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Ricerche sui pigmentifotosintetici di Gracilariaverrucosa (Huds.) Papenfuss.Dosaggio quantitativo dellaficoeritrinaLaura Talarico Bisiacchi a & Vera Kosovel aa Istituto e Orto Botanico dell'Università di Trieste.Published online: 14 Sep 2009.

To cite this article: Laura Talarico Bisiacchi & Vera Kosovel (1975) Ricerche suipigmenti fotosintetici di Gracilaria verrucosa (Huds.) Papenfuss. Dosaggio quantitativodella ficoeritrina, Giornale botanico italiano: Official Journal of the Societa BotanicaItaliana, 109:4-5, 205-219, DOI: 10.1080/11263507509426385

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Giotn. Bot. Ital., 109: 205-219, 197.5

Ricerche sui pigmenti fotosintctici di Gracilaria verrucosa (Huds.) Papenfuss. Dosaggio quantitativo della ficoeritrina ::

LAURA TALARICO BISIACCHI e VERA KOSOVEL Istituto e Orto Botanic0 dell’Universiti d i Trieste.

In Rzdazione il 19 hlovenibre 1974 I n Tipografia il I0 Afarzo 1975

ABSTRACT. - Kesearch on phofosynfhefic pignzerzfs froria Gracilariu verriicosa (Huds.) Papeirjrrss. Qiraufifafive analysis of phjcoeryfhrin. - Among biliproteins of Rhodophycean algae, phycoerythrin is very interesting for constant distri- bution, in large amounts, in the different species. Phycoerythrin’s extinction coefficients have been already calculated for some Bangiophycean and only two spccies of Rhodophycean algae. I n this work w e have analyzed all photosynthetic pigments and isolated pure phycocrythrin from Gracilariu 3er- riicofa (Huds.) Papenfuss [ = GracZaria confervoides (L.) Grev.] belonging to Gigarhales. The aim of our research was to evaluate the quantitative ratio between this pigment and the others in a sistematic group for which there are only qualitative data. Phycoerythrin of Gracilaria is the Rclassical type, with three absorption maxima. Average values of absorption coefficients, calculated on n large number of samples are E:cm (565 nm) = 53.8, E:cm (540 nm) = 48.4, E:xcm (498 nm) = 49.1. These values are different from those obtained for R-phycoerythrin of Cerarniiim titbrrrrn and Bphycocrythrin of Rhodochorfon flori- dtrltmt, both species belonging to Roridean algae. Our several experiments by chromatography and gel-electrophoresis process hive demonstrated that the R- phycoerythrin me isolated is substantially pure. Thus we suggest that different absorption coeficient values are due cither to a more complicated protein in the pigment molecule or to n different chromophorc/protein ratio. This could result very intcrcsting for the chemotaxonomic and phylogenetic aspect, but the small number of algae till now analyzed docs not allow to draw any general conclusion.

INTRODUZIONE

La ficoeritrina, isolata per la prima volta da Callifhaiunion e Grij’ithsia (KUT- ZING, 1843), i. stata ed i: ancor oggi un interessante oggetto di studio, assicme agli altri sirnili pigmenti presenti nell’apparato fotosintetico delle Rhodophyceae, Cy- anophyceae e Cryptophycene. Queste sostanze, indicate da O’HEOCHA ( 1958) col ter- mine di biliproteine, sono costituite da una parte proteica (la cui natura 2 stata individuata gih a suo tempo da MOLISCII nel 1894) associata a dei gruppi cromofori,

‘Lavoro eseguito nell‘ambito di un programma di riccrca finanziato dal CNR e diretto dal Prof. Edmondo Honsell dcll’Unirersitb di Tricste.

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le ficobilinc, cornposti tctrapirroki a catena aperta sirnili ai pigmenti biliari (LEh‘I- BERG, 1930; LEhrBERG e BADER, 1933). Lc ficobilinc chc in vario mod0 si distri- buiscono nelle diverse biliproteine sono essenzialmente trc, la ficoeritrobilina, la ficocianobilina c la ficourobilina (CmPhiAN, COLE c SIEcELhT AN, 1967; RUDIGER, O’CARRA c O’IlEOCIiA, 1967). Qucstc,-combinandosi in rapporti qualitativi e quan- titativi divcrsi con la partc proteica dclla molecola, sono responsabili dcgli spettri di assorbimento caratteristici di ciascuna biliproteina (O’IIEOCIIA, 1971 ). In base alle caratteristiche diverse si distinguono sei biliproteinc (C, - B, - R - ficocritrina; C, - R - ficocianina ed alloficocianina), le quali tuttavia si possono riunire in trc gruppi bcn distinti per lc lor0 carat teristiche immunologiche (ficoeritrine, ficocia- nine, alloficocianine; GLAZER, COIIEN-BAZIKE e STAINER, 197 1).

