PRODUCCION Y EVALUACION DE UN INOCULANTE …

PRODUCCION Y EVALUACION DE UN INOCULANTE MICROBIANO CON CAPACIDAD AMILOLITICA A PARTIR DE UN PROCESO DE

COMPOSTAJE DE RESIDUOS DE LECHUGA

Laura Carolina Barrera Beltrán Natalia Charry Uribe

TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial

Para optar al título de

MICROBIOLOGO INDUSTRIAL

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL Bogotá, D.C.

Febrero de 2008

NOTA DE ADVERTENCIA

Artículo 23 de la resolución No. 13 de julio de 1946

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en

sus trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada contrario al dogma y la

moral católica y porque la tesis no contenga ataques personales contra persona alguna,

antes bien se vea en ellas el anhelo por buscar verdad y justicia”.




APROBADO

_______________________________ ____________________________ María Mercedes Martínez Jaime Augusto Casas Microbióloga M. Sc Químico Directora Codirector _______________________________ Edna Viviana Gutiérrez Microbióloga Industrial Asesora _______________________________ _____________________________ Ivonne Gutiérrez Jacinto Rodríguez Jurado Jurado




APROBADO

______________________________ _____________________________ Dra. Ángela Umaña Muñoz Dra. Janeth Arias Decana Académica Bacterióloga M. Sc Facultad de Ciencias Directora de Carrera

DEDICATORIA

Agradezco a Dios por permitirme llegar a este punto de mi vida, especialmente a mis padres por su esfuerzo para educarme, por su apoyo incondicional e incluso por su participación en este trabajo,

a mi hermano por su apoyo incondicional y por creer en mi.

A mi familia y amigos por su confianza y apoyo, pero sobre todo por estar ahí siempre en los momentos difíciles.

Laura Barrera

i

TABLA DE CONTENIDO

Número Título Página

Lista de tablas

Índice de figuras

Lista de anexos

Resumen

1 Introducción 1

2 Marco teórico 3

2.1 Lechuga (Lactuca sativa) 3

2.1.2 Ciclo de cultivo 3

2.1.3 Requerimientos Fisicoquímicos 4

2.1.4 Variedades 4

2.1.5 Aportes Nutricionales 5

2.2 Compost 6

2.2.1 Factores determinantes del compostaje 7

2.2.2 Características fisicoquímicas 12

2.2.3 Calidad del compost 13

2.3.1 Materia orgánica 14

2.3.2 Enzimas en procesos de compost 16

3 Justificación 18

4 Objetivos 19

4.1 Objetivo General 19

4.2 Objetivos específicos 19

5 Metodología 20

5.1 Recolección de las muestras 20

5.1.1 Sitio de muestreo 20

5.1.2 Recolección de muestras 20

5.2 Procesamiento de muestras 20

5.2.1 Fase I: Caracterización del proceso de compostaje 20

5.2.1.1 Temperatura y pH 21

5.2.1.2 Actividad enzimática del compost 21

5.2.1.3 Evaluación de dos métodos para extracción de amilasas 21

5.2.1.4 Cuantificación de azúcares reductores mediante la técnica de

ii

Somogyi- Nelson 22

5.2.1.5 Cuantificación de la biomasa microbiana presente en el compost 23

5.2.1.6 Determinación de materia orgánica 23

5.2.2 Producción del inoculante mixto 24

5.2.2.1 Aislamiento primario de cepas amilolíticas 24

5.2.2.2 Aislamiento secundario y selección 25

5.2.3 Conservación de cepas 25

5.2.4 Selección de cepas por antagonismo 26

5.2.5 Curvas de crecimiento 27

5.2.5.1 Elaboración de pre- inóculo 27

5.2.5.2 Fermentación discontinua 28

5.2.6 Curva de crecimiento del inoculante mixto 28

5.2.7 Producción del inoculante mixto 29

5.3 Evaluación del inoculante mixto en campo 29

5.3.1 Variables evaluadas 29

5.3.1.1 Determinación de materia orgánica 30

5.3.1.2 Caracterización microbiológica del compost 31

5.4 Análisis de la información 31

6 Resultados y discusión 34

6.1 Caracterización del proceso de compostaje 34

6.1.1 Temperatura y pH 34

6.1.2 Seguimiento de la actividad amilolítica y biomasa de

Microorganismos amilolíticos en la pila 2 36

6.1.3 Cuantificación de MOT y COT 39

6.2 Fase I: Producción del inoculante mixto 40

6.2.1 Aislamiento de microorganismos amilolíticos termófilos 40

6.2.2 Selección de las cepas por antagonismo 44

6.2.3 Curvas de crecimiento 44

6.2.4 Curva de crecimiento del inoculante mixto 47

6.2.5 Fase II: Evaluación del inoculante mixto en campo 48

6.2.5.1 Comparación entre los dos métodos de extracción de amilasas 49

6.2.5.2 Cuantificación de la actividad amilolítica de las pilas tratamiento y

Control 52

6.2.5.3 Cuantificación de la biomasa amilolítica en las pilas tratamiento y

iii

Control 54

6.2.5.4 Cuantificación de los porcentajes de MOT y COT 55

6.2.5.5 Análisis de la temperatura y el pH 58

6.2.5.6 Características Fisicoquímicas obtenidas en los tratamientos 60

6.2.5.7 Calidad microbiológica del compost obtenido 62

7 Conclusiones 65

8 Recomendaciones 66

9 Bibliografía 67

iv

ÍNDICE DE TABLAS


1 Composición nutritiva de la lechuga 6

(100 g porción comestible)

2 Composición química de la cascarilla de arroz 9

3 Parámetros a caracterizar en el abono según NTC 5167/04 12

4 Parámetros que permiten determinar la calidad del compost 13

5 Características morfológicas de las cepas con actividad amilolítica

obtenidas durante el asilamiento primario 41

6 Determinación semicuantitativa de la actividad amilolítica de

las cepas aisladas y purificadas. 43

7 Resultados de las pruebas de antagonismo realizadas

con las 5 cepas aisladas 44

8 Resultados %MOT al cabo del segundo día de compostaje

por vía húmeda y seca. 56

9 Características fisicoquímicas del compost obtenido durante

la fase II 62

10 Caracterización microbiológica del compost 63

v

ÍNDICE DE FIGURAS


1 Comportamiento de la temperatura en las Pilas de

compostaje 1 y 2 35

2 Comportamiento del pH de las Pilas de compost 1 y 2 35

3 Actividad amilolítica y biomasa amilolítica de la pila de

compost 2 37

4 Determinación de la materia orgánica presente en la Pila de

Compost 2 39

5 Microscopía de la cepa AA5 42

6 Microorganismos amilolíticos aislados de muestras de

Compost 43

7 Cuantificación individual de la actividad amilolítica de los

microorganismos aislados 45

8 Curva de Crecimiento de los microorganismos aislados, en medio

Almidón 1% (p/v) 46

9 Cuantificación de la Actividad Amilolítica y la biomasa del

Inoculante mixto 47

10 Cuantificación de la Actividad Amilolítica presente en la

Pila con Inoculante luego de utilizar dos métodos de extracción

de amilasas 49

11 Comparación de los métodos de extracción enzimática para

cada uno de los tratamientos 50

12 Cuantificación de la Actividad Amilolítica presente en la Pila

Control luego de emplear dos métodos de extracción de

amilasas 51

13 Comparación estadística de las actividades amilolíticas entre pilas

tratamiento y control 53

14 Recuento de biomasa amilolítica en las Pilas Control y con

Inoculante 54

15 Comportamiento la materia orgánica (% m/m) en las pilas

vi

tratamiento y control 56

16 Carbono Orgánico Total presente en las pilas tratamiento

y control 58

17 Temperaturas alcanzadas por las pilas tratamiento y control

durante la Fase 59

18 Comportamiento del pH en las pilas Control y con Inoculante 60

vii

ANEXOS


1 Composición de buffers Sorensen y Citrato- Fosfato 79

2 Composición de agar almidón 1%, sal ferrosa y agua- melaza 80

3 Curva de calibración para Somogyi- Nelson 81

4 Actividad enzimática 82

5 Correlación entre la biomasa y UA 84

6 Comparación de MOT entre tratamientos 85

7 Comparación del pH y la temperatura en los tratamientos

evaluados 88

RESUMEN

La Lactuca sativa o lechuga es una hortaliza que se siembra en regiones templadas,

ocupa poco espacio y posee un ciclo de crecimiento muy corto. Acorde con el último

estudio realizado por el DANE en el año 2003 se produjeron 9968,4 toneladas de

lechuga en Cundinamarca, des las cuales 647,9 toneladas fueron consideradas como

material residual.

Por medio del compostaje se busca disminuir el impacto ambiental que tienen los

residuos agrícolas, dentro de los desechos provenientes del cultivo de lechuga. El objeto

del estudio fue producir y evaluar u inoculante microbiano con capacidad amilolítica a

partir de un procesos de compostaje de residuos de lechuga.

Se llevó a cabo el aislamiento de cinco cepas amilolíticas termofílicas (AA1, AA2,

AA3, AA4 y AA5) que fueron aisladas a partir de las materias primas y que

evidenciaron una alta actividad amilolítica (entre 25000 y 41509 UA). Con dichas cepas

se produjo un inoculante mixto, que fue aplicado a la pila tratamiento.

Se evaluó el proceso de degradación de la materia orgánica presente en las pilas de

compost tratamiento y control, a partir de parámetros como temperatura, pH, actividad

amilolítica, recuento en placa de biomasa amilolítica termofílica, cuantificación de

materia orgánica y características fisicoquímicas.

Para determinar la actividad amilolítica presente en las pilas, se evaluaron dos métodos

de extracción de amilasas, observándose que el método que logró extraer mayor

cantidad de dichas enzimas fue el que emplea buffer citrato con valor de p< 0.001.

Al comparar el proceso de degradación de los dos tratamientos, se encontró que no hubo

diferencias estadísticamente significativas al final del proceso, con valores de p > 0.79

para el contenido de materia orgánica, de p > 0.254 para la actividad amilolítica, de p>

0.92 para pH y p> 0.79 para temperatura.

Al final de los procesos tratamiento y control, se obtuvo un compost con presencia de

Salmonella (< 0.59 NMP/ 4g para el control y 1,01 NMP/ 4g para el tratamiento) y

Escherichia coli (>2400 NMP/g para el control y 480 NMP/ g para el tratamiento); y

con características fisicoquímicas aceptadas por la NTC 5167 de 2004, como C/N 12 y

11 para control y tratamiento respectivamente y nitrógeno, fosforo y potasio > 1% en

los dos casos.

1

1. INTRODUCCIÓN

La lechuga Lactuca sativa es una hortaliza que se puede sembrar en las regiones templadas,

ocupa poco espacio y el ciclo de crecimiento es muy corto. Aporta a la dieta minerales como el

calcio, hierro, potasio, magnesio, sodio, azufre, aluminio, cobre, cobalto, silicio, selenio, circonio

y estroncio, vitaminas A, C, E, B1, B2 y B3, betacaroteno, fibra, aminoácidos como alanina,

cistina, histidina, glicina, isoleucina, leucina, lisina, serina, tirosina y valina, lactucina, pectinasas

y ácidos como el ascórbico, cítrico, aspártico, glutámico, linoléico, oleico, málico, oxálico,

palmítico, esteárico y alfa- linoléico. Su alto porcentaje de humedad (95%) la hace un alimento

fácil de digerir.

