PROGETTO BIOTECH 1 Regione Veneto – LINEA DI RICERCA N. 14

Inquinamento virale in acqua e loro sedimenti: l’utilizzo della PCR nelle determinazioni analitiche di adenovirus quale indice di qualità.

EXPERTEAMEXPERTEAM

Experteam nasce nel 1996 per opera dei biologi Angelo De Bortoli e Federica Schiavon con una serie di kit innovativi in biologia molecolare per la ricerca di virus, batteri, protozoi e per la ricerca di malattie genetiche e tumori.

• ricerca

• produzione

• commercializzazione kit diagnostici

ATTIVITA’:

• Diagnostica genetica (microdelezioni cromosoma Y in pazienti oligo e azoospermici, X fragile, fattori della coagulazione, emocromatosi)

• Diagnostica virale (HPV, CMV)

• Diagnostica batterica e parassitaria (m. tuberculosis e complex, b. burgdorferi, ch. pneumoniae, p. carinii, t. gondii, g. lamblia)

• Diagnostica oncologica (linfomi B e T, traslocazioni cromosomiche)

• Determinazione di microorganismi negli alimenti (salmonella e listeria)

• Diagnostica e monitoraggio ambientale

• Organizzazione e coordinamento corsi specialistici

PRINCIPALI SETTORI DI ATTIVITA'

• il rischio di contrarre patologie dall’uso ricreativo delle acque analizzate (D.P.R. 155 del 1988: attuazione della direttiva 76/160/CEE relativa alla

qualità delle acque di balneazione)

• gli indici di qualità delle acque sulla base dei microrganismi e virus presenti

• l’efficienza di sistemi di depurazione

• un determinato ceppo batterico o virale definendone quindi anche l’origine (traceability).

studio per la successiva produzione e messa in commercio di kit diagnostici basati su metodologie di biologia molecolare per la determinazione di virus, batteri e protozoi nelle acque costiere, lagunari, fluviali e di scarico al fine di determinare:

SCOPO DEL PROGETTO

VIRUS ENTERICI VIRUS ENTERICI

Poliovirus EchovirusCoxsackievirus

Rotavirus Reovirus

EnterovirusEpatite ANorwalkvirus

Adenovirus

virus escreti tramite le feci, caratterizzati dall’abilità ad infettare principalmente i tessuti del tratto respiratorio e gastrointestinale dell’uomo e dei mammiferi

DETERMINAZIONE DI ENTEROVIRUS DETERMINAZIONE DI ENTEROVIRUS NELLE ACQUENELLE ACQUE

metodo tradizionale: coltura cellulare

• tecnicamente complesso

• lungo (10-30 gg. 1-3 passaggi BGM)

• costoso

• non sufficientemente sensibile

nuove biotecnologie: RT-PCR

• tecnicamente semplice

• rapido

• poco costoso

• altamente sensibile e specifico

PRELIEVO

CONCENTRAZIONE EDECONTAMINAZIONE

I PASSAGGIO SUCOLTURA CELLULARE

EFFETTO CITOPATICOASSENTE:Probabile assenzadi virus enterici

TECNICA DELL’IMMUNO-FLUORESCENZA

CAMPIONE POSITIVO:Presenza di enterovirus

CAMPIONE NEGATIVO:Presenza di virus enterici eAssenza di enterovirus

EFFETTO CITOPATICOPRESENTE:Presenza di virus enterici

EFFETTO CITOPATICOASSENTE:Probabile assenzadi virus enterici

TECNICA DELL’IMMUNO-FLUORESCENZA

CAMPIONE POSITIVO:Presenza di enterovirus

CAMPIONE NEGATIVO:Presenza di virus enterici eAssenza di enterovirus

EFFETTO CITOPATICOPRESENTE:Presenza di virus enterici

EFFETTO CITOPATICOASSENTE:

TECNICA DELL’IMMUNO-FLUORESCENZA

CAMPIONE POSITIVO:Presenza di enterovirus

CAMPIONE NEGATIVO:Presenza di virus enterici eAssenza di enterovirus

II PASSAGGIO SUCOLTURA CELLULARE

III PASSAGGIO SUCOLTURA CELLULARE

CAMPIONE NEGATIVO:Assenza di virus enterici e di enterovirus

METODO TRADIZIONALEMETODO TRADIZIONALE

Monostrato di cellule BGM (Buffalo Green Monkey). Sono cellule di rene di scimmia verde africana che hanno particolare suscettibilità per i virus enterici.