Dcllc ficocritrinc il tipo << C )> si trova soltanto nelle Cyaizophyceae, il tip0 cc B )> & prcvalcntc ncllc Bangiophycear, mcntrc il tip0 c( R D con lc sue varianti i: largamente diffuso nelle Florideae (SVEDBERG e ERIKSSON, 1932; HIROSE e KU- hlANO, 1966; BOXEY e \vIIITE, 1968; HIROSE, KUhiAtiO c MADONO, 1969; VAN DER VELDE, 1973).

Non vi -5 relazionc alcuna invcce tra lo spcttro di assorbimento ncl visibilc e composizione in aminoacidi della porzione proteica, ma non E da escludere chc anche la costituzionc dclla proteina possa avere qualche influenza, sia purc entro limiti ristretti, sulla posizionc dci picchi di massimo assorbimento (O’HEOCHA, 1971). Gli aminoacidi identificati nclla R - ficoeritrina sono, sccondo HAXO c O’IIEOCHA (1960), diciasscttc, con prevalenza di quclli a carattere acido. Da un punto di vista quantitativo, la R - ficocritrina 6 costituita pcr 1’85% di aminoacidi, mentrc le ficobiline non superano il 7% (RAFTERY e O’IIEOCHA, 1965).

Intcrcssanti, soprattutto per l’analisi quantitativa di questi pigmenti in rap- porto alla clorofilla c ai carotenoidi, sono gli studi fatti per definirc il valore del lor0 cocfficicntc di estinzione. I dati finora pubblicati ripardano la ficoeritrina di tre Bmgiophyceae c prccisamente Porphyra tenern ( LEMBERG, 1928), Porphyra lancirzala ( O’CARRA, 1965) c Bnngin frrscoprrrprrrea ( LE BOURIIIS, 1965), due Florideae, Ceranzirrm riibrrinz e Rhodochorton floridrrlrrm ( O’CARRA, 1965) c due Cyanophyceae. I valori ottenuti sono abbastanza omogenei per Ie R - ficoeritrinc ma molto divcrsi per lc C-ficoeritrine, sia rispetto lc prime chc fra di loro (Tab. 1).

Nel presente lavoro abbiamo voluto studiare la ficoeritrina di Gracilaria ver- rricosu (Huds.) Papenfuss, una specie di Gigartiuales, ordine per il quale si hanno in merito dati molto scarsi c di carattere soltanto qualitativo, e definire il valore del suo cocfficiente d’estinzione, in corrispondenza dei massimi di assorbimcnto dcl cromoforo, usando, anche a1 fine di poter far validi confronti, metodi sostan- zialmcntc analoghi a quclli impiegati da altri Autori (HATTORI e FUJTA, 1959; O’CARRA, 1965; LE BOURHIS, 1965).

Infatti le biliprotcinc delle alghe sono state ancora poco studiatc sotto questo punto di vista c si 6 ritenuto utile portare un ulteriorc contributo alla conosccnza di qucstc sostanze che hanno notevole importanza fisiologica ed il cui studio pub portare interessanti contributi di carattere chcmiosistematico e filo- genetico.

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TABELLA 1 Tabella riassuntiva dei corfficienfi di erfiiizione delte f icoerifr i tw estraf f e da Rhodophyceae e Cyanophjceae. Reported extitictioti coefficients o/ Rhodophycean arid Cyanophycean phjcoeryfhrins.

CoclTcicnti d'estinzione

565 nm 545 nm 5M) nm Ficocri t rina

RllOWPlIYCL4E

llangia fiiscopiirpitrea (LE BOURIIIS. 1965) Porphyra luncinala (O'CARR~. 1965) Porphyra lenera ( L E ~ E R C , 1928) Rhodociiorlott floridufunt (O'CARR~. 1965) Cerumitcttr rubrum (O'CIUULI, 1965) Gracifaria verriicosa

CYAIOFIIYUL4E

Phormidiicm pericinum (O'Cmt, 1965) Tafypolltru lenuis (HAITORI-FUJITA, 1959)

8.63 - 6.67 8.15 - - 7.90 6.50 5.70 - 8.23 - 8.02 - - 5.33 4.43 4.21

12.53 - - 28.50 - -

C C

hlATERIALE E AETODO

Le nostrc ricerche sono state condottc su un'alga rossa appartenentc alla classe dellc Florideae, Gracilaria verriicosa (Gracifaria confervoides Grev.). Fra Ic Gigarhales della nostra regione, Gracilaria verrticosa & la specie pih facilmente reperibile, in quanto 2: abbondante soprattutto nei canali della laguna d i Grado, dove vive su fondo limoso, a 2-3 metri d i profonditi e forma poplamenti abbastanza puri.

I1 materiale studiato & stato prclevato in due periodi dell'anno, per lo pi3 in febbraio c in aprile, nel 1971 e 1972 ed E: stata posta particolare cura chc non venisse danneggiato durante il trasporto dall'ambientc naturale in laboratorio. Dopo una prima rernita per eliminare eventuali altri organismi ed epifite, i campioni, ulteriorrnente :ontrollati con un microscopio binoculare a piccolo ingrandimento, sono stati asciugati iccuratamente con carta da filtro, pesati, posti in sacchetti d i plastica ermeticamente :hiusi e messi in congelatore 3 -24"C, dove venivano prelevati a1 momento di essere jottoposti ai procedimenti d i estrazione.

