Qualità del frutto: strategie molecolariper il monitoraggio dei geni coinvolti

Gaetano Perrotta

• Forma• Pigmentazione• Consistenza• Sapore/Aroma• Elementi nutrizionali

Durante la maturazione:

• Modificazione dell’ultrastruttura della parete cellulare• Conversione dell’amido in zuccheri• Aumenta la suscettibilità a patogeni• Biosintesi e accumulo di pigmenti• Aumentano i livelli dei composti volatili

Principali Caratteristiche del Frutto

Elevata variabilità

• Mappa Genetica• Clonaggio Posizionale

Gene tagging• transposoni• T-DNA

Caratterizzazione Molecolare

Genomica/bioinformatica• Sequenziamento• Analisi di Espressione

Interazioni proteina-proteina• Sistema del doppioibrido

Manipolare l’assetto genetico per ilmigloramento delle specie coltivate

L’ espressione dell’informazione genetica raccolta nellemolecole di DNA, avviene in due stadi:

–(i) trascrizione, durante la quale il DNA è trascritto inmRNA

–(ii) traduzione, durante la quale l’ mRNA è tradotto perprodurre la proteina associata

DNA mRNA protein

Dogma Centrale

Materiale Vegetale

+USB35

Queen

Tratti evidenziati

Produzione incrementata

Gusto eccellente

Frutto rosso, brillante eluminoso

Periodo di conservazionepiù lungo

Resistente agli stress

X

MISS MAYA

ONDA

Caratteri quali-quantitativi

Genotipo Consistenza del frutto (g)*SSC**TA***Produttività****Queen 571 7.3 9.9 910Miss 334 6.1 8.1 696USB35 434 7.8 12.5 530Maya 345 6.6 10.6 826Onda 340 6.1 7.9 615

*: test penetrometrico (diametro 6mm)**: contenuto solidi solubili (°Brix)***: acidità titolabile (meq (100 g-1))****: produttività totale (g/pianta)

Fonte: Monografia di cultivar di fragola – Faedi et al. (2003)

• I DNA chip o microarrays sono costituiti da centinaia (omigliaia) di microgocce di DNA depositati su un supportogeneralmente costituito da un vetrino da microscopio (ognispot rappresenta un gene). La miniaturizzazione che nederiva, consente di fare analisi su scala genomica o sub-genomica.

• Il DNA immobilizzato sul vetrino puo’ essere utilizzato inreazioni di ibridazione o in altre reazioni enzimatiche.

• I DNA microarrays sono si solito utilizzati per ilmonitoraggio dell’attività trascrizionale su scala genomicao sub-genomica.

DNA Chip

Microarray di Fragaria

3 x 1870 =5610 spots

Spot triplicati

10Geni controllo

49Geni candidati

1811ESTsselezionate

cDNA Microarrays

AAAAAAAAAAA

mRNA

Fluorescent probe

Hybridize

AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

AAAAAAAAAAA

Comparative Profiling Analisi dei dati

Emissione

Laser 1 Laser 2

Scanning

Schema sperimentale

Miss /USB35/Maya/Onda (Test)

Queen(controllo)

Estrazione RNA totale

Sintesi cDNAfluorescente

Ibridazione

Cy5 Cy3

Test/Controllo > 2Test/Controllo = 1Test/Controllo < 0.5

Immagine rossa

Immagine verde+

Espressione differenziale dei geni Miss,USB35,Maya e Onda vs. Queen

-2.00

-1.00

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

SAAT CC

RsnR

NA exp4

UKN3

UKN4

1-am

inocic

loprop

ano Cel1

UKN5

UKN6 Ap

xbH

LHtub

ulina

EST0

0001

F1 A

TPase UK

N1UK

N2 Hsp2

ethyle

ne dio

xygen

ase

peptid

ilprolil

isom

erasi aux

-rcas

einaCA

D Hsp

Geni

Log

2 Ra

tio

Miss vs QueenUSB35 vs QueenMaya vs QueenOnda vs Queen

I geni CCR e CAD sono rispettivamente sovra- e sottoespressi nei frutti molli

CCR

Flavonoids Lignin

p-Coumaroyl-CoA

Stilbenes

Aldehydes Monolignolalcohols

CADCinnamyl alcoholdeidrogenasi

Cinnamoyl-CoAreduttasi

Il gene Alcohol AcylTransferase (AAT) èsottoespresso nella cv

Queen

Profiling del frutto in maturazione in pomodoro

• Frutto immaturo / Foglia• Frutto Breaker / Foglia• Frutto rosso / Foglia

Microarray con 12.000geni di pomodoro

regolazione

fotosintesi

ripening

parete cellulare

proteine DNA/RNA

difesa

funzione sconosciuta

stress

metabolismo primario

Profiling Trascrizionaledi Pomodoro in Maturazione

Considerazioni conclusive

Questi risultati dimostrano che il profilingtrascrizionale in cultivar dalle caratteristichedifferenti permette di identificare geni ofamiglie geniche potenzialmente coinvoltinell’espressione di caratteri qualitativi delfrutto.

L’efficacia di questo approccio èproporzionale alla rappresentatività delmicroarray.

Genomica

Bioinformatica

Trascrittomica

Proteomica

Identificazione deifattori genetici

coinvoltinell’espressione dicaratteri qualitativi

Metabolomica

• F. Carbone - Tesista • L. Caracciolo - Tesista• F. Giorno - Contrattista• F. Mourgues - Borsista• C. Rosati - Ricercatore

• G. Giuliano• W. Faedi I.S.F. Forlì

Partecipanti: Collaborazioni:

CasacciaTrisaiaTrisaiaTrisaiaTrisaiaTrisaia