DNA virtualLezione di biologia A.A. 2008/2009Liceo Scientifico “Bonghi” Lucera (FG)Classe 3 a, 3 b, 3c.

Docenti Collaboratori: Prof.ssa Massenzio FrancescaProf.ssa Prota MichelaProf.ssa Macchiarola Rosina

Come è costituito il DNA?

Codice della vita a 4 lettere:

dATP (ADENINA)

dGTP (GUANINA)

dCTP (CITOSINA)

dTTP (TIMINA)

Come è costituito il DNA?

Nel DNA sono codificati:

- gli amminoacidi che compongono le proteine- la sequenza degli amminoacidi stessi

A cosa serve il DNA?Il DNA fornisce le informazioni per la sintesi di tutte le proteine.

Perché si studia il DNA?

-Relazioni parentali.

- Test di identificazione in medicina forense

(omicidi, stupri ecc).

-Analisi prenatali (determinazione del sesso).

-Studio patologie (AIDS, difetti genetici, mutazioni).

-Studio di DNA antichi (mummie).

-Scienze veterinarie.

Biologia Molecolare

Studia gli esseri viventi a livello dei meccanismi molecolari alla base della loro

fisiologia.

Tecnologia del DNATecniche che consentono la rilevazione, l’analisi, la

manipolazione, l’amplificazione e la copia degli acidi nucleici.

Tecnologia del DNATecniche che consentono la rilevazione, l’analisi, la

manipolazione, l’amplificazione e la copia degli acidi nucleici.

Reazione a catena della polimerasi (PCR)

Clonaggio di DNA

Identificazione di frammenti di DNA con sonde

Sequenziamento del DNA

PCRReazione a catena della polimerasi

è una metodica che ha rivoluzionato la

Biologia Molecolare.

È l’amplificazione esponenziale in vitro di una specifica regione di DNA a doppia elica, di cui sono note le sequenze ai confini della regione.

PCRReazione a catena della polimerasi

Richiede due oligonucleotidi (primer)., ciascuno complementare ad una delle due eliche di DNA da amplificare , ed una DNA polimerasi (taq).

Cicli ripetuti di riscaldamento e raffreddamento amplificano la regione di DNA compresa tra i due primer, producendo grandi quantità di DNA.

PCRReazione a catena della polimerasi

Richiede due oligonucleotidi (primer)., ciascuno complementare ad una delle due eliche di DNA da amplificare , ed una DNA polimerasi (taq).

Cicli ripetuti di riscaldamento e raffreddamento amplificano la regione di DNA compresa tra i due primer, producendo grandi quantità di DNA.

PCRReazione a catena della polimerasi

DENATURAZIONE del DNA stampoApertura della struttura a doppia elica del DNA mediante riscaldamento (94-95°C)

fasi

ANNEALINGAppaiamento (ibridazione) dei primers alle rispettive sequenze complementari sul filamento di DNA stampo (50-65°C)

ESTENSIONE Polimerizzazione del nuovo filamento di DNA complementare allo stampo, ad opera dell’attività dell’enzima DNApolimerasi (72°C)

DNA

94°CDENATURAZIONE

94°C

DNA

94°C

DNA

PRIMER 1

PRIMER 2

60 °c

APPAIAMENTO

72°C

ESTENSIONE

DNA pol

oligonucleotidi

2 filamenti DNA

94°C

Ciclo successivo

4 filamenti DNA

E cosi via………..

Riassumendo

I componenti della MIX necessari per una reazione di PCR sono:

Un campione contenente il DNA – BERSAGLIO.

Una coppia di brevi PRIMERS di DNA a singolo filamento costruiti su un segmento a sequenza nota.

I quattro NUCLEOTIDI TRIFOSFATI ( dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

L’enzima DNA Polimerasi (TAQ -POLIMERASI).

Dove avviene la reazione?

Termal cicler

Il risultato di un esperimento di PCR è controllato mediante elettroforesi su gel

d’agarosio di una parte della reazione

Risultato esperimento di PCR

Dopo la corsa elettroforetica i frammenti di DNA amplificati si visualizzano ad uno strumento : VERSADOC, mediante la luce UV che colora le bande di DNA.

Risultato esperimento di PCR

Ogni banda corrisponde al gene che si è amplificato

Applicazioni della PCR:

- Diagnosi infezioni batteriche e virali- Diagnosi HIV- Diagnosi di Tubercolosi- Diagnosi cliniche di malattie causate da mutazioni- Diagnosi prenatale- Controllo efficacia terapie anti-cancro- Determinazione del sesso- Studi evoluzione molecolare

FINE