Le tccniche usate per la preparazione e lo studio dei pigmenti idrosolubili sono :e seguenti:

a) Frantumazione del rnateriale congelato in mortaio con sabbia d i quarzo a m s a temperatura (4°C) in tampone fosfato 0,005 M a p H 6,s e in ambiente poco lluminato, data la labilith d i questi pigmenti alla lucc c a temperature pih elevate.

b ) Diffusione nello stesso tampone, con controlli periodici del surnatante all0 pettrofotometro (Beckman DB-G a reticolo con registratore), dopo centrifugazione a ;oooxg per 20 minuti, a110 scop di clirninare Ic particclle in sospcnsionc e l e pro- eine denaturate. La diffusione veniva ritenuta complcta quando non si .rilevava pih, n tempi succcssivi, alcun aumcnto delle densiti ottiche ai massimi d i assorbimento lellc biliproteinc.

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c) Purificazione dcll’estratto totale su colonna crornatografica di Scphadcx G 25, chc abbiarno preferito alle normali dialisi pcr In maggior rapidith c la miglior resa, dimostrate nel corso di numcrosi esperimenti.

Lo schema della precipitazione frazionata con solfato di amrnonio 2: stato mess0 a punto dopo pgrccchie prove preliminari. Negli cspcrimenti abbiamo trovato pih utile, ai fini di una migliorc purificazione, procedere ad una precipitazionc graduale (20%, 35%, 45y0) piuttosto chc a ripetute prccipitazioni ai massimi intervalli di saturazionc, metodo qucsto applicato da LEIBO e JONES (1964) per la ficocritrina di Porphjridiirm cruemtirm. L’intcrvallo ottimale in cui precipitano le biliproteine di Gruciluriu i: tra il 45% c il 50%. Un valorc analog0 E stato trovato (40%-50%) per Ceruamirm rzrbrzrrir (JONES e FUJIhIORI , 1961) cd altre Rhodophjceue (HIROSE e Kuh¶Ah’O, 1966; HIROSE, K u h I A h ‘ o e MAWSO, 1969). Per le Bungiophgceur come Porphyru terreru (SVEDBERC e KATZURAI, 1929) e Burzgiu frrscopirrpirreu (LE BOURIIIS, 1965) si i: visto che la ficoeri- trina precipita rispettivamente intorno a1 25% c a1 37% di saturazione di (NH,),SO,.

I1 prccipitato a1 4596, ridisciolto in tampone fosfato 0,005 M a pH 6,8 veniva quindi nomatografato su colonna di idrossiapatite mescolata a Celite 545 (LE BOUR~IIS, 1965). Si procedeva all’cluizione mediante un gradiente di tampone fosfato da 0,005 hl a 0,1 h.1 allo stesso pH. Questo tipo di cromatografia E quello che ci ha dato i migliori risultati rispctto ad altri come per esempio qucllo con DEAE ccllulosa. Con quest’ul- tima, pur ricavando ottime separazioni per la ficoeritrina, si manifcstava l’inconvenicnte che Ie aItre biliproteine venivano assorbite in maniera irreversibile.

La prima frazione della cromatografia conteneva una soluzione di ficoeritrina con un clcvato tasso di purezza. Da qucsta vcniva quindi allontanato il tampone per mezzo di una dialisi contro acqua distillata.

Una parte della soluzionc scrviva per ottencre una serie di diluizioni per la lct- turn delle corrispondcnti densitj. ottiche allo spettrofotometro. L’altra veniva essicata allo scopo di ottcncre una certa quantith di ficoeritrina pura sccca.

d ) Elcttroforesi discontinua su gel di poliacrilamide: i campioni cod purificati erano sottoposti ad un’elettroforesi discontinua prc-

parativa su gel di poliacrilamide in tampone TRIS-glicina a pH 8,3 con controllo spet- trofotometrico in continuo dcIle frazioni migrate.

Un ultimo controllo veniva quindi escguito con un’elcttroforcsi discontinua ana- litica in sistcma anionic0 seguita da una colorazione con Nero d’amido.

Per quanto concerne lo studio dei pigmenti liposolubili sono state eseguite le se- g u e d operazioni per l’cstrazione e la purificazione:

a) Prantumazione del materiale congelato in mortaio con sabbia di quarzo ed acctonc all’8095.

b) Estrazione in acetone a11’80%, separazionc c centrifugazione dcl surnatante, aggiunta di nuovo acetone, ripctcndo l’operazione finch6 l’acctone rimaneva incolorc. L’estratto acetonico totale, dopo un’ulteriore centrifugazione, veniva esaminato a110 spet- trofotometro.

c) A1 residuo veniva aggiunto tampone fosfato 0,005 M a pH 6,8 per l’estra- zione dei pigmenti idrosolubili. Qucsto procedimcnto favorisce l’estraibiliti dci pigmenti liposolubili ( LE B o u m I s , 1965). Si procedeva nuovamente ad un’cstrazione acetonica del residuo c alla lettura spettrofotometrica dopo ccntrifugazione. Tutte Ie operazioni venivano eseguite a h e attenuata a tempemtura di 4”C, nel corso delle 24 ore.

