzionale alla forza applicata, conseguentemente macromolecole in soluzione sedimentano più velocemente quando la forza applicata è maggiore di quella di gravità esercitata dalla terra
Scopo delle tecniche di separazione per centrifugazione
Esercitare una forza maggiore del campo gravitazionale terrestre aumentando la velocità di sedimentazione delle macromolecole, col fine di separare macromolecole che differiscono per densità, forma e dimensioni e quindi sedimentano con velocità diversa sotto l’influenza di un campo centrifugo applicato
Accelerazione centrifuga
L’ accelerazione centrifuga è definita campo centrifugo relativo (RCF)
r = raggio di rotazione
n = velocita del rotore definita come numero di ivoluzioni per minuto
RCF = 1.118r (n/1000)2
r.p.m = 945.7 RCF/r
Metodi di separazione
Sedimentazione differenziale la centrifugazione di una sospensione di particelle ad un RCF specifico per un tempo determinato provoca la formazione di un sedimento e di un sovranatante
Schema di un frazionamento di un omogenato di fegato di ratto nelle diverse frazioni subcellulari
Omogenato di fegato in saccarosio 0,25 M
Centrifugazione in gradiente di densità
Si utilizza una soluzione la cui densità aumenta in gradiente
Contiunuo (a)
Discontinuo (b)
Una barriera di densità a gradino singolo per sedimentare selettivamente una particella (c)
Gradienti
Centrifugazione Zonale
Si crea un gradiente poco ripido e le macromolecole si separeranno in funzione della massa ( quelle più grandi si muoveranno più velocemente)
Centrifugazione Isopicnica
Si basa sulla formazione di un gradiente ripido (molte sostanze come il saccarosio, il ficoll, creano dei gradienti durante la centrifugazione)
Si mescola il campione da separare con la sostanza appropriata e si centrifuga per il tempo necessario per la formazione dei gradienti
Le particelle sedimentano in funzione della loro densità.( si posizionano dove la loro densità è uguale a quella del mezzo
TIPI DI CENTRIFUGHE (refrigerate e non refrigerate)
Centrifughe a bassa velocià (max 3000-6000 g.) si usano per raccogliere arganelli i grandi dimensioni e precipitati grossolani
Microcentrifughe (10000 g.) sono capaci di accelerazioni rapide
Centrifughe a flusso continuo utili per raccogliere grandi volumi di cellule. Durante la centrifugazione le particelle sedimetano mentre il liquido scorre attraverso il rotore
Centrifughe ad alta velocità (max 60000g) utili per frazionamento cellulare
Ultracentrifughe (MAX 600000 g) possiedono sistemi di vuoto e refrigerazione sofisticati e vengono usate per isolare piccoli organelli come i ribosomi e le vescicole di membrana
Rotore con provette verticaliSono usati per la separazione isopicnica in gradiente di densità nelle centrifughe ad alta velocità e nelle ultracentrifughe
IMP: Non si possono utilizzare per particelle in sospensione perché non si forma sedimento