Tale metodo richiede da un minimo di 10 ad un massimo di 30 giorni.

FASI DI MESSA A PUNTO DEL METODOFASI DI MESSA A PUNTO DEL METODOper la determinazione mediante PCR di

enterovirus, adenovirus, HAV• Ricerca bibliografica

• Ottimizzazione della procedura di estrazione di RNA e DNA

• Ottimizzazione della fase di retrotrascrizione-amplificazione (scelta primers, determinazione t. annealing, etc)

• Reperimento ed analisi di controlli positivi

• Campionamento ed analisi di campioni ambientali

• Confronto tra metodologie PCR e metodi tradizionali

RT-PCR per l’analisi di ENTEROVIRUS in campioni di RT-PCR per l’analisi di ENTEROVIRUS in campioni di acque di scarico all’uscita dai depuratoriacque di scarico all’uscita dai depuratori

protocollo singolo step protocollo PCR nested

1 2 3 4 5 6 7 8 CN

CP 9 10 11 12 13 14 15 16

1 2 3 4 5 6 7 8 CN

CP 9 10 11 12 13 14 15 16

protocollo singolo step protocollo PCR nested

PCR per l’analisi di ADENOVIRUS in campioni di acque PCR per l’analisi di ADENOVIRUS in campioni di acque di scarico all’uscita dai depuratoridi scarico all’uscita dai depuratori

TIPIZZAZIONE ADENOVIRUSTIPIZZAZIONE ADENOVIRUS(sierotipi 40/41)(sierotipi 40/41)

PROTOCOLLO OTTIMIZZATOPROTOCOLLO OTTIMIZZATO

• prelievo campione

• concentrazione campione

• saggio su coltura cellulare(1 passaggio BGM)

• estrazione RNA virale

• retrotrascrizione

• PCR (I° ampl.)

• PCR nested (II° ampl.)

• elettroforesi gel agarosio

ENTEROVIRUS ADENOVIRUS

• prelievo campione

• concentrazione campione

/

• estrazione DNA virale

/

• PCR (I° ampl.)

• PCR nested (II° ampl.)

• elettroforesi gel agarosio

CAMPIONI 

acqua superficiale EC

ENTEROVIRUS (I° P BGM) ADENOVIRUS (TQ)

IF PCR PCR PCR 40/41

9721 POS POS POS POS POS

9552 NEG   NEG POS POS

9554 NEG   NEG POS POS

1397 NEG NEG POS POS

1398 NEG NEG NEG  

1728 NEG NEG POS NEG

2213 NEG NEG NEG  

2219 NEG NEG POS NEG

2389 NEG NEG POS POS

2558 NEG NEG NEG  

0485 POS POS POS POS / 

0321 POS POS POS POS  /

acqua scarico          

0706 POS POS NEG POS NEG

8970 NEG   NEG POS NEG

9761 NEG   NEG POS POS

2405 NEG NEG POS POS

2450 NEG NEG POS POS

RISULTATI

TOT. CAMPIONI 17

TOT. POSITIVI 3

ENTEROVIRUS

TOT. POSITIVI 14 ADENOVIRUS

protocollosingolo step

protocolloPCR nested

CP CN B CP CN

RT-PCR per l’analisi di HAVRT-PCR per l’analisi di HAVin campioni di acque di scarico in campioni di acque di scarico all’uscita dai depuratoriall’uscita dai depuratori

RT-PCR per l’analisi di REOVIRUS RT-PCR per l’analisi di REOVIRUS in campioni di acque di scarico in campioni di acque di scarico all’uscita dai depuratoriall’uscita dai depuratori

protocollosingolo step

protocolloPCR nested

CN CP B 1 2 3CN

PROTOCOLLO OTTIMIZZATOPROTOCOLLO OTTIMIZZATO

• prelievo campione

• concentrazione campione

• estrazione RNA virale

• retrotrascrizione

• PCR (I° ampl.)

• PCR nested (II° ampl.)

• elettroforesi gel agarosio

HAV REOVIRUS

• prelievo campione

• concentrazione campione

• estrazione RNA virale

• retrotrascrizione

• PCR (I° ampl.)

