by N.A. Identificazione di geni nei mammiferi by N.A. Studiare un genoma significa : / clonare le...

by N.A.

Identificazione di geni nei mammiferi

by N.A.

Studiare un genoma significa : clonare le sue sequenze, ordinare i cloni per ricomporre l’organizzazione spaziale delle sequenze comprendere l’architettura del genoma identificando i diversi tipi di DNA e la loro distribuzione identificare i geni e la loro funzione studiarne l’evoluzione attraverso il confronto con altri genomi

Studiare un genoma

by N.A.

Dalla genetica alla genomica: timeline di una“evoluzione concettuale”

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1865 - 1944Da Mendel al DNA

by N.A.

Per la prima volta è indagato scientificamente il problema della trasmissione dei caratteri:Mendel scopre le leggi dell’ereditarietà.

Mendel, G. “Versuche über Pflanzen-Hybriden” in “Verhandlungen des naturforschenden Vereines, Abhandlungen Brünn “, 4, 3-47, (1866).

Gli individui possono essere selezionati e incrociati scientificamente,

ma non c’è ancora una spiegazione molecolare del fenomeno...

1866: le leggi di Mendel

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La biochimica

Miescher, F. "Ueber die chemische Zusammensetzung der Eiterzellen”, Hoppe-Seyler's medicinisch-chemische Untersuchungen, 4, 441-460, (1871).

1869: Miescher per la prima volta isola una sostanza che chiama nucleina perchè abbondante nel nucleo cellulare e scrive l’articolo “La composizione chimica delle cellule del pus”. Più tardi la nucleina, caratterizzata chimicamente, si dimostrerà un acido, le cui componenti sono desossiribosio, fosfati e basi azotate. La sostanza è ribattezzata DNA.

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La citologia

1903: Sutton propone la teoria cromosomica dell’ereditarietà, correlando il comportamento in meiosi dei cromosomi scoperti da Flemming nel 1882 con le modalità di trasmissione dei caratteri mendeliani. La teoria sarà dimostrata da Morgan nel 1910 con studi in Drosophila.

Sutton, W. “The chromosomes in heredity”, Biological Bulletin, 4, 231-251, (1903).

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Avery, O.T., MacLeod, C.M. and McCarty, M. “Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types”, J. Exp. Med., 79, 137-158, (1944).

1944: Avery, McCarty e MacLeod identificano nel DNA la molecola della informazione ereditaria: costituisce il “principio trasformante” che rende lisce le colonie di batteri a colonie rugose.

Il principio trasformante : il DNA

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1953 - 1984

Da Watson e Cric all’idea del sequenziamento

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1953: Watson e Crick propongono il modello a doppia elica per la molecola del DNA.

Watson, J.D. & Crick, F.H.C. “A structure for deoxyribose nucleic acid”. Nature, 171, 737 - 738, (1953).

Base molecolare nota.

Informazione illeggibile!

La doppia elica

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1966: Nirenberg, Khorana e Holley determinano il codice genetico -> a ogni tripletta corrisponde un amminoacido e viceversa (... quasi). In questo stadio della genetica è più facile sequenziare le proteine e dalla successione degli aminoacidi dedurre la sequenza nucleotidica.

UUUUUC

F fenilalUCUUCC

S serina UAUUAC

Y tirosina

UGUUGC

C cisteina

UUAUUG

L leucina UCAUCG

S serina UAAUAG

STOP UGAUGG

STOPW triptof

CUUCUC L leucina

CCUCCC

P prolina CAUCAC

H istidina

CGUCGC

R arginin

CUACUG

L leucinaCCACCG

P prolina CAACAG

Q glutam

CGACGG

R arginin

AUUAUC

I isoleucACUACC

T treonina

AAUAAC

N asparag

AGUAGC

S serina

AUAAUG

I isoleucM metion

ACAACG

T treonina

AAAAAG

K lisina AGAAGG

R arginin

GUUGUC

V valinaGCUGCC

A alanina GAUGAC

D Acaspar

GGUGGC

G glicina

GUAGUG

V valinaGCAGCG

A alanina GAAGAG

E Acgluta

GGAGGG

G glicina

U C A G

A

G

C

U

UC

AGUC

AGUC

AGUC

AG

Il codice genetico

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1968: purificazione del primo enzima di restrizione.

