Ogni proteina posso clonarla in infiniti modi:

Come scelgo le sequenze a.a. da clonare?

Su quali parametri posso basarmi per scegliere bene?

Scelta delle sequenze da clonare Rational design: Omologie di sequenze con proteine note Identificazione di domini funzionali mediante predizioni di struttura 2D e 3D

Gene constructs design primers Small, globular proteins (full length protein)

Larger and/or multi-domain proteins-full length protein-choose one or more domains (domains boundaries!)Well foldedMost likely unfolded Use structure prediction and multiple sequence alignments to design shorter constructs not to cut secondary structure elements http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/Cloning

SEQUENZA NUCLEOTIDICA

GeneBank http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrezEnsembl http://www.ensembl.org/index.html SEQUENZA PROTEICA E INFORMAZIONI SULLA PROTEINA

Swissprot website http://www.ebi.ac.uk/swissprot/ExPASy Proteomics Server http://www.expasy.org/proteomicsUniprot http://www.uniprot.org/ INFORMAZIONI SU SNPs (is a free public archive for genetic variation within and across different species)

dbSNPs http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/ RICERCHE DI OMOLOGIE E DOMINI CONSERVATI

BLAST http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHomePfam http://pfam.sanger.ac.uk/SMART http://smart.embl-heidelberg.de/RICERCHE BIOINFORMATICHE

RUN BLAST

Pfam

Pfam

Pfam

http://smart.embl-heidelberg.de/smart/job_status.pl?jobid=150217145174205841319494839vVWWzOodNA

ALLINEAMENTI DI SEQUENZE

ClustalW http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=npsa_clustalw.html

INFORMAZIONI STRUTTURALI

PDB http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do PREDIZIONE DI REGIONI TRANSMEMBRANA

http://www.sbc.su.se/~miklos/DAS/ http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/, http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED/form.html

PREDIZIONE DI SEQUENZE SEGNALE

http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/

PREDIZIONI TOPOLOGICHE

IUPREDhttp://iupred.enzim.hu/ FoldIndexhttp://bip.weizmann.ac.il/fldbin/findex

SECONDARY STRUCTURE PREDICTION METHODhttp://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html

TMHMM Server v. 2.0Prediction of transmembrane helices in proteinshttp://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/

PREDIZIONE DI SEQUENZE SEGNALE

LOOK FOR DISORDERED REGIONS IN THE SELECTED CONSTRUCThttp://bip.weizmann.ac.il/fldbin/findex

ALTRE ANALISI DI SEQUENZA

Presenza di codoni rari http://nihserver.mbi.ucla.edu/RACC

N-end rule (Varshavsky, A. (1996) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93, 12142-1214)

Il codice geneticoor Tor T

Rare codons (codon Bias)The frequency of codons are different among different organisms Codon analysis programs are available on line

Espressione di SOD1 umana (HSOD) Amplificazione del gene SOD1 da cDNA umano via PCR Preparazione del vettore (plasmide) di espressione Inserimento del gene in vettore di espressione Trasformazione del vettore in ceppo di E. coli

Screening delle colonie Coltura batterica Isolamento della proteina Purificazione Caratterizzazioni biofisiche preliminari

Amplificazione del gene SOD1Reverse PrimerDirect PrimerInizio seq. SOD trascritta

Condizioni di reazioneH2O sterile36.5 lBuffer per Taq (10 x) 5.0 ldNTPmix (10 mM ognuno, 200 M ognuno fin) 1.0 l Templato (cDNA genomico umano) 5.0 lPrimer SODHIndIII (100 pmol/l) 1.0 lPrimer SODSalI (100 pmol/l) 1.0 lTaq polimerasi* 5 U/l 0.5 l50.0 l*Aggiungere la Taq alla fine Cicli94 C594 C3055 C6030 cicli72 C2

72 C1015 CO/N

Purificazione prodotto PCRIl prodotto viene purificato con il QIAquick PCR purification kit (per purificazione di doppi o singoli prodotti di PCR da 100 bp a 10 kb)

Il DNA si assorbe su specifiche membrane di gel di silice in presenza di alta concentrazione di sali, mentre i contaminanti passano attraverso la colonna.

Lassorbimento del DNA su gel di silice dipende dal pH ed ottimale a pH 7.5 (tampone PB).

Il lavaggio viene effettuato con una soluzione contenente etanolo (PE) che lava via sali e altri contaminanti

Leluizione viene fatta in condizioni basiche, a bassa forza ionica, con 10 mM Tris pH 8.5.BindWashElute

Protocollo di purificazione del frammento PCR