• PCR nested (II° ampl.)

• elettroforesi gel agarosio

CAMPIONI ANALIZZATI

POSITIVIADENOVIRUS

POSITIVIENTEROVIRUS

POSITIVIHAV

20 TQ 12 (60%) 1 (5%) 0 (0%)

19 IP 1 (5,3%)* 2 (10,5 %)* 0 (0%)

TOT. 39 13 (33,3%) 3 (7,7%) 0 (0%)

*I campioni positivi agli enterovirus sono stati analizzati mediante PCR specifica per determinare se si trattava di poliovirus, coxsackie o echovirus, l’analisi ha escluso la presenza di poliovirus .

Analisi di 39 campioni di acqua di scarico prelevati Analisi di 39 campioni di acqua di scarico prelevati all’uscita dei depuratori di 11 differenti siti nel periodo all’uscita dei depuratori di 11 differenti siti nel periodo

aprile –agosto ’05.aprile –agosto ’05.

CONCLUSIONI

la ricerca di adenovirus, quali indicatori di inquinamento fecale, è più semplice e sensibile rispetto a quella di enterovirus, mentre la determinazione di HAV sembra non essere significativa dato che nessuno dei campioni analizzati è risultato positivo a tale determinazione.

• maggiore sensibilità• materiale genetico di partenza DNA• non necessaria la coltura cellulare

VANTAGGI RISCONTRATI NELLA RICERCA DI VANTAGGI RISCONTRATI NELLA RICERCA DI ADENOVIRUS RISPETTO ENTEROVIRUS E HAV:ADENOVIRUS RISPETTO ENTEROVIRUS E HAV:

MESSA A PUNTO DI METODICHE MESSA A PUNTO DI METODICHE PER PCR QUANTITATIVAPER PCR QUANTITATIVA

Curve di amplificazione di 5 diluizioni (106,105,104,103,102 copie di genoma virale) del DNA plasmidico clonato contenente la sequenza 5’ UTR di Enterovirus

REAL TIME PCR metodica SYBR GREENREAL TIME PCR metodica SYBR GREEN

Curve di amplificazione di 5 diluizioni (106,105,104,103,102,10 copie di genoma virale) del DNA plasmidico clonato contenente la sequenza 5’ UTR di Enterovirus

REAL TIME PCR metodica TAQ-MANREAL TIME PCR metodica TAQ-MAN

Si sono determinati:1) la quantità di carica virale presente mediante real time PCR2) lo specifico ceppo (poliovirus, coxsackie o echovirus) mediante

sequenziamento

L’analisi quantitativa effettuata mediante Real Time PCR metodica Sybr Green determinava una presenza di virus nei campioni concentrati 5000 volte pari a 0.2 e 0.3 UFP/ml (Unità Formanti Placca / ml).

L’analisi di sequenza ha necessitato la messa a punto di un nuovo protocollo in grado di amplificare regioni variabili tra i diversi ceppi di enterovirus. Le tre regioni analizzate e sequenziate sono state : 5’NTR, VP1-2C, VP1-2.

Analisi su due campioni d’acqua concentrata già Analisi su due campioni d’acqua concentrata già risultati positivi per la presenza di enterovirus con il kit risultati positivi per la presenza di enterovirus con il kit Experteam “Enterovirus kit 1” Experteam “Enterovirus kit 1”

Sequenza ottenuta dall’amplificato 5’NTR del campione 1

L’analisi in Gene Bank ha determinatoCampione 1: Coxsackievirus B1Campione 2: Pur non giungendo ad una specifica tipizzazione si è potuto escludere che si trattasse di un enterovirus di origine umana già descritto in letteratura.

Determinazione di adenovirus in campioni già risultati positivi mediante pcr qualitativa.

Curve di amplificazione degli standard

Analisi di campioni

CT = 27 → [500 copie/l]CT = 34 → [5 copie/l]

REAL TIME PCR metodica SYBR GREENREAL TIME PCR metodica SYBR GREEN

DiscussioneDiscussione

Il confronto tra la determinazione mediante PCR qualitativa e Real Time PCR per la determinazione di enterovirus e adenovirus ha dimostrato come la PCR qualitativa risulti più sensibile rispetto alla Real Time. D’altra parte tutti i protocolli qualitativi utilizzati in questa fase erano “nested” mentre i protocolli Real Time erano tutti a singolo step.