1969: le università americane si collegano ad ARPANET, l’antenato di INTERNET

1973: mappa di restrizione di SV40 e clonaggio del primo plasmide

DNA genomico digerito caricato su gel con EtBr

Lastra sviluppata dopo esposizione del filtro ottenuto dopo trasferimento e ibridazione con sonda marcata radioattivamente(P32)

1974: Ed Southern mette a punto la tecnica che prendera’ il suo nome: il Southern Blot.

Tappe

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1977: Gilbert e Sanger inventano un sistema persequenziare “rapidamente” una molecola di DNA. Si determinano alcune decine bp/mese uomo (mu).

1983: grazie alle nuove sonde e agli RFLP viene mappato per linkage il locus della Corea di Huntington. Si apre la possibilita’ di mappare geneticamente anche quegli organismi non accessibili dalla genetica classica basata sugli incroci e si puo’ fare il linkage utilizzando “il fenotipo” del DNA

1985: Mullis concepisce la PCR (polymerase chain reaction)

1986: Hood realizza il primo sequenziamento automatico (-> Mb/mu)

1988: Vengono costruiti gli YAC che possono contenere fino a 2Mb

Tappe

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Tappe : gli STS

1989: L ’automazione del sequenziamento permette di sequenziare corte sequenze (~200pb) clonate a caso da cui ricavare primers per “screenare” con la PCR ormai automatizzata le librerie e costruire mappe fisiche attraverso la creazione di contigui . Quando sono polimorfiche sono marcatori comuni alle mappe sia genetiche che fisiche e permettono di legarle fra loro

DNA genomico

Clonaggio

Sequenziamento

GACTTAG........CATAGCA ~200bp

STS A,B,C..

scelta dei primers x A,B,C..

screeninglibrary conPCR

A+,B-,C+..

A-,B+,C+..B+,D+,G+

H+,F+,T-.. F+,T-,Q+..

H F*Q

A* C B*

D G*

mappa fisica: contiguo

1 2

A C B D G H F Q

mappa genetica: A, G e F sono in linkage il loro ordine e’ F-A-G

A C B D GH F Q

I due contigui sono sullo stessocromosoma e via cosi....

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1992: I BAC:possibilita’ di clonare frammenti molto grandi (fino a 200Kb) e stabili a differenza degli YAC.

1994: I PAC possono sopportare frammenti genomici piu’ piccoli (fino a 100-120Kb)

Tappe

1998: Gli SNPs: nuova generazione di polimorfismi del DNA: sono sostituzioni di singole basi, con frequenza ogni poche centinaia di basi, sono stati individuati grazie all’automazione del sequenziamento, permetteranno di generare mappe genetiche ad alta densita’

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Studiare un genoma

by N.A.

Analisi alcomputer

A1:Omologo animale mappato?

A2:Omologo animale clonato?

A3:Ricerca nei

databasegenetici

Informazionicliniche

C1:raccoltafamiglie permappatura

C2:delezioni o traslocazionicromosomiche

C5:Raccolta

pazienti non

imparentati

B1:regione cromosomica candidata?

B2:Verifica nei database dei geni della regione

B3:Possibile

genecandidato?

B4:e ’ statocompletamen

tecaratterizzato

?

Informazionidi laboratorio

D1:mappaturagenetica: ricercagenomica

D2:clonaggio dei punti di rottura

D3:nuovi geniumani identificati

D4:strutturagenomica e sequenza completa

D5:Ricerca delle

mutazioni

E1:trovata lalocalizzazione?

E2:errore nel tipo di eredita’ oeterogeneita ’genetica

E3:ripensare ai geni candidati: vai A2,A3,D3

E5:trovatemutazioni patogene?

TROVATO!!!SI

SI

SI

NO

NO

SI

NO

SI

NONO

Come identificare i geni

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Strategie

CLONAGGIO FUNZIONALE: le basi biochimiche della funzione in studiosono note. Utile in pochi casi

CLONAGGIO POSIZIONALE: si conosce solo la localizzazione cromosomica del locus. Richiede la costruzione di una mappa fisica e genetica della regione.

STRATEGIE CON GENE CANDIDATO INDIPENDENTI DALLA LOCALIZZAZIONE: e’ necessario correlare il fenotipo a modelli animali o porre in relazione il fenotipo a famiglie geniche gia’ note

STRATEGIE CON GENE CANDIDATO CONOSCENDO LA LOCALIZZAZIONE: sono quelle attualmente piu’ utilizzate, soprattutto per la possibilita’ di utilizzare le banche dati.

by N.A.

Le strategie sono alternative, la scelta dipende dalle informazioni di partenza , ma ovviamente nel corso dello studio si integrano: praticamente alla fine si usano tutte. Non esiste quella giusta in assolutoesiste quella che mi puo’ dare maggioririsultati nelle condizioni sperimentali in cui mi trovo ad operare

Attenzione

by N.A.