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PARTE SPERIMENTALE

a) Diffusione dei piguzen/i idrosolribili. La diffusione dellc biliproteine di Grrrciluriu, cscguita con le metodiche gih indicate, 5 rclativamente lenta (talvolta sono neccssari anche pih di venti giorni pcrchC essa sia completa). Tuttavia, ope- rando in condizioni adattc, si ha una perfetta conservazione dci pigmenti che, alla fine dcl processo, non prcscntano segni di denaturazione.

Fig. 1 -

-

0 . 10 t o 30 giorno

Andamento della diffusione dei pigmenti idrosolubili. A- ficoeritrina. B- ficocianina. C- alloficocianina. Optical Densities of biliproteins during a diffusion D into water solution. A- phycoerythrin. B - phycocyanin. C- allophycocyanin.

L’andamento della diffusionc (Fig. 1 ), controllato con periodici esami allo spcttrofotometro, in corrispondenza dci massimi di assorbimento caratteristici dei tre pigmenti biliproteici prescnti, ha dimostrato che dai talli intcri o triturati in maniera blanda, i tre pigmenti diffondono in modo differcnziato. All’inizio com- pare soltanto la ficoeritrina, mentre, in tempi successivi, si evidenziano rispctti- vamcnte In ficocianina c I’alloficocianina. Se invece i talli sono triturati a fondo, in modo da avcre un vero e proprio omogenato, allora i pigmenti si mettono in evidenza contemporaneamcnte. Nell’omogcnato le cellule e i relativi organclli sono in gran parte disgrcgati ed 2 prcsurnib-ile chc nella sospcnsionc siano presenti tila- coidi con ficobilisomi non pih isolati dalla membrana plastidiale. I n Fig. 1 6 r a p

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prcsentato l’andamento dclla diffusionc delle biliprotcinc da inatcriale triturato blandamente. I1 grafico rappresenta le variazioni della dcnsith ottica rilcvata ogni giorno, in corrispondenza dei massimi di assorbimcnto a 565 nm per la ficocri- trina, 610 nm per la ficocianina, 650 nm pcr la alloficocianina. Data la diversiti degli spettri di assorbimento dei tre pigmenti, I’infl uenza rcciproca (pur cssendo contenuti nella stcssa soluzione) i? irrilevante.

0.C

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

56: n

0

Fig. 2 - Spcttro di assorbimento dell’estratto greuo dei pigmenti idrosolubili: 498 nrn, 538 nm,

- Absorption spectrum of biliproteins aqueous extract: 498 nm, 538 nm, 563 nrn = 563 nrn = ficoeritrina, 612 nrn = ficocianina, 648 nrn = alloficocianina.

phycoerythrin, 612 nm = phycocyanin, 648 nrn = allophycocyanin.

b ) Atzalisi dei pigmenti idrosoliibili. A1 terrninc delIa diffusione, il sopra- natante rapprescnta l’estratto totale delle sostanze idrosolubili contcnute nci talli di Gracilaria verrucosa. Nello spettro di assorbimento (Fig. 2) si possono osser- vare nel visibile cinque massimi di assorbimento alle lunghczze d’onda d i 498 nm, 538 nm, 563 nm, 612 nm, 648 nm.

Nell’ultraviolctto si notano forti assorbimenti, dovuti cssenzialmcnte a pro- teine incolori, acidi nucleici etc., che determinano uno spostamento dclla posi- zionc dci massimi (in senso orizzontale) ed una variazione dei rapporti relativi

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tra lc dcnsith ottiche dci singoli picchi. Tuttavia, data l’elcvata concentrazionc dclla ficoeritrina c dcgli altri pigmenti biliprotcici, i: possibile fare, anche nello estratto grezzo, un’analisi qualitativa. In particolare, sono molto bcn caratteriz- zate la ficoeritrina (498 nm, 538 nm, 563 nm), la ficocianina (612 nm) c I’allo- ficocianina (648 nm).

Con la precipitazione frazionata e la succcssiva separazione su colonna di idrossiapatitc si ottengono csclusivamente biliprotcine purificate. La prima fra- zione contienc soltanto ficoeritrina pura, le successive, miscele di ficocianina c ficoeritrina (quest’ultima in quantitii estremamentc ridotta).

D.0

0.3

Q2

0.1

565 nrn

280nrn

370nrn I 0 ’ 200 300 400 500 600 700 nrn

Fig. 3 - Spettro di assorbimento della R-ficoeritrina isolata da Grucilariu verrrrcosa. I1 tasso

- Absorption spectrum of R-phycoerythrin isolated from Graciluriu verrrrcosu (D.O. di purcua (D.O. 565 nm/D.O. 280 nm) & uguale a 3,5.