Según el último estudio realizado por el DANE en el año 2003, en Colombia se produjeron

14.261 toneladas de lechuga al año, de las cuales el 69,9% fueron cultivadas en Cundinamarca

(9968,4 toneladas); de este 69,9% se distribuyeron 9320,4 toneladas, originando una pérdida de

647,9 toneladas (DANE, 2003; Velásquez et al., 2003).

Los residuos agrícolas provenientes de cultivos de lechuga, son generalmente considerados

basura, la cual puede ser quemada, llevada a los rellenos sanitarios de las ciudades o apilada. Sin

embargo por sus características nutricionales podría ser empleada para la producción de abono

por medio del proceso conocido como compostaje, el cual se basa en el tratamiento de los

residuos orgánicos, a través de un proceso de transformación que permite convertirla en un

producto de características físicas y químicas estables y limpio desde el punto de vista higiénico

y sanitario.

La importancia agrícola del compost no radica en su contenido de nutrientes (0.65% de

nitrógeno, 0.3% de P2O5 y 0.25% de K2O sobre materia húmeda), sino en su alto contenido en

materia orgánica activa, que oscila alrededor del 28%, y sus sustancias húmicas, así como su

importante aporte de oligoelementos, tales como el cobalto, cobre, magnesio, zinc, boro,

molibdeno, cuya influencia en el desarrollo de los cultivos se pone cada vez más de manifiesto,

ya que son componentes indispensables de la mayoría de las enzimas (López, 2002).

2

Este producto mejora las condiciones fisicoquímicas del suelo y también aporta poblaciones

microbianas que por medio de sus sistemas enzimáticos, degradan materia orgánica y la

mineralizan de manera que se generan productos inorgánicos solubles, los cuales también son

aprovechados por las plantas, mejorando la calidad de los cultivos. Al agregar compost al suelo,

se estimulan considerablemente las poblaciones microbianas, especialmente bacterias y hongos,

lo cual es muy importante ya que se acelera el proceso (Lee et al., 2003; Saebo y Ferrini., 2006;

Granados et al., 2003; Páez et al., 2000).

Para poder determinar la eficiencia de la degradación de la materia orgánica por parte de los

microorganismos, se toman como referencia las enzimas extracelulares producidas durante el

proceso de degradación de materia orgánica como amilasas, celulasas, proteasas, lipasas, entre

otras; igualmente, concentración de materia orgánica y carbono orgánico oxidable. Por esta

razón, hacer un seguimiento de la actividad enzimática en el compost y del proceso de

humificación resultan útiles indicadores para evaluar algunos parámetros de la calidad del

proceso de degradación.

3

2. MARCO TEORICO

2.1. Lechuga (Lactuca sativa)

La lechuga pertenece a la familia de las compuestas, originaria de la cuenca del Mar

Mediterráneo. Algunos reportes históricos indican que esta hortaliza era utilizada por los

egipcios 3000 años A.C., para extraer aceites de la semilla y también como alimento diario.

Es una planta herbácea anual, tolerante a las heladas (excepto cuando está próxima a la cosecha),

que prefiere las temperaturas frescas (15 – 20 °C), prácticamente sin tallo, de consistencia

carnosa, que según las variedades va a formar, o no, una cabeza de repollo en la parte central, de

colores de hoja variable (verde en distintas tonalidades, rojos, morados), también de aspecto de

hoja variable (lisa, mantecosa, rizada, crespa). Las raíces son densas y superficiales, alcanzando

una profundidad máxima de 60 cm, teniendo capacidad de regeneración de nuevas raíces,

aspecto importante pues hace posible el transplante (<Romeo, 2005 online >).

2.1.2. Ciclo de cultivo

En el ciclo de crecimiento se distinguen 3 fases, plántula, roseta y formación de la cabeza.

• Plántula: desde la emergencia de la semilla hasta que la planta tiene 4 hojas. Esta fase

dura entre 30 y 40 días.

• Roseta: desde que tiene 4 hojas hasta que tiene 12 hojas. Esta fase dura 20 días.

• Formación de la cabeza: después de 12 hojas hasta cabeza bien formada. Esta fase dura

20 días.

La siembra se hace en semillero o por siembra directa. En el primer caso, se hace luego de 20

días de la germinación, cuando la planta cuenta con 8 cm de altura. La distancia de plantación

oscila entre 20 y 30 cm entre las filas, y otro tanto entre las plantas de la misma fila, dependiendo

del tamaño propio de la variedad (Block, 1998).

4

Antes de realizar la siembra, se adecúa el terreno removiendo parcial o totalmente el material

residual proveniente de la cosecha anterior. En el invernadero, se remueve totalmente la materia

orgánica (incluyendo raíces), mientras que en el terreno no cubierto sólo se remueven las hojas

residuales de lechuga. Luego de limpiar las camas, se aplica una capa de abono orgánico

proveniente de un proceso de compostaje de flores, además de una delgada capa de cascarilla de

arroz.

Debido a que la lechuga requiere una gran cantidad de agua, los cultivos deben regarse una vez

al día, sin embargo, en época de sequía o cuando la temperatura asciende demasiado, se hace

necesario hacer el riego dos veces (Block, 1998). En el caso de las lechugas conservadas en

invernadero, se cuenta también con riego por goteo, a través del cual se suministra agua varias

veces al día.

2.1. 3. Requerimientos fisicoquímicos

El agua es uno de los factores de crecimiento más importante de la lechuga ya que constituye el

95% de su peso, para un crecimiento continuo se debe proporcionar un contenido uniforme y alto

de humedad en el suelo durante todo el ciclo. Cuando se alcancen temperaturas altas, la

frecuencia de riego debe ser mayor (diaria) que el resto del año (una vez a la semana). La

deficiencia de humedad en el suelo, genera una detención en el crecimiento de la planta,

aumentando el contenido de fibras de las hojas, produciéndose plantas duras y de colores verde

oscuro (Romeo, 2005 <online >).

La producción de lechuga puede realizarse sobre una gran variedad de suelos, siendo preferidos

aquellos fértiles y ricos en nitrógeno, ligeros, con buen drenaje (que no presente

encharcamientos), con pH ideal entre 6.5 y 7.5 (Romeo, 2005 <online >).

2.1. 4. Variedades

Las variedades de la lechuga se pueden clasificar en diferentes grupos botánicos (Block, 1998).

5

• Romanas: No forman un verdadero cogollo, las hojas son alargadas, con bordes enteros

y nervio central ancho.

1. Romana: incluye la verde lisa, verde crespa, morada crespa y morada lisa; estas

variedades se siembran en el cultivo del cual se obtendrán los residuos para

realizar el compostaje. También se emplearán residuos de rúgula, romanesco,

colchina o col de bruselas, aunque en menores proporciones, debido a que la

cantidad producida de estos otros no es tan alta como la de lechuga.

2. Baby: en su inicio el tallo tiene forma de disco del que surgen las hojas formando

rosetas que posteriormente se acogollan. Esta variedad en especial forma cogollos

muy compactos. Su temperatura óptima de cultivo está entre los 15 y 25 °C. Su

ciclo de desarrollo dura 45 días; su estado óptimo de recolección es cuando el

cogollo está bien formado y compacto, si no se realiza el corte a tiempo tiende a

espigarse (Romeo, 2005 <online >).

• Acogolladas: Estas lechugas forman un cogollo apretado de hojas

1. Batavia

2. Mantecosa o Trocadero

3. Iceberg

(Romeo, 2005 <online >).

2.1. 5. Aportes nutricionales

La lechuga es un alimento que aporta muy pocas calorías, alto porcentaje de agua (90-95%),

folatos, vitaminas (cantidades apreciables de vitamina C), provitamina A o beta-caroteno (estas

dos últimas con acción antioxidante, relacionadas con la prevención de enfermedades

cardiovasculares e incluso ciertos tipos de cáncer), minerales (potasio, magnesio) y fibra

(necesaria para el buen funcionamiento intestinal) (tabla 1). Las hojas externas de color más

oscuro son más nutritivas que las blanquecinas del interior. La lechuga romana cultivada al aire

libre es la más rica en vitaminas (Woldford, 2003).

6

Tabla 1. Composición nutritiva de la lechuga (100g porción comestible).

Kcal H2O Carbohidratos

(g)

Fibra

(g)

Potasio

(mg)

Magnesio

(mg)

Carotenos

(mg)

Vit C

(mg)

Folatos

(mg)

14 1.4 1.5 240 12 59.17 12 34

Fuente: Block, 1998.

Su riqueza en minerales, especialmente potasio, que es necesario para mantener un nivel

adecuado de líquidos en el cuerpo, junto con el calcio y el fósforo la hace especialmente

adecuada para el correcto bienestar de los huesos. Presenta además una serie de oligoelementos

como el selenio, un antioxidante que tiene un papel fundamental en la prevención de cierto tipo

de cánceres, como el de colon, próstata o pulmones (Woldford, 2003).

Contiene muchos aminoácidos necesarios para la formación de las proteínas, algunas, como la

alanina, a veces necesarias para la construcción del tejido muscular y nervioso, otras, como la

glicina, para el correcto funcionamiento del sistema inmunológico. Posee vitaminas C y E, pero

sobre todo, es rica en betacaroteno, que el hígado trasforma en vitamina A (Drotleff, 2006)

2.2. Compost

El compostaje es un método utilizado para transformar los desechos biodegradables, incluyendo

plásticos biodegradables, residuos sólidos urbanos, alimentos para animales y residuos agrícolas

e industriales, en productos útiles para mejorar el suelo. El compostaje acelera la degradación de

materia orgánica heterogénea por la acción de diferentes poblaciones microbianas que trabajan

en conjunto y que se encuentran bajo condiciones controladas (Gangjyal et al., 2007).

Dentro del proceso de compostaje, los microorganismos primarios que intervienen son bacterias,

hongos y actinomycetes produciendo enzimas extracelulares, como amilasas, lipasas y proteasas

que en pequeñas cantidades promueven actividad química catalizando la descomposición de

materia orgánica. No obstante, existen ciertos factores que pueden afectar el proceso de

compostaje como los factores ambientales, los microorganismos involucrados, el tipo de residuos

y su manejo (Dávila et al., 2002).

7

La materia orgánica junto con el abono mineral son necesarios, además de complementarlo. Por

ello, se recomienda la mezcla del compost con el abono químico. El abono proporciona al suelo

del cultivo la fertilidad química y el compost la estructura física y biológica, necesaria para que

se consigan las condiciones idóneas para el crecimiento de las plantas (López, 2002).

Los factores más importantes que afectan el éxito de la aplicación del compost para los

propósitos de la agricultura son el grado de estabilidad y la madurez. La aplicación de un

compost inestable o inmaduro puede inhibir la germinación de las semillas, reducir el

crecimiento de la planta, causar daños en los cultivos como fitotoxicidad en las plantas, o una

competencia por el oxígeno (Wu et al., 2000).

La biodegradación de materia orgánica es el principal proceso que envuelve la bioestabilización

de los residuos orgánicos, y es usualmente expresada en función de la biodisponibilidad de

materia orgánica; se define en términos de tasa o grado de descomposición de materia orgánica,

estando fuertemente relacionada con la tasa de actividad microbiana en el proceso de compostaje

(Said-Pullicino et al., 2007). Autores como Iannotti et al., (1994) y Lasardi et al., (1998) han

reportado que existe una fuerte relación entre la estabilidad del compost y la concentración de

carbono orgánico disuelto. Durante el compostaje, procesos tales como la solubilización llevada

a cabo por la degradación microbiana de la materia orgánica, síntesis bioquímica de compuestos

de bajo peso molecular son los responsables de los cambios en la concentración y composición

química de la materia orgánica disuelta (Said-Pullicino et al., 2007).

