Interazioni  Proteina-­‐Proteina  

Giorgia  Batelli  Federica  Consiglio  25  Marzo  2014  

Corso  di  Formazione    Genhort  

Interazioni  proteina-­‐proteina  

Associazioni  tra  proteine:  servono  per  la  regolazione,  espressione  e  organizzazione  di  ogni  processo  cellulare:    Replicazione  del  DNA,  Trascrizione,  Traduzione,  Splicing          Controllo  del  ciclo  cellulare,  Trasduzione  del  segnale  etc.  etc.  

Inizialmente   lo   studio   delle   interazioni   era   dominio  esclusivo   dei   biochimici,   oggi   data   la   centralità   in   ogni  processo   cellulare,   anche   geneBsB,   biologi   cellulari,  dello  sviluppo,  molecolari    si  trovano,  per  necessità,  ad  interessarsene  

Interazioni  proteina-­‐proteina    I  conta>  fisici  tra  proteine  sono  cruciali  per  il  funzionamento  della  cellula  

Si  verificano  in:    

Complessi  stabili:  piruvato  deidrogenasi,  a-­‐chetoglutarato  deidrogenasi.    Vantaggi  di  un  oligomero  rispeEo  a  un  grande  monomero:  Possibilità  di  combinazioni  diverse,  Riduzione  degli  errori  di  trascrizione  e  traduzione;  ComparBmentalizzazione  della  funzione.  

Complessi  transienB  tra  proteine  che  sono  stabili  anche  indipendentemente:  interazioni  di  chinasi,  fosfatasi,  glicosil  trasferasi,  acil  trasferasi  etc.  etc.      Vantaggi  Alterazione  anche  momentanea  e  mirata  delle  caraEerisBche  della  singola  proteina:  affinità  con  un  ligando,  catalisi  etc.  

Interazioni  proteina-­‐proteina    Perché  ci  interessano  in  studi  di  forward  e  reverse  geneBcs?????        •  Analisi  funzionale:  Conoscere  l’idenBtà  delle  proteine  con  cui  la  proteina  oggeEo  di  

studio  interagisce  può  dare  indicazioni  sulla  funzione.  Ad  esempio,  se  la  mia  proteina  X,  di  cui  non  conosco  la  funzione,  interagisce  con  proteine  note  coinvolte  nella  risposta  a  stress,  posso  ipoBzzare  che  la  proteina  X  sia  in  qualche  modo  coinvolta  nella  risposta  a  stress.  

•  Strategia  di  isolamento  geni:  Viceversa,  se  la  mia  proteina  X  è  una  proteina  nota  coinvolta  nella  risposta  a  stress,  l’idenBficazione  di  proteina  che  interagiscono  con  essa  può  aiutarmi  ad  idenBficare  proteine  a  funzione  sconosciuta  da  studiare  per  quanto  riguarda  il  loro  coinvolgimento    nella  risposta  a  stress  

Metodi  di  invesBgazione  di  interazioni  proteina-­‐proteina  

Co-­‐immunoprecipitaCon  

Bimolecular  Fluorescence  ComplementaCon  (BiFC)  

Yeast  2  hybrid  screen    

Tandem  Affinity  PurificaCon(TAP)    

Pull  down  

Esercitazione  

Una  premessa  necessaria:  il  clonaggio  

Clonare  significa  produrre  copie  idenBche:  CLONI.      

 Il  CLONAGGIO  consiste  nella  molBplicazione  di  un  segmento  di  DNA  

appartenente  ad  un  dato  genoma.    

Ciò  si  oXene  unendo  tale  frammento  a  una  piccola  molecola  di  DNA  che  serve  da  

trasportatore  

       (VETTORE  DI  CLONAGGIO).    

Successivamente  si  avrà  la  replicazione  di  questo  DNA  modificato  (RICOMBINANTE)  

migliaia  o  milioni  di  volte  fornendo  un  gran  numero  di  copie  del  clone  stesso.    

 Il  risultato  è  l’amplificazione  sele5va  di  quel  determinato  frammento  di  

DNA.  

 

Il  clonaggio  uBlizza  diversi  strumenB:  •   Uno  strumento  (enzimi)  per  tagliare  il  DNA  in  punB  precisi:  le  

   ENDONUCLEASI  DI  RESTRIZIONE  

•  Uno  strumento  (enzima)  per  unire  covalentemente  due  frammenB  di  DNA:  

   DNA  LIGASI  

•  Una  piccola  molecola  di  DNA  capace  di  autoreplicarsi:  

   PLASMIDE.    