565/D.O. 280 = 33).

11 controllo della purczza dei pigmenti biliproteici viene effettuato in base alla misura dcl rapporto tra i massimi di assorbimento dei cromofori e qucllo nell’ultraviolctto, a 280 nm (picco delle proteine totali) (BANNISTER, 1954). Se, dopo una scrie di purificazioni, questo rapporto si stabilizza su di un certo valore, il pigmento viene considerato puro in quanto l’assorbimento a 280 nm i: dovuto soltanto agli aminoacidi (tirosina e triptofano) della parte proteica di csso e non ad altre proteine in soluzione.

La purczza dei campioni di ficoeritrina 2 stata confermata dalle elettroforesi discontinue su gel di poliacrilamidc. Quest0 metodo i: oggi normalmente usato per valutarc la purezza di protcine in soluzionc (CHAPhfAN, 1973).

La frazione di ficocritrina i: caratterizzata da massimi di assorbimento a: 280 nm, 310 nm, 370 nm, 498 nm, 540 nm, 565 nm, (Fig. 3).

L. TAIARICO BISIACCII~ e V. KOSOVEL - Dosaggio della ficoerirrina br Gracilaria I’erriico.a 211

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Questi valori che differiscono lcggcrmente da quclli dcgli estratti totali (in conscguenza dclla purificazione), indicano chc si tratta dclla R - ficoeritrina nella forma tipica. Per calcolarnc la purczza, abbiamo considcrato il massimo di assorbimcnto a 565 nm, in quanto, se la biliprotcina presenta un inizio di dena- turazione, questo 2: il primo a ridursi pcr poi scomparire.

I1 tasso di purezza del carnpione di ficoeritrina rapprescntato in Pig. 3 cor- risponde a 3,5 e rappresenta il valote da noi ottenuto nell’analisi della quasi to- taliti dei campioni csaminati. Nclle numerose estrazioni e purificazioni abbiamo ottcnuto anche alcuni valori estrcmi pari a 3 e 4,5.

Durante I’elettroforesi discontinua preparativa si nota la migrazionc di una unica banda omogenea colorata. I1 tasso di purezza riferito a questa frazione risulta sostanzialmente analog0 a quello delle frazioni ottenute dalla cromato- grafia su idrossiapatite, anche se si assiste ad un leggero aumento del picco a 280 nm rispetto a quello a 565 nm.

Nella scparazione per mezzo dell’elcttroforesi analitica, accanto all’unica banda colorata dclla ficoeritrina, si osserva un alone che da reazione positiva con Nero d’arnido. Si tratta quindi di protcinc incolori che migrano in stretto contatto col pigmento. La quantiti di esse pcrb in rapport0 alla ficoeritrina, cspressa in valori percentuali, 6 assolutarnente trascurabile (l/lOOO circa).

Degli altri pigmcnti biliproteici, la ficocianina 2: prcsente in concentrazioni bassc rclativarnente alla ficoeritrina. Questo comporta una notevole difficolta di purificazione e separazione completa di cssa. Risulta quindi piG difficile la valuta- zione qualitativa, in quanto, dclle suc ficocianine note, la C- e la R - ficocianina, la prima ha un solo massimo bcn separato, la scconda ne ha due, uno dei quali coincide con il massimo intermedio della R - ficoeritrina.

L’csame di frazioni pure di ficoeritrina e di miscele di quest’ultima con la ficocianina, ci indurrebbe a pensare che la ficocianina presente sia di tip0 C, in quanto variazioni di concentrazionc dcll’una rispetto all’altra non portano varia- zioni di densite ottica in corrispondcnza dcl massimo intcrmedio della R - fico- eritrina (Fig. 4). Tuttavia l’analisi dclle curve di assorbimento, effettuata mediante un programma a1 calcolatore ellettronico, rivela la prcsenza di una ficocianina a duc massimi di assorbirnento ncgli estratti grezzi. I1 massirno a 553 nm tende a scomparire negli cstratti purificati, mentre permane quello a 615 nm, anche questo dopo purificazioni spinte. Una trattazione specifica su questo argomento & in corso di elaborazione.

L‘alloficocianina, si pub determinate giB neu’estratto grezzo (Fig. 2) poich6 i: semprc presente con il massirno a 648 nm, ben definito e non coincidente con quelLi degli altri pigmenti.

c) Calcolo del coeficiente d’estiirziorre della R - ficoeritrina. I1 coefficicnte d’estinzione della ficoeritrina i: stato da noi calcolato in base alla legge di Lam- bert-Beer su una scrie di campioni diversi, ottencndo risultati con variazioni con- tenute entro il 10%.