2.2.1 Factores determinantes del compostaje

Los factores que influyen en un proceso de compostaje son muchos y de gran importancia ya que

si no se manejan adecuadamente, se genera un desequilibrio que puede afectar drásticamente el

proceso, lo que tiene graves consecuencias en la obtención del producto deseado. Dichos factores

incluyen temperatura, pH y relación C/N, entre otros.

8

• Relación Carbono Nitrógeno (C/N)

El carbono y el nitrógeno son nutrientes muy importantes para los microorganismos en el

proceso de compostaje. En primer lugar, el carbono provee energía y el nitrógeno es usado para

la reproducción y la síntesis de proteínas. En general cerca de 25 veces más de carbono es

necesitado por un organismo comparado con la necesidad de nitrógeno por lo cual es necesario

tener una proporción adecuada de ambos elementos (25:1 – 30:1) (Sherman., 1999).

Las pérdidas de nitrógeno por volatilización durante el compostaje reducen el valor del abono

orgánico y constituye una importante perdida económica. La disponibilidad de carbono, el

tamaño de la partícula, el contenido de humedad y la aireación son factores que afectan la

volatilización del nitrógeno en el compost, ya que una alteración en estas variables puede

impedir que el nitrógeno se inmovilice en las células microbianas (Barrington et al., 2001).

Estudios realizados por Beuning et al., (2007) demuestran que el pH es un factor determinante en

la volatilización del nitrógeno en el compost, ya que afecta la denitrificación de la cual se

obtienen gases (amonio y amoniaco) que serán liberados a la atmósfera, aunque esto también

está ligado a la presencia de oxígeno, ya que condiciones anaeróbicas favorecen la producción de

dichos gases. Por otra parte, según Van Der Selt et al., (2006) la temperatura también interviene

en la volatilización del nitrógeno ya que a medida que esta aumenta, también aumenta la pérdida

del elemento (Van Der Selt et al., 2006).

El carbono es el elemento que define a la materia orgánica ya que es su principal componente,

aunque también contiene nitrógeno en menor proporción. La relación C/N considerada como

óptima al principio del proceso es de 20 a 30; y a medida que la materia orgánica es atacada y

descompuesta por los microorganismos va descendiendo la relación C/N hasta acercarse al valor

del humus de alrededor de 10:1 (Zhu, 2006).

Teniendo en cuenta que la lechuga y en general los residuos vegetales poseen una baja cantidad

de carbono (la lechuga tiene 44% p/p de carbono), es necesario nivelar la relación C/N. Para ello

es posible realizar mezclas con materiales como la cascarilla de arroz, paja, aserrín, hojas secas,

entre otros (Foru, 2003) que permiten mejorar la del material a compostar.

9

La cascarilla de arroz no presenta propiedades nutritivas significativas, contiene un alto

porcentaje de dióxido de silicio (SiO2) y su humedad es del 10% debido a su carácter hidrofóbico

(tabla 2). (Salgado, 1999).

Tabla 2. Composición química de la cascarilla de arroz

Componente Valor (% m/m)

SiO2 42.16

K2O 0.472

MgO 0.053

CaO 0.127

Fuente: Treviño y Gómez, 2003.

• Temperatura

Debido a que todas las reacciones que se llevan a cabo dentro del proceso de compostaje son

exotérmicas la temperatura es un buen indicador del proceso. La temperatura aumenta

rápidamente luego de la formación de las pilas, disminuyendo gradualmente a la vez que el

proceso de descomposición va terminando. El amplio rango de temperaturas que se manejan

hace que se encuentren diferentes grupos de microorganismos lo que facilita y aumenta el

proceso de descomposición. El compostaje ha mostrado ser factible cuando la temperatura

ambiente oscila entre los 20 y 30ºC (Marguesin et al., 2006)

La temperatura durante el proceso de compostaje aumenta conforme los microorganismos

realizan las actividades metabólicas para degradar la materia orgánica. Las altas temperaturas

son necesarias para lograr un compostaje efectivo ya que contribuyen sustancialmente a los altos

índices de degradación alcanzados en el proceso, pero temperaturas por debajo de los 20ºC, han

demostrado que causan la inhibición del proceso. Por otra parte, cuando la temperatura excede

los 60ºC se reduce la actividad de las poblaciones microbianas, es por esta razón que se

recomienda que la temperatura máxima se encuentre entre los 52 y los 60ºC (Liang et al., 2002)

10

Las altas temperaturas alcanzadas durante el proceso de compostaje (especialmente durante la

fase termofílica), así como del proceso, son factores que causan la muerte de los patógenos

aerobios más comunes como Salmonella sp. y Escherichia coli (Turner et al., 2004). Por otra

parte, estudios realizados por Boulter – Bitzer et al 2005, mostraron que en las pilas de compost

que alcanzaron temperaturas mayores a los 55 ° C, los fitopatógenos murieron.

La fase termofílica durante la cual se alcanzan estas altas temperaturas, es fundamental para

lograr la estabilidad y madurez del compost el cual será utilizado para aumentar la actividad

microbiana en el suelo (Boulter – Bitzer et al., 2005).

• Oxígeno

El compostaje aeróbico es el proceso de degradación que ocurre en presencia de oxígeno; es la

forma más rápida para producir un compost de buena calidad. El compostaje aeróbico es

ampliamente aceptado como vía para lograr la estabilización de la materia orgánica proveniente

de los residuos agrícolas y convertirla en un producto que pueda ser usado como abono para el

suelo (Liang et al., 2002). Los mecanismos empleados para llevar a cabo la aireación del

compost pueden ser manuales, utilizando una pala para mover toda la pila de compost, o

mecánicos, utilizando un tractor que realice la homogenización.

• Humedad

El contenido de humedad es una variable ambiental de suma importancia en el compost, teniendo

en cuenta que es el agua la que provee el medio requerido para llevar a cabo el transporte y la

degradación de los nutrientes por parte de los microorganismos para que puedan realizar sus

actividades metabólicas y fisiológicas (Liang et al., 2002). Cuando el porcentaje de humedad

presenta valores muy bajos puede indicar la deshidratación del compost lo que tiene como

consecuencia la disminución de las actividades biológicas y la obtención de un compost inestable

(Bertoldi et al., 1985). Por otra parte, porcentajes de humedad muy altos (mayores al 65%)

pueden generar condiciones anaeróbicas lo cual disminuye la eficiencia del proceso, además de

producir malos olores (Tiquia et al, 1996).

11

La humedad óptima del compostaje se puede situar alrededor del 30 a 55% aunque varía

dependiendo del estado físico y tamaño de las partículas, así como del sistema empleado para

realizar el compostaje. El contenido de humedad ideal para el compostaje debe considerar una

adecuada humedad para las necesidades fisiológicas de los microorganismos y un adecuado flujo

de oxígeno para mantener las condiciones aeróbicas (Avendaño., 2003).

Cuando el porcentaje de humedad en el compost es muy alta, es porque no hay un equilibrio

entre los materiales húmedos (como los vegetales) y el material llenante o seco (como la paja)

(Foru, 2003). En un estudio realizado por Hanajima et al, 2005 donde la humedad del compost

hecho con gallinaza, residuos de champiñones, salvado de arroz y residuos de pollo crudo era del

84%, se agregó cascarilla de arroz para obtener una humedad entre el 50 y 60 %.

• pH

Esta variable es de gran importancia durante el compostaje, ya que está estrechamente

relacionada con las variaciones de la temperatura en el proceso, se ha encontrado que el cambio

de condiciones mesofílicas a termofílicas durante la fase inicial del compostaje, coincide con el

cambio de pH, de ácido (4.5 – 5.1) a alcalino (8 – 9), esto se debe a que cuando la temperatura se

encuentra por debajo de los 40 ° C ( fase mesofílica), se producen ácidos orgánicos como el

lactato y acetato que inicialmente disminuyen el pH del medio. Estos ácidos a su vez son

consumidos por los microorganismos durante la fase termofílica, generando un aumento en el pH

del compost. Para que el desarrollo del compost sea exitoso es necesario que el valor del pH se

encuentre entre 8 y 9 (Sundberg et al, 2004). Aunque según la NTC 5167 de 2004 el valor del

pH para los abonos orgánicos puede estar entre 4 y 9 (ICONTEC, 2004).

Un pH bajo (4.5 – 5.1) durante el proceso de compostaje puede resultar en corrosión, malos

olores, baja descomposición, mala calidad del compost y dificultad para alcanzar altas

temperaturas, apropiadas y requeridas para la sanitización (Sundberg y Jonsson, 2007).

12

• Tamaño de la partícula

La actividad microbiana está relacionada con la facilidad de acceso al sustrato. Las partículas

pequeñas tienen una mayor superficie específica, lo cual facilita el acceso al sustrato. Sin

embargo, las partículas demasiado finas crean poros pequeños restringiendo el paso del oxígeno

y por ende causando condiciones de anaerobiosis (Cooperband, 2000).

2.2.2 Características fisicoquímicas del compost

De acuerdo a la Norma Técnica Colombiana ICONTEC 5167 de 2004, el producto obtenido a

partir del proceso del compostaje de residuos de lechuga y cascarilla de arroz será un abono

orgánico, ya que como es definido en la norma, se trata de un producto sólido obtenido a partir

de la estabilización de residuos de vegetales que contiene porcentajes mínimos de materia

orgánica. Los parámetros a caracterizar en el abono orgánico como producto final de acuerdo a la

legislación colombiana se muestran en la tabla 3.

Tabla 3. Parámetros a caracterizar en el abono según la NTC 5167 de 2004

PARÁMETRO A CARACTERIZAR VALOR PERMITIDO

Contenido de cenizas Máximo 60 %

Contenido de humedad Máximo 35%

Contenido de carbono orgánico oxidable total Mínimo 15%

Nitrógeno, P2O5 y K2O Se declaran si cada uno es mayor al 1%

Relación carbono /nitrógeno Reportar

Capacidad de retención de humedad Mínimo su propio peso

Capacidad de intercambio catiónico Mínimo 30 cmol(+) Kg-1 (meq/100g)

pH Mayor a 4 y menor a 9

Densidad Máximo 0.6 g/cm 3

Materia prima del que procede Lechuga y cascarilla de arroz

Fuente: INCONTEC, 2004.

13

2.2.3 Calidad del compost

La calidad del compost está relacionada con su valor agronómico y comercial como un

acondicionador orgánico del suelo (Kapanen et al., 2001). En la tabla 4 se muestran algunos de

los parámetros que permiten determinar la calidad del compost.

Tabla 4. Parámetros que permiten determinar la calidad del compost.

Parámetro Rango

Estabilidad Puede determinarse por la tasa de toma de oxígeno, tasa de producción de CO2, o por la liberación de calor como resultado de la actividad de los microorganismos.

Porcentaje de materia orgánica entre el 35 y 40%, temperatura estable (10 a 20 °C), color marrón oscuro – negro, olor a tierra (no desagradable), relación C/N menor a 20, DQO menor a 7mg/g de peso seco, cantidad de polisacáridos menor a 30 – 50 mg glúcidos/g de peso seco, reducción de azúcares del 35%, ausencia de nemátodos y un incremento en la actividad de las enzimas hidrosolubles hasta observar la estabilidad (Bioagro, 2007 <online>).