•  Il  frammento  di  DNA  che  si  vuole  replicare  

•  Una  CELLULA  OSPITE  che  fornisce  l’apparato  enzimaBco  

   necessario  per  la  replicazione  del  DNA  ricombinante.  

•  Un  metodo  per  la  SELEZIONE  delle  cellule  ospiB  che    contengano  il  DNA  

ricombinante.  

TAPPE  CARATTERISTICHE  DI  UN  CLONAGGIO  

•  1-­‐  DIGESTIONE      (Taglio  del  DNA  da  clonare  e  del  plasmide)  

•  2-­‐  LIGAZIONE      (Unione  del  DNA  da  clonare  e  del  plasmide)  

•  3-­‐  TRASFORMAZIONE      (inserimento  clone  in  cellula  ospite)  

•  4-­‐  PIASTRAMENTO      (replicazione  dei  cloni  in  terreno  nutriBvo)  

•  5-­‐  SELEZIONE      (  riconoscimento  dei  ricombinanB).  

I  plasmidi  •  I  plasmidi  sono  degli  elemenB  geneBci  extracromosomali  che  si  replicano  

autonomamente  in  baEeri  grazie  ad  una  origine  di  replicazione.    

•  Nella  maggior  parte  dei  casi  sono  molecole  di  DNA  circolari  libere.  

•  In  biologia  molecolare,  si  uBlizzano  plasmidi  ingegnerizzaB,  che  contengono  

un  marcatore  selezionabile  (resistenza  ad  un  anBbioBco)  

•  Diversi  siB  unici  di  taglio  per  enzimi  di  restrizione,  di  solito  vicini  e  raggruppaB  

in  un  MulAple  Cloning  Site  

   

 

COME  E’  POSSIBILE  CLONARE  UN  FRAMMENTO  DI  DNA  ?  

Perché  copiare  (clonare)  un  frammento  di  DNA  

•  Un  parBcolare  gene  può  essere  isolato  e  la  sua  sequenza  nucleoBdica  può  essere  determinata    

•  Le  sequenze  di  controllo  del  dna  possono  essere  idenBficate  e  analizzate    

•  Organismi  possono  essere  “ingegnerizzaB”per  scopi  specifici,  es.produzione  di  insulina,  resistenza  agli  inseX,  etc.  

•  La  funzione  di  proteine/enzimi/rna  può  essere  valutata  

Yeast  2  Hybrid  (Y2H)  screen  

•  Inventato  da  Fields  and  Song  (1989)  l’  Y2H  cosBtuisce  a  tuE’  oggi  il  metodo  di  screening  più  rapido,  semplice  ed  uBlizzato  per  l’  idenBficazione  di  interazioni  proteina-­‐proteina;  si  basa  sulla  modularità  del  faEore  di  trascrizione  Gal4  

•  Osservazioni  degli  anni  '80  portarono  a  concludere  che  i  faEori  di  trascrizione  sono  proteine  modulari  (composte  di  più  domini  separaB)  e  sono  quindi  scomponibili;  

•  Il  faEore  GAL4  di  lievito  può  essere  diviso  in  due  componenB:  un  dominio  di  legame  al  DNA  (BD:  binding  domain)  e  l'altro  di  aXvazione  della  trascrizione  (AD:  acBvaBon  domain);  

•  I  due  domini,  anche  divisi  dal  resto  della  proteina  saranno  capaci  l’  uno  di  legame  al  DNA  (BD)e  l’  altro  (AD)  di  aXvazione  della  trascrizione  (posto  che  venga  portato  in  vicinanza  del  DNA,  ad  esempio  tramite  fusione  con  un  altro  dominio  che  lega  il  DNA).   DNA  Binding  Domain    

(BD)  TranscripBon  AcBvaBon  

Domain  (AD)  

Principi  del  Y2H  

•  Immaginiamo   di   avere   due   proteine,   X   e   Y  che  normalmente  formano  un  complesso;  

•  Se  costruiamo  a)  una  proteina  di  fusione  Gal4(BD)-­‐  X  e  b)  una  proteina  di   fusione  Y   -­‐Gal4(AD),   possiamo   ricosBtuire   un  aXvatore   della   trascrizione   Gal4  funzionale   (cioè   la   regione  di  aXvazione  di   Gal4   si   complessa   con   la   regione   di  legame  al  DNA)  

•  Ques to   comp le s so   ag i s ce   da  aXvatore   della   trascrizione   per   gli  enzimi  metabolici  del  galaEosio  

L’  interazione  X-­‐Y  riprisBna  l’  unità  funzionale  del  faEore  di  trascrizione  GAL4;    

Questo  principio  è  stato  abbinato  all’  uBlizzo  di  geni  reporter  facilmente  screenabili  soEo  il  controllo  di  una  sequenza  di  regolazione  (UAS)  riconosciuta    dal  BD.    Screening  visibile  e  quanBtaBvo  delle  interazioni.  