I1 valore della concentrazionc dclla soluzione di pattenza i. stato ottenuto facendo essiccare un volume noto di cssa e pcsando il residuo solido dato dalla sola

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ficoeritrina. In base allc densith ottichc misuratc abbiamo calcolato in corrispon- denza dci tre massimi di assorbimcnto nel visibile, i tre corrispondenti cocffi- cienti di estinzione. Come 6 noto, il valorc del coefficiente di estinzione 5 co- stante soltanto entro una ccrta gamma di diluizioni e nel caso dclla ficoeritrina, come dcl resto di tutte le sostanze fluorescenti, si possono were variazioni di csso soprattutto alle maggiori diluizioni.

D.O.

0.2-

0.1. . . I: 615 nrn

- 200 300 400 500 GOO 700 nrn

Fig. 4 - Spettro di assorbimento della frazionc di ficocianina in presenza di Ccoeritrina: 615

- Absorption spectrum of not completely purified phycocyanin: 615 nm = phyce nm = ficocianina.

cyanin.

I dati da noi ottenuti sono rapprescntati nel grafico di Fig. 5. Da esso risulta che per le concentrazioni supcriori a 50-60 mg/l il coefficiente d'cstinzione calco- lato non vatia cntro limiti apprezzabili e pcrtanto la funzione 6 da considerarsi lineare. A1 di sotto di queste concentrazioni si nota, per ciascuno dei coefkienti una gtaduale diminuzione. L'intervallo di conccntrazioni per il quale la funzione 5 linearc I: sufficicntementc ampio e va da circa 50 mg/l a 180 mg/l, il valorc massimo da noi considerato, con densith ottiche da 0,3 a quasi 1.

I vnlori medi dei coefficienti di estinzione ai tre massimi di assorbimento dclla ficoeritrina per conccntrazioni superiori a 50 mg/l sono rispettivamente: 5,38 per il massimo a 565 nm, 4,48 per qucllo a 540 nm, 4,21 per quello a 498 nm (Fig. 5) .

d ) Atialisi dei pigmeid liposolubili. Nell'estratto acetonico sono contenuti tutti i pigmcnti liposolubili prcsenti nei cromatofori di Gracilaria verrzicosa. Dal- I'analisi spettrofotometrica nel visibile, senza operare ulteriori separazioni, 2 pos- sibile ottenerc dati sufficientemente precisi dal punto di vista qualitativo e quan- titativo ( LE BoumIs, 1965). Infatti, analizzando lo spettro di assorbimento dello estratto, appare bcn evidente che nella specie da noi studiata i: contcnuta soltanto la clorofilla a, caratterizzata dal massimo a 665 nm. Dalla densitj. ottica rilevata

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a qucsta lunghezza d'onda, sulla qualc non influiscono altrc componcnti, si pub cnlcolarc, in base a1 cofficiente d'estinzione g i i noto (Mc KINNEY, 1940), la quan- tit3 del pigmcnto.

D.O.

1

0.9,.

0 8 . .

0.7..

06..

0.5 ' .

0 4 . .

0.3..

0.2 ..

0.1

0 0

'.

i 565nm

/'

'

23 4 0 60 80 100 120 I40 160 180 m$

- D.O. valucs, for known concentrations, related to 565 nm, 510 nm, 498 nm absor- ption maxima of K-phycoerythrin from & d z r i u t'errucosu. Function is linear.

Per quanto riguarda i carotenoidi, anchc questi, ncl loro complesso sono facil- mente rilcvabili. Second0 LE BoumiIs (1965) il massimo di assorbimento a 475 nm 1: sufficicntemcntc significativo per una valutazione quantitativa in quanto, a

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qucsta lunghczza d’onda, l’assorbimento dclla clorofilla i: trascurabile. Pert anto, in base a1 coefficicntc d’estinzione calcolato’ da RICHARDS (1952) pcr qucsta lun- ghezza d’onda, possiamo calcolare la quantitj. di carotenoidi totali.

e) Rapporti qiiaiifitafiui fra la ficoeriirina, clorofilla G n D e carotenoidi. I1 dosaggio quantitativo della ficoeritrina, della clorofilla e dei carotenoidi, escguito su di un ccrto numero di campioni raccolti nel mese di febbraio, periodo nel quale l’alga prescnta il piij elevato contenuto in pigmenti biliproteici, ci ha per- messo di rilevare i seguenti valori mcdi. Su dieci grammi di talli frcschi si ha un contenuto medio di 43,92 mg di ficoeritrina, di 2,58 mg di clorofilla e di 0,53 mg di carotcnoidi totali. I rapporti in peso di qucsti componenti sono quindi circa 83 : 5 : 1.

Questi rapporti pur essendo omogenei in pih campioni raccolti ncllo stesso pcriodo c nello stesso ambiente possono prcscntare variazioni pih o meno ampic in rapporto a fattori ecologici. Attualmente abbiamo in corso una ricerca per rile- vare questc variazioni nei diversi mcsi dell’anno.