Fitotoxicidad y compuestos inhibidores La lechuga es empleada como indicador biológico, de la presencia de compuestos tóxicos o inhibidores del crecimiento de las plantas.

Conductividad y contenido de nutrientes La conductividad debe ser monitoreada. Niveles inferiores a 3.5 mS/cm son necesarios en el compost aplicado.

La relación C/N debe estar entre 15 – 25.

pH Debe estar entre 5.5 y 8.0, un pH mayor puede indicar un alto contenido de calcio.

Tamaño de la partícula Depende del uso

Contenido de contaminantes El contenido de metales pesados o contaminantes orgánicos son regulados por normas nacionales

Fuente: Saebo et al, 2006.

14

2.2.3.1 Materia orgánica

La materia orgánica del suelo es el conjunto de residuos vegetales y animales de todas las clases,

más o menos descompuestos y transformados por la acción de los microorganismos. (Schjonning

et al., 2007):

La evolución de la materia orgánica en el suelo depende de factores tales como el clima

(temperatura y humedad), el tipo de suelo (textura, estructura, roca madre), la clase de residuos

más o menos fáciles de degradar y el tipo de microorganismos que intervienen en su

transformación (Schjonning et al., 2007).

En los suelos agrícolas, la materia orgánica procede prácticamente de los residuos de las

cosechas, aportes de estiércol o abonos orgánicos. La mayor parte de estos aportes (60-70%)

desaparece en una fase de mineralización activa que puede durar 2 años. El resto queda como

humus el cual se mineraliza lentamente en proporciones que varían según las condiciones del

clima y suelo (Schjonning et al., 2007).

Aumentando el contenido de carbono orgánico en el suelo, se realza la calidad del suelo, se

reduce la erosión, se mejora la calidad del agua, se aumenta la biomasa y la productividad

agronómica, además de mejorar la calidad ambiental por la adsorción de contaminantes de los

cuerpos de agua y se reduce la concentración atmosférica de dióxido de carbono (Pedra et al.,

2006). También, al añadir materia orgánica al suelo se estimula la población microbiana presente

y su actividad biológica (Brady & Weil, 1999).

Las sustancias húmicas que se encuentran en el medio natural son provenientes de residuos

orgánicos en degradación, unidos a los productos generados por los microorganismos propios de

la materia orgánica (Ayuso, 1995). Esta composición no es estable, por el contrario es bastante

dinámica, por lo que se habla más de un estado de la materia orgánica, en vez de referirse a

compuestos estables.

15

Para realizar un seguimiento del proceso de humificación, es indispensable la extracción de

sustancias húmicas formadas a partir de la degradación de la materia orgánica, ya sea en el suelo

o en compost. Con este objetivo, se han desarrollando métodos químicos que permiten extraer

una fracción de las sustancias húmicas haciendo uso de reactivos alcalinos, utilizando

preferiblemente la extracción directa con NaOH 0,1M, para luego realizar una cromatografía

fraccionada (Qualls et al., 2003).

Otras técnicas analíticas más modernas para la detección de ácidos húmicos y fúlvicos (presentes

en el humus), se fundamentan en una extracción inicial de dichas sustancias para su posterior

detección con polivinilo (Olk et al., 2000).

Existen otros métodos más sencillos como el de espectrofotometría de fluorescencia que logra

hacer la determinación de las mismas sustancias en solución acuosa, al igual que las

evaluaciones colorimétricas que hacen uso de diferentes reactivos. (Olk et al., 2000)

También se conocen metodologías más específicas que se realizan para determinar la

composición química de las sustancias húmicas. Para ello se emplean análisis cromatográficos,

espectroscopía infrarroja y densidad óptica, el RMN 13C, la resonancia del espín electrónico, la

pirólisis-espectrofotometría de masas y la extracción de gases súper crítica (Schnitzer et al.,

1995).

El método más utilizado y el que se empleará en el estudio, para la determinación de materia

orgánica total es el propuesto por Walkley y Black (1934) que se fundamenta en la oxidación de

la materia orgánica por el contacto con un oxidante fuerte como el dicromato (Cr2O7) en

presencia de ácido sulfúrico (H2SO4). El exceso del oxidante se cuantifica empleando una

solución de sal de Mohr (Sal ferrosa FeSO4 7H2O), y se emplean dos indicadores, la difenilamina

y el ácido fosfórico (H3PO4) que favorecen la unión del agente oxidante con la materia orgánica,

permitiendo determinar la cantidad de materia orgánica presente.

16

2.2.3.2. Enzimas en procesos de compost

Las enzimas son proteínas que funcionan como catalizadores biológicos que aumentan la

velocidad o rapidez de una reacción química, sin que ella cambie su estructura en el proceso

global. La sustancia sobre la cual actúa una enzima se denomina sustrato (Mathews et al., 2002).

Las enzimas pueden ser excretadas de la célula (extracelulares), que son liberadas por el

metabolismo o incluso por muerte celular, o pueden estar a nivel intracelular (Kalil et al., 2007).

Las amilasas tienen como sitio de acción los enlaces glicosídicos α 1-4 y α 1-6 del almidón.

Durante la degradación del almidón actúan diferentes enzimas como la α-amilasa que hidroliza

los enlaces α 1-4 de la amilosa. Las β amilasas, por su parte, actúan sobre los extremos no

reductores de la amilosa y la amilopectina, hidrolizando los enlaces glicosídicos alternantes. La

pululanasa o isoamilasa hidroliza los enlaces α-1-6 glicosídicos, liberando las ramificaciones de

la amilopectina. Durante el proceso de degradación del almidón se generan moléculas de

maltosa, que son hidrolizadas por la maltasa generando glucosa (Alexander, 1980)

En el compost se puede encontrar una gran variedad de enzimas, dependiendo del material que se

composte. En un estudio realizado por Cayuela et al., 2007 se encontró que en pilas de compost

elaboradas a partir de los lodos residuales de la extracción del aceite de oliva enzimas como la β-

glucosidasa, fosfatasa alcalina, ureasa, fosfatasa ácida y arilsulfatasa. Por otra parte, en un

estudio realizado por Mayende et al., 2006 se obtuvieron celulasas y polifenol oxidasas

producidas por Bacillus spp. encontrado en un compost elaborado con desechos de jardín; y

Peláez et al., se encontraron fosfatasas, invertasas, amilasas, proteasas y deshidrogensas en un

compost a base de aserrín y gallinaza.

La actividad enzimática de un inoculante para compost, es usualmente determinada por técnicas

colorimétricas, que miden la cantidad de azúcares reductores presente en una matriz. Dentro de

dichas técnicas la más empleada es la del ácido dinitrosalisílico (DNS), sin embargo, Deng y

Tabatabai (1994), afirman que este método no es lo suficientemente específico ni sensible, luego

de haberlo comparado con otros métodos colorimétricos como Azul de Prusia y Somogyi-

Nelson.

17

Si bien los tres métodos son específicos para determinar azúcares reductores, Deng y Tabatabai

(1994), encontraron que las técnicas de Azul de Prusia y de Somogyi- Nelson, resultaron ser la

más sensibles, logrando detectar 1µg y 5 µg, respectivamente, de azúcares reductores presentes

en la matriz de estudio. Sin embargo, también determinaron que el método de Somogyi- Nelson

era menos susceptible a los interferentes presentes en una matriz como suelo o compost, por lo

cual este método resulta ser el más apropiado dentro las técnicas colorimétricas, para determinar

la actividad enzimática presente en suelo o compost.

18

3. JUSTIFICACIÓN La lechuga es un vegetal que aporta una gran variedad de minerales, aminoácidos y ácidos

orgánicos, además, su alto porcentaje de humedad la convierte en un alimento de pocas calorías,

por lo que cada día aumenta considerablemente la cantidad de consumidores. Por estas razones,

es necesario mantener la demanda de dicho alimento en el mercado, pero esto conlleva un

aumento de los residuos generados en los cultivos, puesto que no todas las lechugas se

desarrollan adecuadamente y no cumplen los estándares de calidad necesarios para ser vendidas.

En los cultivos comerciales de lechuga, los residuos generados contienen un alto porcentaje de

humedad (95%) que hace necesario someterlos a un manejo adecuado para evitar malos olores y

la producción de lixiviados. Una solución a este problema, es utilizar los residuos para realizar

un proceso de compostaje, en el cual por medio de reacciones bioquímicas microbianas en

condiciones controladas, se obtiene abono orgánico que puede ser agregado al suelo y así

mejorar su estructura y propiedades tanto fisicoquímicas como microbiológicas.

Por todo lo anterior, el presente trabajo es de gran importancia ya que se implementará un

sistema de compostaje a partir de residuos de lechuga y además se desarrollará un inoculante

microbiano que aumente la velocidad de dicho proceso, permitiendo que en el cultivo siempre se

pueda disponer de abono de buena calidad. De esta forma los residuos representarán una

ganancia económica para el cultivo y para el medio ambiente.

De igual manera el proceso de compostaje se seguirá desde la actividad enzimática (amilolítica),

y del proceso de humificación de la materia orgánica presente en el compost, que servirán como

indicadores no directos de la eficiencia del proceso de compostaje.

19

4. OBJETIVOS

4.1. Objetivo general

• Producir y evaluar un inoculante microbiano con capacidad amilolítica, acelerador del

proceso de compostaje, a partir de residuos de lechuga.

4.2. Objetivos específicos

• Aislar y caracterizar microorganismos con actividad amilolítica, a partir del compostaje

de residuos de lechuga.

• Determinar cualitativa y cuantitativamente la actividad amilolítica de los

microorganismos aislados, y producir un inoculante mixto acelerador del proceso de

compostaje.

• Preparar pilas de compostaje utilizando cascarilla de arroz como material llenante y poda

de pasto kikuyo para incrementar la relación C/N.

• Evaluar dos métodos de extracción de amilasas a partir de muestras de compost.

• Realizar seguimiento del proceso mediante la cuantificación de la actividad amilolítica y

materia orgánica.

20

5. METODOLOGIA

El estudio se realizó en el laboratorio de Microbiología Ambiental y de Suelos de la Pontificia

Universidad Javeriana, y en su fase de campo en la “Hacienda Villa Amparo”, Funza –

Cundinamarca.

5.1.Recolección de las muestras

5.1.1. Sitio de Muestreo

El sitio de estudio comprendió la zona de compostaje de la “Hacienda Villa Amparo”, ubicada en

Funza- Cundinamarca, que cuenta con un área de 150 m2 y una capacidad para diez pilas de

compostaje.

5.1.2. Recolección de las muestras

De tres pilas de compost de 2 m de largo por 1.2 m de ancho y 1.2 m de alto, con una

temperatura promedio de 41ºC, se tomaron 5 muestras compuestas de 150 g por cada pila. Para

realizar el muestreo aleatorio simple, las pilas fueron divididas transversalmente en tres partes

(anterior, media y posterior) y las muestras fueron tomadas desde el interior de las pilas en cada

una de las secciones mencionadas. Las muestras se depositaron en bolsas de papel y estas a su

vez en bolsas plásticas autosellables rotuladas previamente, para su posterior transporte al

Laboratorio de Microbiología Ambiental y Suelos, en donde fueron procesadas.