Studiare un genoma

Bisogna avere delle mappe collegate fra loro perche’una sola non basta:

by N.A.

Tipi di mappe: mappe fisiche

Mappe fisiche: sono come le mappe geografiche.Descrivono la posizione fisica dei cloni di una libreria genomica uno relativamente all’altro sulla base della loro sequenza

Se riesco ad allinearle con le mappe genetiche posso collegare un gruppo di cloni a un locus e cominciare a rispondere alla domanda ultima di tutto il lavoro:

La sequenza clonata e’ il gene che sto cercando?

by N.A.

Tipi di mappe: mappe genetiche

Mappe genetiche : si basano sulla frequenza di ricombinazione fra locus identificati attraverso marcatori di varia natura: fenotipo dell’ individuo, fenotipo tissutale, fenotipo cellulare, fenotipo proteico, fenotipo del DNA.

Sono la connessione fra una realta’ biologica e il genoma corrispondente, senza di loro spesso non si puo’ procedere, non si puo’ rispondere alla domanda ultima di tutto il lavoro:


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Tipi di mappe: mappe di espressione

Mappe di espressione: ordinano all’internodi una regione gli RNA espressi.

Il DNA codificante costituisce una frazione del DNA di un organismo quindi e’ necessario collegare le mappe fisiche e genetiche a una mappa di espressione per evitare di concentrarsi su sequenze non idonee a rispondere alla domanda ultima di tutto il lavoro:


by N.A.

Le mappe fisiche

Ne esistono di diversi tipi che forniscono informazioni complementari: mappe da ibridi di cellule somatiche e da radiazione, mappe di restrizione a lungo raggio mappe basate su cloni utilizzando STS e EST mappe ottenute con FISH

Mappe fisiche: sono come le mappe geografiche. Descrivono la posizione fisica dei cloni di una libreria genomica uno relativamente all’altro sulla base della loro sequenza

by N.A.

Le mappe fisiche

Ne esistono di diversi tipi che forniscono informazioni complementari: mappe da ibridi di cellule somatiche e da radiazione,

Mappe fisiche: sono come le mappe geografiche. Descrivono la posizione fisica dei cloni di una libreria genomica uno relativamente all’altro sulla base della loro sequenza

Si originano dalla fusione in vitro del genoma di due speciee dalla susseguente origine di una linea cellulare che contiene nel suo nucleo i cromosomi della linea accetrice e alcuni cromosomi o parti di essi della donatrice

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Creazione degli ibridi somatici

+PEG

DonatriceAccettrice

XXX

X XX

Ibrido

Selezione

.::..::.

.::..::..::.

XXX

X

SincarionteX

XX

XXX

Eterocariontebinucleato

XXX XXX

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STS

RH

Pannello di RH per il crom.5 caratterizzato con STS

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Tipi di mappe: mappe genetiche

Mappe genetiche : si basano sulla frequenza di ricombinazione fra locus identificati attraverso marcatori di varia natura: fenotipo dell’ individuo, fenotipo tissutale, fenotipo cellulare, fenotipo proteico, fenotipo del DNA.

Sono la connessione fra una realta’ biologica e il genoma corrispondente, senza di loro spesso non si puo’ procedere,

by N.A.

Le mappe genetiche Si basano sugli studi di linkage cioe’

sull’analisi della segregazione alla meiosi di marcatori genetici.Se due o piu’ marcatori vengono ereditati

preferenzialmente nelle combinazioni parentali si deduce che mappino nella stessa regione genomica

Ricordate? L’unita’ di mappa e’ il centimorgan(cM):

1cM indica che due locus ricombinano fra loro con

una frequenza pari a 0.01. Si assume che 1cM sia pari

a ~1.5Mb anche se la relazione diretta non c’e ’: la

mappa genetica puo’ essere piu’ lunga di quella

fisica.

by N.A.

Definizione della regione candidata con analisi di linkage: ricostruzione degli aplotipi studiando la segregazione nelle famiglie. E’ necessario risalire alla fase e identificare i ricombinanti

88338822771010

10104466441166

88338822771010

10103322335588

88338822771010

553355331177

883388442233

10103322335588

775544666622

886633221188

665522662222

222211995555

225522555555

114411337755

665522662222

665522662222

222211995555

336655557788

774444225544

225522662222

114411337755

222211995588

665522662222

775544666622

886633221188

222211662222

774444225544

336655557788

665522662222

665522662222

Linkage:fase di piu locus

Possedere un particolare polimorfismonon vuol dire avere il fenotipo, lo studio di linkage e’ a livello di popolazione, serve ad individuare una regione non la mutazione

by N.A.