DISCUSSIONE E CONCLUSION1

Dalle nostre osservazioni sull’andamento della diffusione dci pigmenti idro- solubili abbiamo constatato che, come 2: stato rilevato da GIRAUD (1963) in Rho- dosorris marintis e LE BOURHIS ( 1965) in Bangia friscoprrrpirrea, esistono sensi- bili differenze fra la ficoeritrina, la ficocianina e l’alloficocianina. Infatti, durante questo processo, chc si compie in tempi relativamente lunghi, la ficoeritrina i: la prima a diffondcre dal materiale blandamentc triturato. L‘analisi della cutva di diffusionc, che 2: decisamente di tip0 logaritrnico, fa pensare che il pigmento passi dal materiale triturato nclla soluzionc, per fenomeni di carattcrc fisico. LE BOURIIIS (1965) intcrpreta allo stesso mod0 l’analogo fenomeno osscrvato per la ficoeri- trina nei suoi studi su Bangiu fuscopurpitrea e sottolinea il fatto chc 6 molto probabilc la mancanza di stretti lcgami di natura chimica fra la ficoeritrina e le strutture del plastidio. Cib 2: ulteriormente confermato da GANTT e LIPSCHULTZ (1973) con ricerche sui processi di trasferimcnto di energia nei ficobilisomi di Porphyridirim crrientrrrn: second0 questi autori la ficocritrina sarebbe localizzata nella parte estrema del ficobilisoma, mentre la ficocianina e la alloficocianina sareb- bcro in contatto diretto con le strutture lamellari del plastidio. Una situazione del genere si ha probabilmcnte anche in Gracilaria e la curva di diffusione da noi ri- scontrata potrebbe avvalorare questa interpretazione.

Per quanto concerne iI rapporto fra i diversi pigmenti deIl’apparato fotosin- tetico, nelle nostrc riccrche, abbiamo rilevato alcuni dati relativi a1 periodo ncl quale la Gracilaria prcscnta il pih clcvato contenuto di biliproteine, cioC alla fine dcl pcriodo invcrnale. Da ricerche attualmente in corso risulta che questi rapporti presentano una certa variabilith nei diversi mcsi dcll’anno. Ci6 2 stato constatato anche in Bartgiu da LE BOURHIS (1965) su campioni prelevati nell’ambiente natu- ralc in divcrsi pcriodi. I1 problema della variazione quantitativa di qucsti pig- mcnti E molto complesso cd 2: legato a variazioni di fattori ecologici come t e m p

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ratura c luce, a fattori nutrizionali (CALAIWESE c FELICINI, 1970) c anche molt0 probabilmentc a quelli connessi a1 ciclo vegctativo dell’alga.

Dal punto di vista qualitativo notiamo che in Grmi[uriu uerriicosu sono pre- senti tre dei pigmenti finora osservati nclle Alghc rossc c prccisamente la R- ficocritrina, una ficocianina c l’alloficocianina.

i n lettcratura non ci sono dati riguardanti un estratto grezzo totale dei pig- menti idrosolubili di quest’alga, anchc sc P stata studiata in lavori nci quali ve- niva presa in considerazionc soltanto la ficocritrina di diverse Rbodophpeae, senza implicazioni quantitative (HIROSE c KuhIANo, 1966; VAN DER VELDE, 1973).

Uno spettro analog0 n quello dell’estratto grczzo di Gracilaria verrricosn 6 stato da noi osservato anchc per Graciluria compressa, specie gii esaminata qua- litativamentc da CALABRESE e I:ELICINI (1973), i quali hanno riscontrato lo stesso tip0 di pigmenti da noi rilevato.

Abbiamo posto particolare attenzione alla R-ficoeritrina dal momcnto chc essa si presenta in quantitd rilcvantc rispetto alle altre biliproteinc di questa specie c risulta significativa per la sua larga disiribuzione nelle Rhodophpceae finora ana- lizzate.

Gli spcttri di assorbimcnto delle R-ficoeritrine presentano variazioni, sia per quanto riguarda la configurazionc dclla curva, come in Sebdenziu monordiutiu (O’HEOCHA, 1971) che presenta una <( spalla )> invece del massimo intermedio, sia per i massimi di assorbimento (HIROSE, KUMANO e MADOXO, 1969). Mentre la R-ficoeritrina del primo tipo pub esscre considerata una Vera e propria variante (2 stata osservata da numerosi Autori c da noi in parecchic spccie di Rhodophyceae), a nostro avviso non si pub affermare la stessa cosa per le R-ficoeritrine che prescn- tan0 solo lcggeri spostnmenti dei tre massimi di assorbimento rispctto alle lun- ghezze d’onda dclla R-ficoeritrina di Ceramirm rirbrritlr definita da O’HEOCITA (1971) come a classica D. Queste variazioni si possono attribuire infatti ai diversi metodi di estrazione adottati cd cssenzialmente a proccdimenti di purificazione parziali. Abbiamo osservato, come si pub dedurre da una panoramica dei grafici dall’cstratto grezzo alla ficoeritrina pura, chc, man mano si procede con la pu- rificazione, si abbassa il <( fondo )> responsabilc dcgli spostamenti dci massimi a lunghezze d’onda supcriori. Ultima causa di questc diffcrcnze, possono m e r e OV-