5.2. Procesamiento de muestras

5.2.1. Fase I: Caracterización del proceso de compostaje

Durante esta fase, se le hizo seguimiento a dos pilas de compost, a las que se les evaluaron

parámetros como temperatura con ayuda de un termómetro de punzón, pH y tiempo de duración

21

del proceso. Las pilas fueron identificadas como pilas 1 y 2, diferían en los tipos de lechuga que

poseían y también en el contenido de poda, puesto que la 2 no fue cubierta con esta.

Adicionalmente, a la pila 2 se le evaluaron otros parámetros como contenido de materia

orgánica, actividad amilolítica y biomasa de microorganismos amilolíticos en el Laboratorio de

Microbiología Ambiental y de Suelos; todo esto con el fin de caracterizar el proceso de

degradación que sufren las materias primas en dicho proceso. Para esta primera fase, los

muestreos se realizaron una vez por semana, hasta que la temperatura descendió a condición

ambiental. Posteriormente se realizaron análisis fisicoquímicos de la pila 2, que incluyeron % de

humedad, pH, C/N y composición nutricional. Se tomaron muestras en tiempo cero y al terminar

el proceso de degradación, que fueron analizadas en los laboratorios Agrilab y CIAA.

5.2.1.1.Temperatura y pH

La temperatura fue tomada una vez a la semana en cinco puntos diferentes de la pila, empleando

un termómetro de punzón. Se introdujo el termómetro en la pila hasta lograr que la punta

quedara en la parte central de la misma y se hizo la lectura una vez la aguja del termómetro

permanecía en el mismo valor (Coyne et al., 1999)

Para la medición de pH, se tomaron 25 g de muestra y se mezclaron con 25 mL de agua

desionizada. Se dejaron en reposo por una hora y luego se empleó un pHmetro para hacer la

medición (ICONTEC, 2004).

5.2.1.2. Actividad amilolítica del compost

5.2.1.3. Evaluación de dos métodos para la extracción de amilasas

Se evaluaron dos métodos de extracción de amilasas, uno con buffer citrato fosfato (Badiane et

al., 2007) y otro con el buffer Sorensen (Sharada y Sanjat, 2004). En los dos casos, inicialmente

se tomaron tres muestras de compost de las partes anterior, media y posterior de las pilas, para

22

así completar un total de nueve muestras por pila y a cada una de ellas se les realizó extracción

enzimática y posterior cuantificación de azúcares reductores por el método de Somogyi- Nelson.

Para el primer método, se tomaron 1.5 g de compost que fueron depositados en un tubo plástico

de centrifuga de 50 mL, posteriormente se le añadieron 3 mL de tolueno, 3 mL de buffer

Sorensen (Anexo 1) y 3 mL de solución almidón al 1% (p/v). Esta mezcla fue incubada por 24

horas a 55 ºC (Sharada y Sanjat, 2004).

Para el segundo método se tomaron 0.3 g de compost en un tubo plástico de centrífuga de 50 mL

y se le agregaron 2.5 mL de buffer Citrato- Fosfato (Anexo 1) y 2.5 mL de solución de almidón

al 1% (p/v). Se incubó a 55 ºC durante cuatro horas (Badiane et al., 2001).

Una vez finalizado el periodo de incubación, se procedió a centrifugar los tubos a 8000 r.p.m por

20 minutos y a una temperatura de 4 ºC. Posterior a la centrifugación, se hizo una filtración por

gravedad, empleando papel filtro, con el fin de separar partículas suspendidas en la fracción

líquida de interés (Gutiérrez et al., 2007).

5.2.1.4. Cuantificación de azúcares reductores en muestras de compost, mediante la técnica

de Somogyi- Nelson

Luego de realizar la extracción de amilasas por los dos métodos, se procedió a cuantificar los

azúcares reductores presentes en los tubos de centrífuga como consecuencia de la actividad

enzimática. Para ello se empleó la fase acuosa recuperada luego de la filtración por gravedad. A

partir de dicha fase, se tomaron 200 µL, los cuales fueron mezclados con 200 µL y 50 µL de los

reactivos de Somogyi I y Somogyi II respectivamente. La mezcla fue homogenizada con la

ayuda de un vortex, para luego introducirla en un baño termostatado a 90ºC durante 20 minutos,

transcurrido este tiempo, se introdujeron los tubos en un recipiente con agua fría por 10 minutos.

Luego se homogenizaron nuevamente con la ayuda del vortex y se les adicionó a cada uno 250

µL de reactivo de Nelson y 700 µL de agua desionizada. El blanco fue preparado de la misma

forma, pero se tomaron 200 µL de agua desionizada en vez de fase acuosa (Deng y Tabatabai,

1994; Gutiérrez et al., 2007).

23

Debido a la alta concentración de azúcares reductores de algunas muestras, fue necesario realizar

diluciones. Para ello se utilizó agua desionizada, haciendo la adición de la misma antes de

adicionar los reactivos.

La lectura se llevó acabo 24 horas después de realizada la técnica, en espectrofotómetro Genesys

UV/ Vis a una longitud de onda de 595 nm (Deng y Tabatabai, 1994; Gutiérrez et al., 2007;

Badiane et al., 2001)

5.2.1.5. Cuantificación de la biomasa amilolítica presente en el compost

Se tomó una cantidad cercana a 10 g exactamente medida de la muestra que se adicionaron a

90mL de agua peptonada al 0.1% (p/v), posteriormente se agitó la muestra a 120 r.p.m. por 5

minutos. Luego se efectuaron diluciones seriadas en base 10 por triplicado, en tubos de vidrio de

13*100 cada uno con 4.5 mL de agua peptonada 0.1% (p/v), a los cuales se les agregó 0.5 mL de

muestra a diluir. Posteriormente, se sembraron cada una de las diluciones en agar almidón 1%

(p/v) (Anexo 2) (Ayala et al., 2001).

5.2.1.6. Determinación de materia orgánica

En la fase I se realizó la determinación de la materia orgánica total (MOT) y carbono orgánico

total (COT) por vía húmeda utilizando el método descrito por Walkley y Black (1934). Para ello

se pesaron 10,000 g de compost de cada parte de la pila (anterior, media y posterior) en una

bandeja previamente tarada a 105 ºC, y se llevaron a la mufla cuya temperatura era también de

105 °C durante 2 horas (Swift, 1996). Pasado este tiempo se volvió a pesar la muestra con el fin

de determinar su porcentaje de humedad empleando la ecuación 1:

24

Luego, de la muestra seca se tomaron 50 mg en un beaker, se agregaron 10 mL de ácido

sulfúrico y 5 mL de dicromato de potasio y se llevó a la mufla a 150 °C por 15 minutos, después

se dejó enfriar y se transfirió todo el contenido del beaker a un balón aforado de 50 mL

completando a volumen con agua destilada. El balón se agitó para homogenizar la muestra, luego

se tomaron 10 mL y se añadieron a un erlenmeyer de 100 mL. Se agregaron 4 gotas de

difenilamina y 2 gotas de ácido fosfórico para titular la muestra con sal ferrosa al 0.022N (Anexo

2) hasta que se observó un viraje de color de azul – violeta a verde esmeralda. Finalmente se

determinó el porcentaje de MOT y COT por medio de las ecuaciones 2, 3 y 4:

% MOT= % COT x 1.724 (4)

Fuente: Kalil et al., 2007

5.2.2. Producción del inoculante mixto

5.2.2.1. Aislamiento primario de cepas amilolíticas (Priest y Ramos, 1994)

Se tomaron 10,000g de cada una de las muestras recogidas y se adicionaron a 90 mL de agua

peptonada al 0.1% (p/v), luego, a partir de esta mezcla se realizaron diluciones seriadas de 10-1 a

10-12.

25

Posteriormente se sembraron cada una de las diluciones en superficie y por triplicado en agar

almidón al 1% (p/v) (Anexo 2) y se incubaron a 55 ºC durante 48 horas.

Una vez finalizado el periodo de incubación, se determinó cualitativamente la actividad

amilolítica, adicionando tres gotas de lugol sobre la caja. Los microorganismos con actividad

amilolítica fueron identificados por la aparición de halos de hidrólisis alrededor de las colonias,

luego de la adición del lugol.

Luego de identificar las colonias con actividad amilolítica, se les realizó coloración de Gram a

cada una de ellas, con el fin de observar sus características microscópicas. De igual forma se

hicieron observaciones para determinar las características macroscópicas de cada colonia.

5.2.2.2 Aislamiento secundario y selección

Con el fin de obtener microorganismos puros con capacidad amilolítica, se hicieron por

triplicado, repiques en agar almidón al 1% (p/v) de cada una de las colonias identificadas como

amilolíticas en el aislamiento primario, manteniendo las condiciones de incubación y

comprobación de la actividad amilolítica descritas anteriormente.

Una vez puras, se procedió a medir el halo de hidrólisis generado por cada una de las cepas

aisladas. Esto se hizo por triplicado para sacar una medida promedio del halo.

5.2.3. Conservación de Cepas

Para la conservación de los microorganismos aislados, se utilizó la técnica de criopreservación

en glicerol al 30% (v/v) (Poutou et al., 1994). Para ello, se tomaron colonias del aislamiento

secundario y se mezclaron con solución salina al 0.85% (p/v) hasta alcanzar la turbidez del tubo

número 2 de la escala nefelométrica de Mc Farland.

26

Una vez alcanzada esta concentración, se inocularon 5 mL de la suspensión celular en 50 mL de

caldo almidón al 1% (p/v), el cual se llevó a incubar a 55 ºC en agitación constante a 120 r.p.m.

durante 12 horas, hasta lograr una concentración celular de 105 y 106 (Alfaro et al., 2001)

Para los microorganismos que mostraron una microscopía filamentosa, no se empleó el patrón de

Mc Farland, sino que se hizo un raspado de toda la caja, para inocularlo directamente en el caldo.

Luego de alcanzar la concentración celular anterior, se adicionaron 50 mL de caldo almidón con

glicerol al 60% (v/v), para así obtener una concentración final de 30% (v/v) de glicerol. De esta

mezcla se tomaron volúmenes de 1 mL para depositarlos en tubos eppendorf estériles (Poutou et

al., 1994).

Posteriormente se tomaron 5 tubos de manera aleatoria para sembrarlos en agar almidón al 1%

(p/v) y comprobar pureza y viabilidad.

5.2.4. Selección de cepas por antagonismo

Se tomó un vial del banco, por cada una de las cepas y se reconstituyeron en caldo almidón al

1% (p/v), se incubó por 12 horas a 55 ºC y en agitación constante a 120 r.p.m. La concentración

celular final fue comprobada luego de hacer recuento en placa en agar almidón al 1% (p/v).

Luego de comprobar que la concentración celular de todos los microorganismos fuera la misma

(106 UFC/mL), se realizaron pruebas de antagonismo por triplicado siguiendo la técnica descrita

por Gauze (1965) en la cual, el efecto antagónico se determina midiendo los halos de inhibición.

Para ello, se sembraron masivamente cada uno de los microorganismos a evaluar, en agar

almidón al 1% (p/v), y fueron enfrentados con los otros microorganismos que se habían

dispuesto en sensidiscos de papel filtro estéril con un volumen de 20 µL de suspensión celular

para cada uno de ellos (Alfaro et al., 2001).