Polimorfismo

Variazione presente nella popolazione con una frequenza superiore a 1%

Variazioni nell’aspetto

by N.A.

Polimorfismo

Variazione presente nella popolazione con una frequenza superiore a 1%

Polimorfismi proteici

Polimorfismi del DNA: di restrizione (RFLP), minisatellite, microsatellite. Individuabili con southern blotting o PCR

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La connessione fra mappe

Quindi si hanno due tipi di mappe: fisica e genetica. Il problemae ’ trovare il modo di legarle: la mappa fisica mi dice in che ungruppo di sequenze formano un contiguo su un frammento dicromosoma, ma non mi permette di identificare geni candidati.La mappa genetica me lo permetterebbe perche’ non riguarda specifiche sequenze, ma anche locus di cui non conosco la sequenza.Non posso pero’ studiare il gene candidato perche’ non ho la sequenza corrispondente.

La possibilita’ di utilizzare STS e EST polimorfici hapermesso di risolvere il problema

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Gli STS: Sequence Target SiteL ’automazione del sequenziamento permette di sequenziare corte

sequenze (300pb) clonate a caso da cui ricavare primers per “screenare” con la PCR ormai automatizzata le librerie e costruire mappe fisiche attraverso la creazione di contigui . Quando sono polimorfiche sono marcatori comuni alle mappe sia genetiche che fisiche e permettono di legarle fra loro

DNA genomico

Clonaggio

Sequenziamento

GACTTAG........CATAGCA ~300bp

STS A,B,C..

scelta dei primers x A,B,C..

screeninglibrary conPCR

A+,B-,C+..

A-,B+,C+..B+,D+,G+

H+,F+,T-.. F+,T-,Q+..

H F*Q

A* C B*

D G*

mappa fisica:contiguo

1 2

A C B D G H F Q

mappa genetica: A, G e F sono in linkage il loro ordine e’ F-A-G

A C B D GH F Q

I due contigui sono sullo stessocromosoma e via cosi....

by N.A.


Studiare un genoma

by N.A.

Analisi alcomputer



A3:Ricerca nei

databasegenetici




C5:Raccolta

pazienti non

imparentati



B3:Possibile

genecandidato?


tecaratterizzato

?






D5:Ricerca delle

mutazioni





TROVATO!!!SI

SI

SI

NO

NO

SI

NO

SI

NONO


by N.A.

Strategie

CLONAGGIO FUNZIONALE: le basi biochimiche della funzione in studiosono note. Utile in pochi casi

CLONAGGIO POSIZIONALE: si conosce solo la localizzazione cromosomica del locus. Richiede la costruzione di una mappa fisica e genetica della regione.

STRATEGIE CON GENE CANDIDATO INDIPENDENTI DALLA LOCALIZZAZIONE: e’ necessario correlare il fenotipo a modelli animali o porre in relazione il fenotipo a famiglie geniche gia’ note

STRATEGIE CON GENE CANDIDATO CONOSCENDO LA LOCALIZZAZIONE: sono quelle attualmente piu’ utilizzate, soprattutto per la possibilita’ di utilizzare le banche dati.

by N.A.

Richiamiamo un po’ di terminologia

Genotipo: costituzione genetica di un individuo in relazione ad un particolare carattere

Fenotipo: manifestazione fisica del carattere, non e’ necessariamente una patologia intesa in senso clinico

La manifestazione fisica dipende dal metodo di rilevazione: es. anemia falciforme, thalassemia, emoglobinopatieE ’ l’operatore che sceglie il livello di indagine e definisce il fenotipo che vuole seguire: l’individuo, gli organi, il tessuto, le cellule, il DNA...

Locus: regione genomica dove mappa la sequenza di DNA coinvolta nella manifestazione del fenotipo. E’ individuato utilizzando tecniche laboratoristiche diverse: biochimiche, molecolari, citogenetiche

by N.A.

Non esiste necessariamente corrispondenza 1:1 fra fenotipo mendeliano e sequenze codificanti

il “gene” mendeliano e’ un entita’ astratta

identificata dalla modalita’ di segregazione e dalla

mappatura in un LOCUS

il “gene” molecolare e’ una sequenza codificante

corrispondente ad un trascritto, che mappa nella

regione identificata dal locus

Gene e fenotipo

by N.A.

