Preparazione dei frammenti di DNA da clonare

Scelta e preparazione del vettore

Giunzione del DNA da clonare al vettore

Introduzione nella cellula ospite

Selezione

Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi

Analisi dei prodotti

1200 bp

SacI

EcoRI

1.lisi cellulare

2.deproteinizzazione

3.concentrazione

Isolamento acidi nucleici

•Deproteinizzazione:agenti enzimaticisolventi organici

•Precipitazione:cationi + etanolo

(Na, NH4) isopropanolo

Purificazione acidi nucleici

Purificazione acidi nucleici

Purificazione acidi nucleici

•Protocollo “artigianale”

•Colonnine cromatografiche (kit commerciali)

Isolamento DNA plasmidico

Protocollo artigianale

Lisi cellulare con NaOH/SDS

Neutralizzazione con Kacetato(precipitazione di proteine)

Estrazione fenolo/cloroformio

Precipitazione con isopropanolo

Risospensione delle cellule in tampone con RNasi

Risospensione in TE

•Spettrofotometro (quantitativa)

•Elettroforesi su gel (qualitativa, semiquantitativa)

Analisi acidi nucleici

Spettro di assorbimento del DNA

220 240 260 280 300 320

0.5

1.0

1.5

lunghezza d’onda (nm)

Assorbanza(OD)

1 OD260=50g/ml

OD260/OD280=1,8-2,0

Elettroforesi di acidi nucleici

•Gel di agarosio

•Gel di acrilammide

PREPARAZIONE GEL DI AGAROSIO

GEL DI AGAROSIO

Elettroforesi su gel di agarosio

Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

CARICAMENTO GEL DI AGAROSIO

CARICAMENTO GEL DI AGAROSIO

CARICAMENTO GEL DI AGAROSIO

GEL DI AGAROSIO

Migrazione del DNA su gel

Le molecole lineari di dsDNA migrano a velocità

inversamente proporzionali al logaritmo in base 10 del

numero di paia di basi.

Fattori che influenzano la migrazione

•Peso molecolare

•Concentrazione di agarosio

•Conformazione DNA

•Voltaggio applicato

•Intercalanti

•Tampone di elettroforesi

Visualizzazione del DNA

Marcatori di peso molecolare

HindIII

DNA circolare consuperavvolgimento = 0

DNA superavvoltonegativamente

B. LEWIN, IL GENE - Edizione compatta, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2007

Tecniche di trasferimento su membrana (Blotting)

•Southern (blot)

•Northern (blot)

•Western (blot)

Metodi di trasferimento

•Capillare

•Elettroblot

carta 3MM

membrana nylon

gel

supporto

}

carta 3MM

tampone

vaschetta

Assemblaggio del blot capillare

Fattori che influenzano l’ibridazione

•Temperatura

•Forza ionica

•pH

ESERCITAZIONI DI BIOLOGIA MOLECOLARE AA 2008/2009

Descrizione generale esercitazioni di laboratorio

Analisi del risultato di un clonaggio mediante elettroforesi su gel di agarosio:

1) Preparazione di DNA plasmidico dalle colonie trasformate

2) Analisi del DNA plasmidico su gel di agarosio Preparazione soluzione per la digestione con enzimi di restrizione

3) Digestione DNA plasmidico con enzimi di restrizione Analisi spettrofotometrica del DNA preparato

4) Analisi della digestione su gel di agarosio Discussione dei risultati

1200 bp

SacI

EcoRI