27

5.2.5. Curvas de Crecimiento

Como parámetros de crecimiento de los microorganismos, se evaluaron la producción de

biomasa, por medio del recuento en placa en agar almidón 1% (p/v), así como la actividad

amilolítica, luego de efectuar una extracción de amilasas y medir la cantidad de azúcares

reductores presentes en la matriz por el método Somogyi- Nelson para la cual se utilizó la

ecuación (Y= 0.1133 X+ 0.0049, R2 = 0.998) obtenida a partir de la curva de calibración (Anexo

3). Posteriormente, se cuantificaron las unidades amilolíticas (UA), definidas como la cantidad

de enzima capaz de liberar 1µg de azúcares reductores/mL*h.

Se tomaron tres viales del banco para su recuperación y verificación de pureza, en agar almidón

al 1% (p/v). Luego de verificar pureza y recuento de colonias, se elaboró el pre- inóculo.

5.2.5.1. Elaboración del pre- inóculo (Wind et al., 1994)

Para cada microorganismo se prepararon dos pre- inóculos relación 1/2, en erlenmeyers de

500mL, con 127 mL de caldo almidón al 1% (p/v), cada uno. A estos se les adicionó el contenido

de tres viales. Se tomó como tiempo cero el momento de la adición de los microorganismos,

momento en el cual se determinó la actividad amilolítica.

Para la cuantificación de la biomasa, se realizaron diluciones seriadas en base 10. Para ello se

emplearon tubos khan, cada uno con 2.7 mL de agua peptonada, a los que se les adicionó 300 µL

de muestra a diluir. Para homogenizar la mezcla, se utilizó un agitador vortex, y luego de estar

homogéneas, se sembró en superficie 1 mL de las diferentes diluciones en agar almidón 1% (p/v)

para hacer el recuento. Las cajas fueron incubadas a 55 ºC durante 24 horas (Wind et al., 1994).

Adicionalmente, para los microorganismos no filamentosos, se realizaron lecturas de absorbancia

teniendo como blanco caldo almidón al 1% (p/v) estéril, con el fin de identificar rápidamente el

ingreso a la fase exponencial por parte de los microorganismos.

28

Para la extracción de amilasas, se tomaron 3mL del caldo de fermentación que fueron

centrifugados a 10 000 r.p.m. durante 20 minutos. Luego, se tomó 1 mL del sobrenadante, el

cual fue mezclado con 1 mL de buffer almidón al 1% (p/v) diluido en buffer fosfato 1M. Esta

mezcla fue llevada a incubar a 55 ºC durante una hora, luego se frenó la reacción introduciendo

los tubos en hielo y se dejaron allí por cinco minutos. Una vez frenada la reacción, se hizo otra

centrifugación a 10 000 r.p.m. durante 20 minutos. Se tomaron 200 µL del sobrenadante para

desarrollar el protocolo de Somogyi- Nelson descrito anteriormente, haciendo diluciones con

agua desionizada.

Los parámetros mencionados se evaluaron cada dos horas y una vez se evidenció el ingreso a la

fase exponencial de cada uno de los microorganismos, se transfirió una alícuota de 50 mL a los

erlenmeyers en donde se realizó la fermentación discontinua.

5.2.5.2. Fermentación Discontinua

Luego de identificar la fase exponencial de cada uno de los microorganismos en sus respectivos

pre-inóculos, en un erlenemyer de 1 L con 450 mL de caldo almidón al 1% (p/v) se transfirieron

50 mL de cada pre-inóculo, para completar un volumen efectivo de trabajo (VET) de 500 mL.

Cada fermentación se llevó a cabo por duplicado, se continuó midiendo actividad amilolítica y

biomasa, cada dos horas, hasta observar un descenso en la actividad amilolítica (Ayala et al.,

2001).

5.2.6. Curva de crecimiento del Inoculante mixto

Se hicieron pre- inóculos de cada uno de los microorganismos de la misma forma explicada

anteriormente y se dejaron incubando a 55ºC hasta que cada uno alcanzara una biomasa de 106

UFC/mL. Luego de tener todos los microorganismos en la misma concentración, en un

erlenmeyer de 1 L con 450 mL de caldo almidón 1% (p/v), se adicionaron 10 ml de cada uno de

los pre-inóculos, para completar un VET de 500 mL. Adicionalmente, se utilizó un sistema de

aireación, compuesto por mangueras de plástico unidas a un motor eléctrico que emitía el aire

suministrado al caldo, para incrementar la velocidad de crecimiento.

29

La fermentación se hizo por duplicado y se evaluaron los mismos parámetros (actividad

amilolítica y biomasa por recuento en placa) cada dos horas.

5.2.7. Producción del Inoculante mixto

Se llevó a cabo la fermentación discontinua bajo las mismas condiciones de operación descritas

en el numeral 5.2.6, en 10 erlenmeyers de 1 L para completar un volumen de inoculante mixto

final de 5 L. Se incubaron a 55 ºC por 24 horas, tiempo en que la biomasa era superior a 1026

UFC/mL.

Una vez finalizada la fermentación, se reenvasó todo el contenido de los 10 erlenmeyers en un

recipiente con capacidad de 5 L estéril y se mantuvo a -5 ºC por 24 horas hasta el día de su

aplicación.

5.3. Fase II: Evaluación del Inoculante Mixto en campo

Para hacer la evaluación en campo del inoculante, se hizo el montaje simultáneo de dos pilas de

compost exactamente iguales en composición y dimensiones. Cada pila contenía 500 kg de

lechuga, 226.5 Kg de cascarilla de arroz, 56.62 Kg de poda y 7 L de agua- melaza (Anexo 2) y

sus dimensiones fueron 2 m de largo por 1.2 m de ancho por 1.2 m de alto.

La pila sin inoculante fue denominada pila control y la otra fue inoculada con 5 L de inoculante

mixto sin diluir y fue denominada pila con inoculante.

5.3.1. Variables evaluadas

Las variables evaluadas fueron actividad amilolítica, biomasa, materia orgánica, pH y

temperatura. Todos los parámetros se evaluaron de la misma forma descrita en la fase I, aunque

los muestreos y mediciones se hicieron diariamente y no semanalmente, a excepción de la

biomasa, que fue determinada cada tercer día.

30

Durante la fase de evaluación del inoculante en las pilas, no se hicieron determinaciones de

actividad amilolítica para cada una de las partes de la pila, puesto que en la fase I no se

encontraron diferencias significativas en los valores de la actividad amilolítica hallada en cada

una de ellas, razón por la cual, en la fase II se tomaron las muestras de las diferentes secciones de

la pila y se hizo un pool con ellas, para determinarle la actividad amilolítica.

5.3.1.1. Determinación de la materia orgánica (IHSS, 1996)

En la fase II se decidió cambiar el método para la determinación de la materia orgánica, ya que

se encontró que por vía seca (calcinación) también se podían analizar las muestras de compost.

Antes de hacer el cambio definitivo de determinación por vía húmeda a vía seca, se tomó la

muestra del primer día del proceso y se determinó el porcentaje de MOT por los dos métodos.

Para llevar a cabo la determinación de la materia orgánica por vía seca se pesaron 10 g de

compost (a partir de un pool que reunía fracciones de toda la pila a analizar) y se secaron a

105°C durante 2 horas. Luego, se tomaron 1,500 g de muestra seca y molida depositándolas en

una bandeja de aluminio previamente tarada.

Se precalcinó la muestra a una temperatura baja, manteniéndola directamente en la mufla hasta

que dejó de humear. Luego se realizó la calcinación, con la mufla a 550 °C e introduciendo la

muestra por 5 horas. Pasado el tiempo, se transfirió el conjunto a un desecador y unas vez frías se

retiraron las bandejas con el fin de pesarlas nuevamente.

Finalmente se realizaron los cálculos aplicando las ecuaciones 5 y 6:

A: peso de la bandeja (g)

B: A + peso de la muestra seca (g)

C: A + peso de la muestra calcinada

100)()(% x

ABCBMOT

−−

= (5) %COT= %MOT / 1.72 (6)

31

5.3.1.2.Caracterización microbiológica del compost Se tomaron muestras de 30,000 g de compost, al inicio y al final del proceso, tanto para el

tratamiento como para el control. Dichas muestras, fueron enviadas al Centro de Servicios de la

Pontificia Universidad Javeriana, para la determinación de patógenos humanos como Salmonella

sp. y Escherichia coli.

5.4. Análisis de la información

Con el fin de determinar el grado de correlación entre la actividad amilolítica y la biomasa de

microorganismos amilolíticos presentes en las pilas tratamiento y control, se aplicó un test de

correlación, para el cual se plantearon las siguientes hipótesis:

Ho: No existe una relación directamente proporcional entre la biomasa amilolítica y la

actividad amilolítica presentes en las pilas control y tratamiento.

Hi: Existe una relación directamente proporcional entre la biomasa amilolítica y la

actividad amilolítica presentes en las pilas control y tratamiento.

Adicionalmente, se aplicó un t- student test, para determinar diferencias significativas entre los

métodos de extracción enzimática empleados en las pilas tratamiento y control:

Ho: No existen diferencias estadísticamente significativas entre los dos métodos de

extracción enzimática utilizados para extraer amilasas.

Hi: Existen diferencias estadísticamente significativas entre los dos métodos de

extracción enzimática utilizados para extraer amilasas.

Una vez determinado el mejor método de extracción enzimática, se empleó un test Chi cuadrado

para evidenciar diferencias significativas en la actividad amilolítica presente en el tratamiento y

control:

32

Ho: No existen diferencias estadísticamente significativas entre las actividades

amilolíticas cuantificadas para las pilas tratamiento y control.

Hi: Existen diferencias estadísticamente significativas entre las actividades amilolíticas

cuantificadas para las pilas tratamiento y control.

De igual forma, se aplicaron los test Kruskal Wallis y Chi cuadrado, para determinar diferencias

significativas entre la actividad amilolítica presente en los tratamientos empleados y el tiempo:

Ho: No existen diferencias estadísticamente significativas en la actividad amilolítica

presente en cada uno de los tratamientos a través del tiempo.

Hi: Existen diferencias estadísticamente significativas en la actividad amilolítica en cada

uno de los tratamientos a través del tiempo.

Posteriormente, con el objetivo de estimar diferencias en el contenido de materia orgánica

presente en el tratamiento y control, se aplicó un test t- student y se formularon las hipótesis

pertinentes:

Ho: No existen diferencias estadísticamente significativas en el contenido de materia

orgánica entre las pilas tratamiento y control.

Hi: Existen diferencias estadísticamente significativas en el contenido de materia

orgánica entre las pilas tratamiento y control.

Adicionalmente, se aplico el test Kruskal Wallis para determinar diferencias significativas entre

el contenido de materia orgánica en los tratamientos empleados y el tiempo:

Ho: No existen diferencias estadísticamente significativas en el porcentaje de materia

orgánica presente en cada uno de los tratamientos, a través del tiempo.

33

Hi: Existen diferencias estadísticamente significativas en el porcentaje de materia

orgánica presente en cada uno de los tratamientos, a través del tiempo.

Finalmente se aplicó un test t-student para determinar diferencias significativas entre los

tratamientos, de acuerdo a los parámetros de temperatura y pH, con relación al tiempo.

Ho: No existen diferencias estadísticamente significativas entre temperaturas y pH en los

tratamientos evaluados.

Hi: Existen diferencias estadísticamente significativas entre temperaturas y pH en los

tratamientos evaluados.