Un confronto tra la procedura quantitativa Taq-Man rispetto alla Sybr Green ha dimostrato una maggiore sensibilità per la Sybr Green. Ulteriori prove vanno però effettuate utilizzando maggiore quantità di acidi nucleici nella miscela di amplificazione.

DETERMINAZIONE DI ADENOVIRUS DETERMINAZIONE DI ADENOVIRUS NEL CAMPIONE DI SEDIMENTO NEL CAMPIONE DI SEDIMENTO

MEDIANTE NESTED PCRMEDIANTE NESTED PCR

INIBITORI DELLA PCR NEL SEDIMENTOINIBITORI DELLA PCR NEL SEDIMENTO

Nell’ambito dell’amplificazione di adenovirus per l’eliminazione dell’effetto inbitore sono state provate 4 diverse procedure:

1. aggiunta di polivinilpolipirrolidone (PVPP) durante la procedura di estrazione

2. aggiunta di PVPP alla miscela di amplificazione

3. aggiunta della proteina di “T4 gene Protein” alla miscela di amplificazione

4. diluizione da 1/10 a 1/10.000 del DNA estratto 1 2 3 4 5 6 7

9 10 1112 13 1415 168

Campioni diluiti da 1:10 a 1:10000

Campioni con aggiunta della T4 Gene 32 Protein

I risultati migliori si sono ottenuti con le procedure 3 e 4:

• l’aggiunta della “T4 gene Protein” permette di non diluire il DNA estratto

• la procedura di diluizione non necessita dell’aggiunta di un ulteriore reagente. Non permette, però, di conoscere a priori il fattore di diluizione ideale per ogni campione

L’utilizzo dello strumento “FastPrep Instrument” (prodotto da Q-Biogene) ha reso notevolmente più semplice, sensibile e ripetibile l’estrazione del DNA e del RNA da sedimento rispetto ad altri metodi finora utilizzati.

CONCLUSIONI ATTIVITA’ DI RICERCACONCLUSIONI ATTIVITA’ DI RICERCA(sett. 04 – dic. 05)(sett. 04 – dic. 05)

• Messa a punto di 6 kit in PCR qualitativa (enterovirus, poliovirus, adenovirus, adenovirus 40 e 41, HAV e reovirus) e 2 kit in PCR quantitativa (enterovirus e adenovirus)

• La determinazione mediante PCR di adenovirus risulta la migliore come indice di contaminazione ambientale in quanto più sensibile, rapida e semplice, sia in acque concentrate che nel sedimento, rispetto alla ricerca di altri virus o microrganismi

• Data la complessità delle matrici (acque concentrate e sedimenti) va posta particolare attenzione nella fase di estrazione degli acidi nucleici soprattutto per la presenza di inibitori della Taq-polimerasi

• I laboratori italiani che si occupano di monitoraggio ambientale hanno dimostrato forte interesse per l’attività svolta, questo fa intuire un notevole successo di mercato dei prodotti e servizi sviluppati in tale ricerca.

Analisi delle acque di scarico, prelevati all’uscita dei Analisi delle acque di scarico, prelevati all’uscita dei depuratori di 11 differenti siti già precedentemente depuratori di 11 differenti siti già precedentemente analizzate, con l’aggiunta delle determinazioni di analizzate, con l’aggiunta delle determinazioni di

reovirus, norwalk virus e rotavirus.reovirus, norwalk virus e rotavirus.

- campione negativo + campione positivo / campione non analizzato

L’analisi dei reovirus sono state effettuate sia sul campione TQ (campione di acqua sottoposto solamente al trattamento di decontaminazione e concentrazione) sia sul campione BGM (campione di acqua al quale è stato effettuato anche un passaggio di coltura cellulare su cellule BGM): nessun campione è risultato positivo.

L’analisi di norwalk e rotavirus è stata effettuata solamente sul campione TQ in quanto tali virus non crescono su una coltura di cellule BGM.

SITO 3

CampioneData

prelievo

NORWALK

Nested

6497 TQ 05/07/05 ?

SITO 8

CampioneData

prelievo

NORWALK

Nested

20508843 TQ 02/08/05 ?

SITO 7

CampioneData

prelievo

ROTAVIRUS

Nested

20504479 TQ 27/04/05 +

L’analisi del sito 7 ha rilevato positività ai rotavirus, il dato è stato successivamente confermato mediante sequenziamento.