Proteina    X  

Proteina  Y  

Selezione  nutrizionale  

Selezione  “visiva”   Sceening    Bianco/Blu;  

Il  ceppo  di  lievito  uBlizzato  per  il  doppio  ibrido  (AH109)  non  è  capace  di  crescere  su  mezzi  privi  di  Leu,  Trp,His,  Ade.  

Costruzione  dell’  esca  e  della/delle  prede:  

a.  Clonaggio  in  E.coli  della  nostra  proteina  esca  in  veEori  «bait»:  la  proteina  esca  verrà  espressa  in  fusione  con  il  BD.  

Gal4  DNA    

Binding  Domain  

Proteina  di  fusione  X-­‐BD  

La   presenza   del   plasmide   conferisce  capacità   al   lievito   di   crescere   in  assenza  di  Triptofano  

b1.  Clonaggio  in  E.coli  della  nostra  proteina  preda  in  veEori  «prey»:  la  proteina  preda  verrà  espressa  in  fusione  con  l’  AD.  Nel  caso  il  cui  abbiamo  già  un  candidato  all’  interazione  con  l’esca.  

b2.    Costruzione  di  una  AD  fusion  library:  Preparazione  di  una  libreria  cDNA  in  un  veEore  contenente  l’  AD.    Bisogna  costruire  una  libreria  rappresentaBva  e  con  inserB  a  lunghezza  variabile  tanto  meglio  se  oEenuta  da  mRNA  di  tessuB  in  cui  la  proteina  bait  viene  espressa  abbondantemente.  

Gal4  AcBvaBon

 

Domain  

Proteina  di  fusione  Y-­‐AD  

La   presenza   del   plasmide   conferisce  capacità   al   lievito   di   crescere   in  assenza  di  Leucina  

UBlizzo  di  AD  libraries  già  disponibili  

Trasformazione  di  lievito  

Cotrasformazione:  i  due  costruX  vengono  trasformaB  assieme,  preferibile  per  evitare  fenomeni  di  tossicità  in  lievito  di  uno  dei  2  costruX.  Piastriamo  in  assenza  di  Triptofano  e  di  Leucina  

Dopo  la  trasformazione,  le  cellule  vengono  piastrate  su  mezzo  seleXvo  –TRP,  -­‐LEU,  -­‐HIS,  -­‐ADE,  (Selezione  nutrizionale  della  interazione)    +  X-­‐a-­‐GAL  (Selezione  visiva  dell’  interazione:  blue/white)  

-­‐His/-­‐Ade                      

Solo  le  cellule  trasformate  con  entrambi  i  veEori  saranno  in  grado  di  crescere  

Verifica  dell’  interazione  

Il  saggio  del  doppio  ibrido  di  lievito  sarà  oggeEo  delle  esercitazioni  del  01/04  (trasformazione)  e  04/04/14  (test  per  selezione  nutrizionale)  

Controlli  possibili:  

 

 

Si  riclona  la  sequenza  del  prey    

 

Switch  di  bait  con  prey  

 

Uso  di  tecniche  alternaBve  (pull-­‐down,  co-­‐IP)  per  la  conferma  

Verifica  delle  interazioni    

Un  esempio  

TuEe  le  6000  ORFs  di  lievito  sono  state  saggiate  per  l’interazione  due  a  due:    Questo  ha  permesso  di  individuare  957  interazioni  proteina-­‐proteina  

Svantaggi  del  Y2H  

Il  bait  potrebbe  avere  BD  propri:  delezione  

 

Alcune  proteine  potrebbero  non  essere  stabili  in  lievito  

 

La  presenza  di  AD  e  BD  potrebbe  “mascherare”  i  domini  di  interazione  

 

Possibilità  di  folding  non  correEo  o  assenza  di  modificazioni  post-­‐trascrizionali  

Pull  down  E’  uno  dei  metodi  più  facili  per  un  rapido  screening  di  proteine  interagenB  con  la  proteina    di  interesse  (deEa  “esca”,  bait).  Può  essere  uBlizzato  anche  per  la  conferma  di  una  interazione  già  ipoBzzata.  