34

6. RESULTADOS Y DISCUSION

6.1. Fase I: Caracterización del proceso de Compostaje

6.1.1. Temperatura y pH

Al hacer el seguimiento de estas pilas preliminares, se buscaba conocer el tiempo de duración del

proceso de compostaje y observar parámetros como la temperatura y pH. La pila 1, fue la

primera en montarse, como parte de un sistema para organizar el material residual desarrollado

en diferentes etapas; presentó un exceso de humedad (80%) que condujo a procesos anaerobios y

por tanto mal olor, por esta razón sólo se hizo seguimiento de temperatura y pH.

La pila 2 fue organizada de la misma forma que la 1, excepto por la cubierta de poda que la

primera tenía y debido a que presentó una humedad inicial de 60%, a partir de esta pila se

determinaron la actividad amilolítica y el contenido de MOT y COT, además del seguimiento

que se hizo de la temperatura y el pH.

El ciclo completo de compostaje para las pilas 1 y 2 tuvo una duración de 5 semanas, tiempo en

el que las temperaturas más altas registradas fueron 44 ºC y 41 ºC respectivamente (Fig. 1). Si

bien el tiempo de duración del proceso, es bastante bueno comparado con otros reportados para

materiales similares como residuos de cocina y desechos de la jardinería, que pueden durar hasta

120 días (Adani et al., 2007), las temperaturas máximas no son lo suficientemente altas ni

duraderas para eliminar microorganismos patógenos. Nobel y Roberts (2004) afirman que para

eliminar microorganismos patógenos en compost, en general se requieren temperaturas

superiores a 40 ºC y que se mantenga por una semana como mínimo.

35

Fig. 1. Comportamiento de la temperatura en las Pilas de compostaje 1 y 2

Fig. 2. Comportamiento del pH de las Pilas de compost 1 y 2

Contrario a lo propuesto por Nobel y Roberts (2004), en campo se observó en términos generales

que en ninguno de los casos, se conserva la máxima temperatura por dos semanas. Este hecho

condujo a la suposición de que el proceso se realizaba mucho más rápido y que las mediciones

de este tipo debían hacerse en intervalos de días en vez de semanas.

Las variaciones en las temperaturas de las dos pilas se deben probablemente a los cambios de

temperatura ambiental, que tuvieron incidencia en las pilas, por el hecho de no existir paredes

que ayudaran a conservarla. Debido a esto, las pilas estuvieron muy expuestas a cambios

climáticos, que pudieron afectar la circulación del calor en ellas. Para el caso de la pila 2 que no

tenía cubierta de poda, la gráfica expresa muy bien la incapacidad de la pila para retener el calor,

mientras que la pila 1 logró retener un poco más, aunque no lo suficiente para mantener la misma

temperatura o incluso aumentarla. Por otro lado se puede argumentar respecto a la velocidad de

36

degradación, que pudo haber mantenido la temperatura por días consecutivos, en los cuales no se

efectuaron lecturas.

Las desviaciones estándar mostradas en la grafica 1 muestran también, que la temperatura no fue

la misma en los diferentes puntos de la pila, pero los valores no fueron muy disímiles,

evidenciando así una buena transferencia de calor dentro de la pila.

La pila 1 contenía residuos bastante degradados, razón por la cual el pH inicial fue ligeramente

ácido, comparado con el de la pila 2 (Fig. 2). La disminución en el pH de la pila 2 se debe a la

producción de sustancias ácidas, que son productos intermediarios de la degradación de la

materia orgánica, sin embargo, el pH incrementa nuevamente debido a la estabilización del

compost, etapa en la cual el pH se acerca a la neutralidad, luego de que los microorganismos

consumen los ácidos producidos y a la vez realizan procesos de amonificación (Beck- Friis et al.,

2003; Ayala et al., 2001).

La pila 2, a su vez reporta un incremento del pH durante la primera semana, que puede deberse a

una elevada tasa de amonificación causada por la relación C/N inicial (13.99 m/m), que según

Kirchmann y Witter (1989), al ser baja (< 20) aumenta la liberación del nitrógeno en forma de

NH3. Sin embargo, a partir de la semana 1 el pH desciende, a causa de la presencia de ácidos

orgánicos simples como el acético y el láctico, que se forman durante la degradación del material

orgánico; seguido de un nuevo ascenso en el pH, generado por el consumo de dichos ácidos por

parte de los microorganismos presentes en el material en descomposición (Sundberg, 2005).

Tanto el compost obtenido en la pila 1 como en la pila 2 reportaron valores finales de pH

aceptados por la norma 5167 de 2004, cuyo rango es entre 5 y 8.

6.1.2. Seguimiento de la Actividad Amilolítica y Biomasa de microorganismos amilolíticos

en la Pila 2

Por otra parte, se determinó la actividad amilolítica presente en la pila de compost 2 (Fig.3),

parámetro que fue correlacionado con la biomasa de microorganismos amilolíticos presentes en

37

la matriz de estudio (Fig. 4). Las unidades amilolíticas (UA) se definen como la cantidad de

enzima capaz de liberar 1 µg de azúcares reductores/ g de suelo* h (Sharada y Sanjat, 2004).

De acuerdo con Sharada y Sanjat (2004), los valores obtenidos para la actividad amilolítica en la

pila 2 resultaron muy bajos (< 4.22 UA con buffer Sorensen), comparados con el mínimo dato

reportado por dichos autores que fue de 8.4 UA. Pese a esto, el comportamiento descrito por la

pila, fue acelerado y con resultados finales satisfactorios como pH de 6, relación C/N de 15,

Norgánico de 1.2 % y % MOT de 55.49 %. Estas características finales, sugieren que hubo una

mayor actividad amilolítica, que no fue reportada debido a los tiempos de muestreo utilizados, o

también que el muestreo no coincidió con los días de mayor actividad.

Aún cuando la temperatura de la pila de compost 2 no fue satisfactoria, la actividad enzimática

presentó el comportamiento esperado (aunque con valores bajos), puesto que se incrementó de

2.9 UA a 4.22 UA (Fig.3), durante la primera semana de muestreo. Este incremento de la

actividad amilolítica coincide con cambios físicos de la pila, la cual al cabo de la primera semana

ya no contenía residuos de lechuga visibles.

Así mismo, dicho incremento de actividad amilolítica y por tanto de degradación aerobia del

material residual, conduce a un descenso gradual del pH en la pila. En la fig. 3, se observa

también una estabilización en la actividad que se ve reflejado en el comportamiento del pH, que

también tiende a mantenerse constante con valores cercanos a 6.

Fig.3. Actividad amilolítica y biomasa amilolítica de la pila de compost 2

38

Peláez et al., (2004), en un estudio sobre compostaje de estiércol de aves de corral y aserrín,

reportaron un comportamiento ascendente de la actividad amilolítica entre los días 9 y 43,

encontrándose valores desde 1.25 a 6.26 µmol/ min * g, respectivamente. Esto expresado en

µg/h*g, equivaldrían a 13500 y 67620 UA. Una vez más los valores obtenidos en el compost de

lechuga se encuentran muy distantes de otros valores reportados, aunque en este caso particular

se debe tener en cuenta que el estiércol puede contener una mayor carga de amilasas debido a su

contenido microbiano. Se debe resaltar también, que por las características de la matriz, el

tiempo de duración del proceso fue mayor a los 43 días, aunque no se menciona en el artículo,

como tampoco el comportamiento de la actividad amilolítica a lo largo de todo el proceso.

La tendencia de la actividad amilolítica a estabilizarse, tendría que haberse reflejado en una

estabilización de la temperatura de la pila. Sin embargo, este efecto no se presentó, debido a las

fluctuaciones de temperatura en la pila, producto del tamaño de la misma que redujo bastante sus

dimensiones al cabo de la primera semana y a la falta de paredes en el área de compostaje.

Debido a que el proceso de degradación se presentó en un tiempo menor al esperado

inicialmente, no se hicieron suficientes muestreos para caracterizar de una mejor manera la

actividad amilolítica presente en el proceso, puesto que pudo haber reportado valor mayores a los

mostrados en la fig. 3.

Con respecto a la biomasa de microorganismos amilolíticos cuantificada en la pila de compost

(fig. 3), se puede decir que la disminución de las UFC/g presentada en la primera semana (de 1*

105 a 1* 104 UFC/g) se generó como consecuencia de una posible adaptación de los

microorganismos.

Durante la semana 2, se evidencia un incremento en la biomasa que puede ser indicio del

consumo de otras fuentes de carbono diferentes al almidón, puesto que para el miso tiempo se

observó una disminución de las UA (Fig. 3).

39

6.1.3. Cuantificación de la Materia Orgánica Total (MOT) y del Carbono Orgánico Total

(COT)

En la fase I se realizó la cuantificación de la materia orgánica por vía húmeda, este método

consiste en hacer reaccionar la muestra de compost o suelo con un exceso de dicromato de

potasio en presencia de un ácido fuerte (ácido sulfúrico) y luego titular con sal ferrosa el

dicromato que no reaccionó (Chan et al., 1995; Norma Mexicana NMX-AA-021-1985).

En la fig. 4 se observa que la pila 2 empezó con un alto porcentaje de materia orgánica total y

que como es de esperarse a medida que avanza el proceso de compostaje dicho porcentaje

disminuye, en general esto es lo que ocurre en todos los procesos de compostaje elaborados

correctamente, puesto que la materia orgánica presente en la matriz es mineralizada

bioquímicamente, por los microorganismos presentes en la matriz (Hernández et al., 2005).

El valor de COT registrado fue menor que el de MOT, lo cual es de esperarse, debido a que la

determinación del % COT se hace con base en el % MOT aplicando un factor matemático (1.72,

ecuación 6), que supone la proporción de COT presente en MOT. Al aplicar dicho factor, se

establece una proporción directa entre MOT y COT, lo cual hace que las curvas presentadas por

cada uno de estos parámetros sigan siempre el mismo comportamiento.

Fig. 4: Determinación de la materia orgánica presente en la Pila de Compost 2.

40

Al cabo de la segunda semana, se observa un aumento del %COT que puede estar relacionado

con el aumento de la biomasa de microorganismos amilolíticos, que para esa semana reportó la

mayor cantidad de UFC/mL. De igual forma, se evidencia un aumento del % MOT, que puede

ser causado por la generación de sustancias húmicas como parte fundamental de la estabilización

del proceso de compostaje (Charest et al., 2003; Said- Pullicino et al., 2007).

Como se dijo anteriormente, el muestreo de la pila se realizó una vez a la semana, por lo tanto,

en esta etapa del experimento no fue posible conocer detalladamente el comportamiento de la

materia orgánica (degradación y formación de nuevos productos).

6.2. Fase I: Producción del Inoculante Mixto

6.2.1. Aislamiento de microorganismos amilolíticos termófilos

Luego de hacer el procesamiento 18 muestras provenientes de las pilas 1 y 2, se lograron aislar 8

microorganismos diferentes, que incluían bacterias filamentosas y no filamentosas. Todas ellas

con actividad amilolítica, en la tabla Nº 5 se describen las características micro y macroscópicas.

Las poblaciones predominantes fueron microorganismos Gram positivos con morfologías

bacilares y filamentosas, pertenecientes al grupo de los actinomycetes. Los actinomycetes han

sido descritos como microorganismos altamente facultados para sobrevivir en compost en

condiciones aerobias y en presencia de materia orgánica contenida en una gran variedad de

sustratos orgánicos. Su alta capacidad para habitar ambientes como el suelo o compost, está

relacionada con la producción de enzimas extracelulares, que le permiten utilizar una gran

variedad de sustratos como fuente energética (Ballows, 1991; Atlas y Bartha, 1987).