Non esiste necessariamente corrispondenza 1:1 fra fenotipo mendeliano e sequenze codificanti

Prader-Willi/Angelmann,fenotipi autosomici dominanti: la mutazione piu’ frequente e’ la delezione di un segmento genomico che puo’ arrivare a 4Mb

Gene e fenotipo

Charcot Marie Tooth 1A ,fenotipo autosomico dominante: la mutazione piu’ frequente e’ una duplicazione di un frammento genomico di 1.5Mb che comprende parecchi geni.

by N.A.

Autosomico: locus che mappa su un autosoma

Legato al sesso : locus che mappa sui cromosomi sessuali

Omozigote: individuo in cui entrambi gli alleli sono uguali

Richiamiamo un po’ di terminologia

Alleli: forme alternative del locus che originano fenotipi distinguibili. Nella popolazione possono esistere n alleli, ma ogni individuo diploide ne possiede 2 degli n possibili. Gli alleli si originano per effetto delle mutazioni, e generano variabilita’ nella popolazione. Non e’ detto che ci sia un allele che genera fenotipo patologico. (gruppi sanguigni)

Eterozigote: individuo in cui gli alleli di un locus sono differenti

Ricordare che omozigote ed eterozigote non sonosinonimi di dominante e recessivo

by N.A.

Dominante: Carattere che si manifesta in eterozigosi

Recessivo: Carattere che si manifesta in omozigosi

Definizione classica

SONO CONCETTI CHE SI RIFERISCONO ALLA MODALITA’ DI TRASMISSIONE E DIPENDONO DAL TIPO DI FENOTIPO CHE SI CONSIDERA:

ANEMIA FALCIFORME: Recessivo se considero come fenotipo la presenza dell’anemia: i portatori non hanno anemiaCodominante se considero le catene dell’emoglobina : sono presenti entrambeSe guardo la sequenza del DNA non e’ nell’una nell’altra, perche’ non sto guardando l ’espressione del prodotto

by N.A.

Dominante: Carattere che si manifesta in eterozigosi

Recessivo: Carattere che si manifesta in omozigosi

Definizione classica

SONO CONCETTI CHE SI RIFERISCONO ALLA MODALITA’ DI TRASMISSIONE

Da questo deriva che la terminologia A/a che correttamente si usa negli incroci quando si vuole indicare la relazione fra i prodotti degli alleli e’ una terminologia operativa: significa che il fenotipo originato da un allele non e’ evidenziabile se c ’e ’ l’allele A e quindi mi devo aspettare che soggetti con fenotipo A siano geneticamente Aa e questa informazione mi viene dall’analisi degli alberi genealogici o dall’incrocioInoltre va ricordato che anche utilizzando A/a non vuol dire che a e’ derivato da A e costituisce un sottoprodotto di A. La terminologia che si deve usare al di fuori dello studio della trasmissione e’: locus A alleli A1,A2, A3, An.. (locus white in Drosophila)

by N.A.

SONO CONCETTI CHE SI RIFERISCONO ALLA MODALITA’ DI TRASMISSIONE

SONO DOVUTI ALL’INTERAZIONE DEL PRODOTTO DEI SINGOLI LOCUS CON L’AMBIENTE, IL BACKGROUND GENETICO DEL SINGOLO INDIVIDUO E IL PERIODO DELLO SVILUPPO E DIFFERENZIAMENTO

SI APPLICANO PERCIO’ ALLA POPOLAZIONE NON ALL’INDIVIDUO

LA GENETICA UMANA E’ FORSE L’ULTIMA DISCIPLINA CHE VIENE APPLICATA AD UNA POPOLAZIONE NATURALE

A LIVELLO DI POPOLAZIONE MEGLIO PARLARE DI LOCUS: IL TERMINE GENE ASSUME SIGNIFICATI DIVERSI A SECONDA DEL TIPO DI INDAGINE

Dominanza e recessivita’

by N.A.

Non si applicano al gene inteso come sequenza di DNA o locus.

Dominanza e recessivita’

In alcune patologie (es.Fibrosi Cistica) gli affetti possono essere definiti eterozigoti composti:questo perche’ esistono mutazioni diverse che provocano la malattia. Di fatto gli affetti non hanno l’allele normale, ma due alleli patologici. Geneticamente sono eterozigoti perche’ hanno due alleli diversi, ma dal punto di vista fenotipico sono indistinguibili dagli omozigoti. Il carattere e’ comunque recessivo

Si puo’ continuare ad usare il termine dominante e

recessivo, ma va tenuto ben presente il significato e

soprattutto

non va confuso con: dominante=+diffuso,

recessivo=patologico,

dominante=normale etc....

by N.A.