viamente anche gli eventuali errori strumentali. Sulla base di queste considerazioni In R-ficocritrina di Graciluria verrricozu,

per le sue carattcristichc, 6 da considcrarsi appartcnentc a1 tip0 <( classic0 D. I1 criterio generalmcntc adottato pcr valutare il tasso di purezza delle ficoeri-

trine (D.O. a 565 nm/D.O. a 280 nm) 6 , alla luce degli studi pi& recenti, rite- nuto insuflicicntc nel confrontare le purezzc, in quanto, non essendo le condizioni sperimcntali (tcmpcratura, pH, concentrazione, form ionica) sempre costanti nelk preparazioni, qucsto rapport0 non 6 pcrfettamente comparabilc (CIIAPhIAN, 1973 ). Second0 questo criterio, il nostro tasso di purczza, riferito agli altri finora riscon- trati c per i quali sono stati calcolati i diversi cocficienti di estinzionc (Tab. 11, 6 piuttosto basso. Qucsto valorc tuttavia non pub esserc attribuito ad una pu- rificazione insufficiente, in quanto le analisi clcttroforetiche hanno dimostrato per i nostri campioni un grado di purezza molto clcvato. Non solo, ma anche, a1 con-

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trario di quanto rilevato da GANTT (1969) per la B-ficocritrina di Porphyriditiiu criieiittitii, la R-ficocritrina di Gracilaria vcrrticosa E , sotto tutti i punti di vista omogenea, cioe non si suddivide in pih bande anchc con !a tccnica clcttroforetica.

I1 confront0 fra i! valore del coefficientc d’cstinzionc da noi ottcnuto con quc!!i finora misurati (due per le Floridcue, trc per le Batrgiophyceae c due per !e Cyarzophyceae) indica che csistono dc!!e differenze abbastanza scnsibili e che quello di Gracifaria E il pih basso finora riscontrato. Qucsto fatto potrebbe esscrc intcr- prctato ammettendo chc in questa spccic la partc proteica del pigmcnto sia pih abbondante: talc interprctazione, pcrb, dovrebbe venire confcrrnata per mezzo di una indaginc pih approfondita sulla parte proteica isolata dal cromoforo. Comun- que, sulla base delle nostre osscrvazioni, si pub ragionevolmente affermarc che il rapport0 fra partc protcica e cromoforo di questa ficoeritrina sia diverso dalle dtre.

11 problcrna de! significato della variazionc di questi rapporti i: scnz’altro molto intcressante, anchc per le implicazioni filogenetiche c chemiotassonomiche che pub presentarc.

Tuttavia Ic attuali conosccnzc, soprattutto per quanto riguarda il numcro delle specie studiate, sono ancora troppo scarse per poter affrontarc i! problcma da qucsto punto di vista.

Rirrgraziumerrfo - Ringraziamo scntitarnente il Prof. Edrnorido ltonsell per le stirnolanti discus- sioni e la revisione critica dcl 13VOrO.

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RIASSUNTO

Nello studio delle biliproteine prcscnti nelle Rbodophyceae, la ficoeritrina con le sue varianti riveste particolare intcrcsse per la sua costante distrib,uzione, in notevoli quantith, ndlc diverse specie. Per valutare i suoi rapporti quantitativi con gli altri pigmenti idrosolubili e liposolubili dell'apparato fotosintctico, sono stati calcolati finora i coefficicnti di cstinzione di alcune Bangiophyceae e soltanto di due Florideae. Nel prescntc Iavoro, oltrc che considerarc tutti i pigmenti idrosolubili e liposolubili, abbiamo isolato la ficoeritrina di Gracilariu ver- rucosa I Iuds. (Papenfuss) ( = Gradaria con feruoides Grev.), che apparticne alle Gigarlinales,

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ordinc pcr il quale si hanno solo dati di tip0 qualitativo. Questa ficocritrina t di tip0 R.<<clas- sic0 )) a trc rnassimi di assorbirnento ben evidenti. I valori medi dei coeficienti di cstinzionc, riferiti a nurnerosi carnpioni, risultano E::m = 53,8 per il massirno a 565 nrn, E::m = 48,4

*per quello a 530 nm ed E i L = 42,l pcr quello a 498 nrn. Questi valori si discostano da quelli calcolati per Ic altre due specic di Noridcue finora studiate (Rhodochorlon floridirlum contcnente la B-ficoeritrina e Ceruniitrm tzrbrirnz contcncntc la R-ficocritrina). Poichd, da numc- rose prove di crornatografia e di elettro-foresi discontinua, abbiarno la certezza che la R-fico- critrina da noi isolata t sostanzialmcntc pura, ritcniamo che questa differenza sia dovuta o ad una maggior cornplessith della parte proteica della molecola o ad un rapport0 crornoforo/pro- tcina diffcrente.

Cib potrcbbc risultare di notcvole intcresse cherniosisternatico con irnplicmioni filoge- netichc, ma il troppo piccolo nurncro di specie finora esaminato non conscntc di trarre con- siderazioni generali.

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