L’analisi dei siti 3 e 8 ha rilevato una probabile positività ai norwalk virus, il dato dovrà essere confermato mediante sequenziamento.

Norwalk virus

Campione probabilmente positivo da verificare mediante sequenziamento

50°C

53

°C55

°C57

°C60

°C50

°C

53°C

55°C

57°C

60°C

50°C

53

°C55

°C57

°C60

°CM

arca

toreSITO 4

9382SITO 36497

SITO 39805

Rotavirus

50°C

53

°C55

°C57

°C60

°C50

°C

53°C

55°C

mar

cato

reSITO 88843

SITO 74479

Campione positivo, verificato con sequenziamentro

Sequenza dell’amplificato di rotavirus

Analisi dei risultati ottenuti e confronto tra la positività riscontrate ai diversi virus analizzati, alla presenza di E. coli (determinazione effettuata per noi da ARPAV) ed al tipo di disinfezione presente nei diversi siti

E.Coli (UFC/100ml)UFC: unità formanti colonia

NaClO → ipoclorito di sodio CH3CO3H → acido peracetico

E.Coli (UFC/100ml)

I dati ottenuti hanno confermato ulteriormente come gli adenovirus risultino i migliori indicatori di contaminazione virale delle acque e che il trattamento di disinfezione migliore risulti quello con ipoclorito di sodio rispetto all’utilizzo di acido peracetico o al trattamento con radiazioni UV.

Interessante l’analisi del sito 4, dove ad un’elevata presenza di E. coli si somma la positività all’analisi di enterovirus (unico sito positivo), la positivita’ ad adenovirus e l’utilizzo di radiazioni UV come metodo di disinfezione.

Scelta dei siti di campionamento

-Sito SA1: Mulino Stucky - Canale dei Lavraneri-Sito SA2: Rialto - Canal Grande-Sito SA3: Ospedale Fatebenefratelli - Rio di Zecchini-Sito SA4: Ospedale SS. Giovanni e Paolo - Fondamenta nuove-Sito SA5: Santa Marta - Rio delle Terese-Sito SA6: Ca’ Giustiniani - Rio delle Eremite-Sito SA7: Marghera - Canale Vittorio Emanuele-Sito SA8: Fusina - Naviglio del Brenta-Sito SA9: Marghera (zona industriale) - Canale dei Petroli-Sito SA10: Arsenale - Canale di San Pietro

• Siti SA3, SA4 e SA10 probabilmente positivi perchè situati nelle vicinanze di Ospedali• Siti SA2, SA5 e SA6 probabilmente positivi perchè localizzati in canali nei quali vengono scaricate acque reflue• Siti SA1 e SA7 probabilmente negativi perchè situati in aree con notevole ricambio d’acqua• Siti SA8 e SA9 presi in considerazione perchè vicini alla zona industriale di Marghera e Fusina

Sono stati scelti 10 siti lagunari di campionamento, nei quali sono stati prelevati 10 litri d’acqua e 100 gr di sedimento mediante una benna o un carotatore, in base alla possibile presenza o meno di virus Enterici

SA3

SA4

SA2

SA1

SA5

SA6

SA10

SA9SA7

SA8

Carotatore utilizzato per i prelievi di sedimento

Benna utilizzata per i prelievi di sedimento

I campioni di acqua prelevati da ogni sito (10 L) sono stati conservati a +4°C per un periodo massimo di due giorni. Sono stati sottoposti al trattamento di decontaminazione e concentrazione, quindi utilizzati per inoculare un monostrato di cellule BGM di coltura cellulare. Sono stati considerati positivi ai virus enterici i campioni che determinavano effetto citopatico dopo un unico passaggio su coltura cellulare (10 giorni).

I campioni di sedimento prelevati da ogni sito (100 gr) sono stati conservati a -20°C per un periodo massimo di due giorni. E’ stata quindi effettuata l’estrazione del DNA mediante il FastDNA® SPIN Kit for Soil e il FastPrep® Instrument (Qbiogene) e dell’RNA mediante il FastRNA Pro Soil Direct Kit e il FastPrep® Instrument (Qbiogene).