Analisi alcomputer



A3:Ricerca nei

databasegenetici




C5:Raccolta

pazienti non

imparentati



B3:Possibile

genecandidato?


tecaratterizzato

?






D5:Ricerca delle

mutazioni





SI

SI

NO

NO

SI

NO

SI

NONO

SITROVATO!!!

Clonaggio funzionale si parte da D3

by N.A.

Clonaggio funzionale

Screening di una library di DNA genomico per isolare la sequenza completa

Produzione di anticorpi specifici

Creazione di una library di cDNA in vettore di espressione

Screening della library di espressione e isolamento della colonia Ricerca nei topi del DNA corrispondente al cDNA clonato Sequenza dei cDNA cercando una ORF

Analisi del DNA degli affetti per individuare le mutazioni

Albinismo: Tirosinasi

EMOFILIA A: deficienza del fattore VIII

FENILCHETONURIA: deficienza fenilalanina-idrossilasi

by N.A.

Analisi alcomputer



A3:Ricerca nei

databasegenetici




C5:Raccolta

pazienti non

imparentati



B3:Possibile

genecandidato?


tecaratterizzato

?






D5:Ricerca delle

mutazioni





SI

SI

NO

NO

SI

NO

SI

NONO

SITROVATO!!!

Clonaggio funzionale si parte da A1

by N.A.

Variante: identificazione conoscendo la funzione

normale Complementazione nel topo transgenico:il gene DFNB3 identificato grazie al gene di topo. Il topo shaker2 ha una patologia vestibolare che si riconosce perche’ gira su se stesso e scuote la testa.

topo shaker2 topo sh2/sh2 Wild typeX

Mappato per linkage in 1cM del cromosoma11 di topo(17 umano)

Si iniettano uova sh2/sh2 con BACdi topo wt.

Wild type

topo sh2/sh2

topo sh2/sh2

topo sh2/sh2

BAC###Si sequenzia il BAC murino e sicercano le mutazioni nei topi mutantisi identifica il gene e la sua funzione

Si isola il BAC umano con primer esonici e siisola la sequenza umana, cercano le mutazioni nei pazienti

by N.A.

Variante: identificazione conoscendo la funzione

normaleIsolamento di oncogeni attivati: cellule di topo vengono trasfettate con DNA derivato da un tumore umano, se crescono in maniera incontrollata vuol dire che contengono un oncogene

Coltura di celluleNIH-3T3 di topo

Alcune cellule sonotrasformate

Trasfezione di frammenti di DNA umano da tumore

Selezione di unacolonia trasformata

ricerca sequenzeAlu

fagi che potrebberocontenere l’oncogene

by N.A.

CLONAGGIO POSIZIONALE: si conosce solo la localizzazione cromosomica del locus. Richiede la costruzione di una mappa fisica e genetica della regione. Si utilizza sempre meno

Strategie

by N.A.

CLONAGGIO POSIZIONALE: si conosce solo la localizzazione cromosomica del locus.richiede la costruzione di una mappa fisica e genetica della regione.

Definizione della regione candidata con analisi di linkage: Definizione della regione candidata con analisi di linkage: ricostruzione degli aplotipi studiando la segregazione nelle ricostruzione degli aplotipi studiando la segregazione nelle famiglie famiglie

Screening della perdita di eterozigosi: utilizzata di solito per iScreening della perdita di eterozigosi: utilizzata di solito per itumori o quando vi sono indicazioni di delezionitumori o quando vi sono indicazioni di delezioni

Anomalie cromosomiche: ricerca del coinvolgimento di una stessaAnomalie cromosomiche: ricerca del coinvolgimento di una stessa regione in affetti con lo stesso fenotipo regione in affetti con lo stesso fenotipo

Corea di Huntington, distrofia di Duchenne, fibrosi cistica,Corea di Huntington, distrofia di Duchenne, fibrosi cistica,neurofibromatosi, cancro colon-rettale…..neurofibromatosi, cancro colon-rettale…..

Clonaggio posizionale

by N.A.

Analisi alcomputer



A3:Ricerca nei

databasegenetici




C5:Raccolta

pazienti non

imparentati



B3:Possibile

genecandidato?


tecaratterizzato

?






D5:Ricerca delle

mutazioni





SI

SI

NO

NO

SI

NO

SI

NONO

SITROVATO!!!