Gli  steps:  

Espressione  e  purificazione  della  proteina  esca  in  baEeri  (aggiunta  di  una  TAG)  o  purificazione  da  un  lisato  cellulare;  

Legame  del  bait  a  una  resina  

Aggiunta  del  lisato  cellulare  

Eluizione  del  bait  (con  eventuali  proteine  associate)  dalla  resina  

Corsa  su  SDS-­‐PAGE;  Rilevazione  o  sequenziamento  

AnBcorpo  contro  la  proteina  bait  

immobilizzato  alla  resina  

Bait  riconosciuto  dall’  anBcorpo  

Proteine  interagenB  con  il  

bait  

Eluizione  

Corsa  su  SDS  PAGE  e  digesBone  

con  tripsina  

SpeErometria  di  massa  

Validazione  con  western  bloXng  

Co-­‐Immuno  Purificazione  

1.  

2.  

3.  

4.  

5.  

6.  

Simile  al  pull-­‐down.  Differenza:  la  proteina  esca  non  è  cosBtuita  da  una  proteina  ricombinante  purificata  da  E.coli,  ma  è  co-­‐purificata  da  pianta  insieme  alle  prede  

BiFC  (Bi-­‐molecular  Fluorescence  ComplementaCon):  Saggio  di  complementazione  della  fluorescenza  

Espressione  transiente  in  protoplasB  o  piante  di  tabacco:  Co-­‐trasformazione  di  esca  e  preda.  

Costruzione  dei  veEori:  Clonaggio  delle  proteine  A  e  B  in  veEori  contenenB  i  frammenB  della  YFP  

Visualizzazione  al  microscopio  confocale:  la  YFP  si  è  ricosBtuita????  

Gli  steps:  

The  BiFC  assay  is  based  on  reconsBtuBon  of  an  intact  fluorescent  protein  when  two  complementary  non-­‐fluorescent  fragments  are  brought  together  by  a  pair  of  interacBng  proteins.  

514  nm  

8  possibili  combinazioni!  

Vantaggi:  • E’  un  metodo  veloce  per  verificare  l’interazione  tra  due  proteine;  • E’  un  metodo  “in  vivo”;  • Localizza  anche  il  comparBmento  intracellulare  in  cui  avviene  l’interazione.  

Svantaggi:  • Il  rumore  di  fondo  e’  alto;  Possibilita’  di  falsi  posiBvi.  • Viceversa,   non   sempre   interazioni   note   possono   essere   confermate.  L’orientamento   dei   frammenB   della   YFP   potrebbe   essere   importante:   bisogna  testare  molte  combinazioni  diverse  

Tandem  Affinity  PurificaCon  

Sviluppata  per  la  prima  volta  da  Rigaut  et  al.  (1999)  per  la  purificazione  di  complessi  proteici  da  lievito  

La  TAP  prevede  l’  uso  di  2  Tags  invece  di  una  (x  es.  pull-­‐down):  maggiore  seleXvità  

La  TAP  è  stata  uBlizzata  con  successo  in  lievito,  sistemi  animali,  baEerici,  piante  e  cellule  di  inseEo.  

Gli  step:  

1.  Clonaggio  del  gene  di  interesse  in  veEore  contenente  due  Tag  in  tandem  

2.  Trasformazione  stabile  di  piante  

3.  Doppia  immuno-­‐purificazione  

4.  Separazione  delle  proteine  purificate  mediante  SDS-­‐PAGE  e  sequenziamento  mediante  LC/MS-­‐MS.  

4.  Separazione  delle  proteine  purificate  mediante  SDS-­‐PAGE  e  sequenziamento  mediante  LC/MS-­‐MS.  

Dopo  il  sequenziamento,  si  fa  una  ricerca  in  banca  daB  (MASCOT)  alla  ricerca  delle  proteine  idenBficate  

Svantaggi  della  TAP:  

• Costa  un  sacco  di  soldi!!!  Proteasi,  anBcorpi,  sequenziamento….  

• Ci  vuole  parecchio  tempo  

• Difficile  idenBficare  interazioni  deboli.  

• Complementare  all’  Y2H