I campioni di DNA ed RNA estratti sono stati analizzati mediante i vari kit Experteam per la determinazione qualitativa dei diversi virus enterici.

Tabella risultati sedimento e acqueSito H2O

effetto citopatico

Sedimento Adenovirus

Sedimento Enterovirus

Sedimento HAV

Sedimento Reovirus

Sedimento Rotavirus

Sedimento Norwalk

virus

SA1 - + - + - + -SA2 - + - - - + -SA3 +/- + +/- - - - -SA4 + + - + - + -SA5 - + - - - - -SA6 + + - - - + -SA7 - + - - - - -SA8 - + - - - + -SA9 - + - - - - -

SA10 - + - - - + -

Conclusioni relative ai dati sui sedimentiConclusioni relative ai dati sui sedimenti

dell’Ospedale SS. Giovanni e Paolo. Le acque reflue dell’Ospedale vengono scaricate direttamente in acqua ed è probabile che contengano una maggiore quantità di virus, quindi è plausibile che questo sito sia maggiormente contaminato rispetto ad altri. E’ da chiarire, invece, la causa della positività del sito SA1.Il sito SA3 mostra una debole positività agli Enterovirus nel sedimento e un debole effetto citopatico nelle acque. Questo dato può indicare una correlazione tra presenza di virus nel sedimento e nell’acqua circostante e può confermare l’ipotesi che il sedimento funga da serbatoio di virus presenti nell’acqua.I siti SA2, SA6 ed SA10 sono positivi ai Rotavirus, probabilmente perché le acque reflue della zona sono scaricate direttamente in acqua e nei canali nei quali è stato effettuato il campionamento non vi è un grande ricircolo d’acqua.L’acqua del sito SA8 ha una temperatura superiore alla media, data la presenza degli scarichi della centrale elettrica, e questo può spiegare la positività ai Rotavirus ma non ad altri virus enterici, dato che i Rotavirus sono riscontrati più frequentemente alle temperature più elevate. Il sito SA5 è risultato negativo per tutti i virus Enterici a RNA.I siti SA7 e SA9 sono risultati negativi a tutte le analisi per i virus Enterici a RNA probabilmente perché situati in una zona con grande ricircolo d’acqua e nella quale non vi è scarico di acque reflue.

I siti nei quali si riscontra una maggiore positività ai virus Enterici (Adenovirus, HAV e Rotavirus) sono i siti SA1 ed SA4. Il sito SA4 è situato nelle vicinanze

sario effettuare la medesima analisi mediante real time PCR (PCR quantitativa) al fine di individuare una possibile scala del livello di inquinamento.

Particolarmente interessante in tale ambito risultano invece le determinazioni di HAV e rotavirus, in quanto i campioni di acqua analizzati precedentemente erano sempre risultati negativi a tali virus.

Nessun campione analizzato è invece risultato positivo per l’analisi di norwalk virus e reovirus.

Appare quindi evidente, anche se in via preliminare, come il significato dei diversi virus enterici rilevabili mediante PCR assuma valore diverso a seconda del tipo di campione analizzato (acqua o sedimento).I dati relativi al sedimento risultano comunque di difficile interpretazione non essendo ancora stata effettuata alcuna analisi in PCR sui campioni di acqua corrispondenti. Ulteriori informazioni si potranno ottenere dall’analisi mediante real time PCR di acqua e sedimento.

ConclusioniConclusioni

Dall’analisi dei dati riportati in tabella risulta come la determinazione qualitativa di adenovirus nel sedimento risulti di poca rilevanza, dato che tutti i siti analizzati sono risultati positivi. Sarà quindi neces-

PROTOTIPI KIT ALLESTITIPROTOTIPI KIT ALLESTITI

Adenovirus Kit 1 -RQ

Sistema completo per la quantificazione di Adenovirus in campioni ambientali mediante Real Time PCR. La determinazione quantitativa oltre ad indicare un potenziale rischio sanitario, soprattutto per le categorie a rischio quali bambini, anziani, pazienti immunosoppressi, costituisce un indice di qualità dell’acqua per il suo utilizzo in ambito potabile, ricreativo e lavorativo.

Concentrazione

PCR QUANTITATIVA

Estrazione DNA

Campioni d’acqua

Risultato : copie di genoma di Adenovirus presenti nel campione d’acqua concentrato per l