Clonaggio posizionale si parte da C1

by N.A.

Analisi alcomputer



A3:Ricerca nei

databasegenetici




C5:Raccolta

pazienti non

imparentati



B3:Possibile

genecandidato?


tecaratterizzato

?






D5:Ricerca delle

mutazioni





TROVATO!!!SI

SI

SI

NO

NO

SI

NO

SI

NONO


by N.A.

Le alterazioni genetiche acquisite che portano alla trasformazione maligna sono un esempio di variazione genetica somatica (oltre al mosaicismo per i caratteri genetici nucleari e all’eteroplasmia per le mutazioni

mitocondriali).

Il tumore ha un’origine clonale, essendo il suo sviluppo innescato da un’alterazione

genetica in una singola cellula

E ’ l’accumulo di alterazioni genetiche in una singola cellula che produce gli effetti fenotipici caratteristici del termine

“malignita’ ”.

Cos’e ’ il tumore

by N.A.

I geni alterati nel cancro sono definiti oncogeni: questo nome deriva dalla scoperta di geni virali responsabili della trasformazione in tumore delle cellule infettate

proto-oncogenioncosoppressori

I geni nei tumori

caretaker(addetti alla manutenzione)

landscapers(architetti del paesaggio)

Gene Rb del retinoblastoma

by N.A.

e ’ un tumore maligno della retina che si sviluppa nei primi anni di vita

puo’ essere monolaterale (solo un occhio colpito) o bilaterale (entrambi gli occhi)

si puo’ manifestare in forme sporadiche o ereditarie

diagnosticate a 7-10 anni, generalmente monofocali (solo in un punto dell’occhio)

diagnosticate nel primo anno di vita, multifocali (piu’ punti di un occhio)

Retinoblastoma

by N.A.

retinoblastoma bilaterale

retinoblastoma monolaterale non-penetrante

Apparente trasmissione dominante...

Genetica del retinoblastoma

by N.A.

Nel 1971 Alfred Knudson analizzo’ casi di bambini con retinoblastoma sia monolaterale che bilaterale

Osservo’ che:

al momento della diagnosi, i bambini che avrebbero sviluppato tumori bilaterali erano piu’ piccoli di quelli per i quali i tumori sarebbero rimasti monolaterali;

con l’aumentare dell’eta’, la frequenza con cui venivano diagnosticati i casi bilaterali cresceva in maniera esponenziale, mentre quella relativa ai casi monolaterali aumentava molto piu’ lentamente.

Alfred Knudson

by N.A.

Knudson propose un modello (two-hit hypothesis) secondo il quale, affinche’ si abbia il retinoblastoma, e’ necessario che in una linea di cellule retiniche si verifichino due distinti eventi mutazionali

I evento (“hit”) II evento (“hit”)

I soggetti con retinoblastoma ereditario hanno ereditato una di queste mutazioni, la quale, pertanto, e’ presente in tutte le loro cellule retiniche e, quindi, e’ necessario un secondo evento perche’ si produca il tumore.

Il retinoblastoma sporadico, invece, si forma solo quando due eventi mutazionali indipendenti avvengono nella stessa linea cellulare. Cio’ si realizza piu’ raramente, per cui l’insorgenza e’ piu’ tardiva e i tumori sono invariabilmente monolaterali.

by N.A.

Il primo indizio sulla posizione del gene Rb e’ stato fornito da soggetti rari affetti da retinoblastomi bilaterali, concomitanti anomalie congenite e assenza di familiarita’

delezione 13q13-q14

L ’analisi cromosomica di questi pazienti ha dimostrato la presenza di una delezione del braccio lungo del cromosoma 13 di dimensione variabile ma con condivisione delle bande 13q13-q14: questa osservazione suggeriva che in tale regione si localizzasse un gene predisponente al retinoblastoma

Il gene del retinoblastoma (Rb)

by N.A.

Questi bambini presentavano anche una delezione di una copia del gene per l’enzima esterasi D, enzima di funzione

sconosciuta ma facilmente dosabile. Presenta un polimorfismo con due alleli, evidenziabile mediante

elettroforesi di proteine.

I bambini con una delezione a carico di 13q14 producevano meta’ della quantita’ normale di esterasi D ed

esprimevano invariabilmente un solo allele.

Rb ed esterasi

L ’esterasi con il suo polimorfismo era lo strumento ideale per studiare il gene del

retinoblastoma

by N.A.

L’analisi di linkage esaminando la segregazione del polimorfismo dell’esterasi D in famiglie con retinoblastoma ereditario e prive di delezione:

gli alleli dell’esterasi D segregavano nelle famiglie insieme al carattere retinoblastoma (lod score>3), fornendo indicazione che il gene predisponente alla malattia fosse

localizzato a livello della banda 13q14.

Linkage di esterasi e Rb

by N.A.

Il secondo evento sarebbe consistito nella perdita della copia normale rimanente di questo gene...

I tumori analizzati erano stati ottenuti da soggetti eterozigoti per il polimorfismo dell’esterasi D e non portatori di delezione costituzionale del cromosoma 13.

Verifica dell’ipotesi di KnudsonUna mutazione in un gene del cromosoma 13 che

costituirebbe al primo evento secondo l’ipotesi di Knudson e’ presente nelle cellule normali dei portatori

Per testare questa ipotesi si e’ usata nuovamente l’esterasi D, espressa nelle cellule del retinoblastoma, per vedere quali suoi alleli fossero espressi

by N.A.

Atteso: entrambi gli alleli avrebbero dovuto essere espressi

Osservato: solo un allele viene espresso in 2/3 dei tumori analizzati

?

il secondo evento consisteva probabilmente in una delezione che includeva i loci sia dell’esterasi D che del retinoblastoma

Per la verifica del secondo evento, si puo’ ricorrere a tecniche di biologia molecolare, come il Southern Blot di DNA dei soggetti di una famiglia affetta usando sonde del cromosoma 13 per testare la perdita di eterozigosita’ (LOH)

Verifica dell’ipotesi di Knudson

by N.A.

famiglia con figlia affetta da retinoblastoma: RFLP dell’esterasi D

Perdita di eterozigosita’ LOH

Cellule tumorali

omozigote eterozigote eterozigote LOH

by N.A.

La LOH si puo’ applicare sia ai tumori familiari che a quelli sporadici, suggerendo che, in entrambi i casi, gli eventi che conducono allo sviluppo del tumore interessino un locus sul cromosoma 13.

Nei casi familiari, gli alleli mantenuti nel tumore erano invariabilmente quelli ereditati dal genitore affetto

LOH

C’e’ una cosa da tenere presente: le cellule tumorali hanno lo stesso background genetico delle normali perche’ appartengono allo stesso individuo: le differenze fra loro sono imputabili al processo tumorale, non alla variabilita’ genetica e questo permette di utilizzare anche gli sporadici

by N.A.

la ricerca del gene si è concentrata sulla banda 13q14 e si sono cercate le sequenze espresse nelle cellule retiniche normali, che risultassero mutate nei soggetti affetti da retinoblastoma familiare

il punto di partenza è stato fornito dalla scoperta di un gruppo di tumori che presentavano una delezione omozigote corrispondente ad una sequenza di DNA clonata dalla regione 13q14

Clonaggio del gene del retinoblastoma

by N.A.

Nel retinoblastoma il trascritto era assente o di dimensioni molto diversi dal normale

pazienti con retinoblastoma ereditario portatori di tumori con delezioni omozigoti presentavano delezioni eterozigoti

nei tessuti costituzionali.....

Rb e’ un oncosoppresso

re

Clonaggio del gene del retinoblastoma

Ipotesi di Knudson confermata!

by N.A.

In molti casi le mutazioni non consistono in delezioni o alterazioni a carico del gene tali da

poter essere individuate con Southern blot, ma in mutazioni puntiformi piu’ difficili da evidenziare

test molecolare: sequenziamento esonico dopo PCR per rivelarle

Ricerca delle mutazioni

by N.A.

Altri oncosoppressori

by N.A.

Modalita’ di espressioneGli oncosoppressori vengono definiti recessivi. Perche?

Perche’ per manifestare il fenotipo e’ necessario che entrambi gli alleli siano mutati (anche se le mutazioni possono essere diverse)

Gli oncosoppressori sono geni la cui funzione normale non e’ sensibile alla quantita’ di prodotto: il mancato funzionamento di un allele non nepregiudica la funzione.

Attenzione: in questo caso il fenotipo di cui si parla e’ quello della cellula non dell’individuo!

Il tumore va considerato come un “individuo” : all’interno dell’organismoci sono cloni (“individui”) che non manifestano il fenotipo perche’ hanno un allele wild-type. Una cellula di questi cloni per caso muta l’allelewild-type: perde la funzione e si manifesta il tumore

by N.A.

by N.A. Identificazione di geni nei mammiferi by N.A. Studiare un genoma significa : / clonare le...

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