41

Tabla Nº 5: Características morfológicas de las cepas con actividad amilolítica obtenidas

durante el asilamiento primario.

Cepa Microscopía Macroscopía

AA1 Filamentos delgados Gram positivos Esporas

Colonias secas y pulverulentas de color

blanco. Envés de color café.

AA2 Bacilos cortos Gram positivos Colonia redondas, pequeñas, cremosas

con bordes traslúcidos

AA3 Bacilos delgados, medianos Gram

positivos

AA4 Filamentos delgados y esporas Gram positivos

Colonias blancas corrugadas con bordes

traslúcidas

AA5 Filamentos delgados Gram

positivos

Colonias secas, corrugadas, de color

blanco.

AA6 Filamentos delgados y cortos Gram

positivos

Colonias puntiformes, pulverulentas de

color blanco en el centro y borde

traslúcido.

AA7 Bacilos largos Gram positivos Colonias redondas cremosas, de color

crema en el centro y bordes traslúcidos

AA8 Bacilos largos Gram positivos Colonias redondas, cremosas de color

amarillo oscuro.

42

Fig. 5. Microscopía de la cepa AA5.

(Fuente: Autores)

Los otros microorganismos aislados, presentaron una morfología bacilar, correspondiente al

género Bacillus sp, reconocido por su capacidad de degradar múltiples sustratos dentro de los

que se encuentra el almidón, y varias especies, son a menudo encontradas durante procesos de

compostaje, debido a su tolerancia a altas temperaturas (Quinceno, 1989).

Luego de hacer los pases en agar almidón 1% (p/v) por triplicado, se obtuvieron tan solo 5

microorganismos puros, que conservaron sus características tanto microscópicas como

macroscópicas y la actividad amilolítica. Las cepas recuperadas fueron AA1, AA2, AA3, AA4 y

AA5.

Posteriormente se midieron los halos de hidrólisis de cada uno de los microorganismos aislados.

Los resultados se muestran en la Tabla Nº6 y en la Fig. 6 los halos de hidrólisis generados por las

cepas AA1 y AA2 respectivamente.

Debido a que tres de los microorganismos asilados en el aislamiento primario no se pudieron

recuperar, se dejaron las cinco cepas restantes para producir el inoculante mixto. Al hacer la

medición de los halos de hidrólisis de cada una de las cinco cepas, se encontró, que la mejor cepa

era la AA1.

43

Tabla Nº 6: Determinación semicuantitativa de la actividad amilolítica de las cepas aisladas

y purificadas.

Cepa Promedio Halo de Hidrólisis (cm)

AA1 2.5

AA2 1.2

AA3 1

AA4 0.5

AA5 0.5

Fig. 6: Microorganismos amilolíticos aislados de muestras de compost. a. Cepa AA1.

b. Cepa AA2.

a. b. (Fuente: Autores)

Koch et al., (1997) reportan que una cepa con actividad enzimática alta, es aquella que genera

halos de hidrólisis con diámetros superiores a 5 mm. Sin embargo, de las cinco cepas aisladas

ninguna presentó valores inferiores al parámetro mencionado.

Debido a que este es un método semicuantitativo, la actividad amilolítica de cada una las cepas,

fue evaluada posteriormente por un método cuantitativo.

44

6.2.2. Selección de cepas por antagonismo

No se presentó antagonismo ninguno entre las cinco cepas evaluadas (tabla Nº 7), por lo cual son

considerados aptos para su utilización en el inoculante mixto.

Tabla Nº 7: Resultados de las pruebas de antagonismo realizadas con las 5 cepas aisladas.

Cepa AA1 AA2 AA3 AA4 AA5

AA1 - - - - -

AA2 - - - - -

AA3 - - - - -

AA4 - - - - -

AA5 - - - - -

De manera simultánea, se hicieron controles de los microorganismos a evaluar como antagonista,

sembrándolos por separado en el mismo medio y bajo las mismas condiciones de incubación,

con el fin de garantizar su viabilidad y conservación de la actividad amilolítica.

6.2.3. Curvas de Crecimiento

La actividad amilolítica inicial de todas las cepas fue muy cercana, reportando valores desde

26137 UA y 26554 UA, para las cepas AA2 y AA4 respectivamente (Fig. 7). Valores altos,

comparados con lo reportado por Goya et al., (2005), de 9396 UA en la degradación de harina de

papa.

45

Fig. 7: Cuantificación individual de la actividad amilolítica de los microorganismos

aislados.

Todas las cepas excepto la AA5, mantuvieron la producción de enzimas del tiempo cero, durante

las primeras 2 horas, mientras que la cepa AA5 mostró un incremento de casi 1000 UA durante

el mismo periodo de tiempo, esto indica una fase de adaptación de todas las cepas excepto AA5.

Las cepas AA1 y AA5, luego de tener un aumento en la producción de amilasas, mostraron una

disminución de la misma al cabo de 8 horas y un posterior aumento de la actividad amilolítica.

En el primer caso (AA1), esta disminución en la actividad puede estar referida a una inhibición

por producto (Mathews et al., 2002), puesto que en la hora 6 se observó la máxima producción

de amilasas e inmediatamente después se produjo el descenso. Si bien para AA5 el descenso no

estuvo antecedido por la máxima producción, el valor inmediatamente anterior es muy cercano al

máximo y además alto (25000 UA), por lo cual también puede ser considerada una inhibición

por producto.

Las cepas que reportaron mayor actividad enzimática fueron AA1 y AA2, que fue lo estimado

previamente, al hacer la determinación semicuantitativa de la actividad enzimática. Seguidas por

las cepas AA3, AA4 y finalmente AA5 con la menor producción.

46

De manera simultánea a la cuantificación de la actividad enzimática, se determinó el crecimiento

en biomasa (Fig. 8) de los diferentes microorganismos aislados, por medio del recuento en placa

en agar almidón 1% (p/v).

Fig. 8: Curva de Crecimiento de los microorganismos aislados, en medio almidón 1% (p/v).

Al determinar el comportamiento de la biomasa para cada uno de los microorganismos, se halló

que las cepas AA1, AA2 y AA3, presentaron una fase de adaptación que tuvo una duración de 2

horas. Esta fase de adaptación coincide con el comportamiento constante que presentó la

actividad amilolítica para estos microorganismos, durante el mismo intervalo de tiempo. A partir

de la hora 2, estas cepas incrementaron la actividad amilolítica en 8000 UA, lo cual se vio

reflejado en un aumento repentino de la biomasa celular que incrementó en 2 unidades

exponenciales, para los dos microorganismos.

Por su parte, las cepas AA4 y AA5 no evidenciaron una fase de adaptación sino que presentaron

un aumento proporcional en las UFC/mL, que en el caso de la cepa AA5 coincide con el

incremento en la actividad amilolítica reportada desde el tiempo cero.

Las cepas que evidenciaron mayor aumento en su biomasa fueron AA1 y AA2, lo que era de

esperarse puesto que estas dos cepas fueron las que sintetizaron mayor cantidad de amilasas.

Además para las dos cepas la máxima biomasa reportada estuvo antecedida por el valor máximo

de actividad amilolítica.

47

6.2.4. Curva de Crecimiento del Inoculante Mixto

Una vez identificado el comportamiento cinético individual de las cinco cepas, se llevó a cabo la

determinación de los mismos parámetros cinéticos para el inoculante mixto. Para la cual, una

unidad amilolítica fue definida como la cantidad de enzima capaz de liberar 1 µg de azúcares

reductores/ mL* h.

El valor inicial de la actividad amilolítica fue 7546, 33 UA (Fig. 9), que si bien fue menor que

todos los valores reportados en las cinéticas individuales, no se presentó un valor constante de las

UA entre las horas 0 y 2, como sucedió con algunas cepas. Por el contrario, en las primeras dos

horas, se produjo un incremento de casi 31000 UA, este comportamiento era lo que se esperaba,

puesto que los microorganismos habían sido enriquecidos en el pre-inóculo y debían estar

activos metabólicamente.

Fig. 9: Cuantificación de la Actividad Amilolítica y la biomasa del Inoculante Mixto

Luego del incremento en la actividad enzimática, se produjo una estabilización de la misma, que

se mantuvo en un rango entre 40000 y 45000 UA, valores mayores a los demostrados por cada

cepa de manera individual, lo que indica una mayor degradación de sustrato por parte del

consorcio microbiano (Ayala et al, 2001). Así mismo, se observó un comportamiento bastante

estable de la actividad amilolítica entre las horas 4 y 14, lo que sugiere que el consorcio

microbiano adquiere una mayor estabilidad en la producción de amilasas.

48

Al analizar el recuento de las UFC/mL, tampoco se presentó una fase de adaptación (Fig. 9),

puesto que los microorganismos fueron mezclados cuando estaban todos en fase exponencial (1*

106). La tendencia del crecimiento exponencial, se mantuvo a lo largo de las 12 horas de

muestreo, durante las cuales se produjo incrementos de 1 unidad exponencial por hora de

muestreo. Los incrementos en la biomasa, no resultan muy distantes de aquellos obtenidos con

cada una las cepas de manera individual, debido a la estabilidad enzimática presente en el

inoculante mixto, no obstante, los recuentos de biomasa fueron mayores que en las cinéticas

particulares, debido a la actividad enzimática y también al suministro adicional de aire que se les

dio.

Se logró obtener una biomasa máxima de 2*1028 UFC/mL y una actividad amilolítica de 11020

UA en la hora 22. Si bien los microorganismos no presentaron de manera individual, aumentos

en la biomasa ni en la actividad amilolítica por periodos de tiempo tan prolongados, en el

inoculante mixto, se obtuvo tal diferencia, gracias a la cantidad adicional de oxigeno proveído.

Este inoculante se llevó a evaluación en campo durante la fase II.

6.2.5. Fase II: Evaluación del Inoculante Mixto en campo

Con el fin de controlar de una mejor manera los factores externos al proceso, para la fase II de

evaluación, el área de compostaje fue modificada. Se aumentaron sus dimensiones, se cambió el

plástico del techo por uno de mayor resistencia para proteger las pilas del agua lluvia y se

adicionaron paredes en plástico también, con el fin de conservar mejor la temperatura bajo el

techo.

Para la evaluación del inoculante mixto en campo, se determinaron parámetros como la biomasa

de microorganismos amilolíticos presentes en el compost, temperatura, pH, %MOT, %COT y

actividad amilolítica. La actividad amilolítica fue determinada, luego de ensayar dos métodos de

extracción de amilasas, uno con buffer citrato y el otro con buffer Sorensen.

49

6.2.5.1. Comparación entre los dos métodos de extracción de amilasas

Al determinar la actividad amilolítica presente en las pilas, por los dos métodos de extracción, se

encontraron grandes diferencias entre los datos obtenidos para una misma muestra. Las unidades

amilolíticas fueron definidas para los dos métodos de extracción, como la cantidad de enzima

capaz de liberar 1µg de azúcares reductores/ g*h.

Se encontró que el método que lograba extraer una cantidad mayor de amilasas fue el que emplea

buffer citrato, que para la pila con inoculante mixto en el tiempo cero indicó 41 UA, comparado

con 4.28 UA extraídas con el método del buffer Sorensen (Fig.10).

Sharada y Sanjat (2004) en su estudio, extrajeron amilasas con el fin de evaluar la actividad

amilolítica presente en una muestra de suelo. En ese estudio, se hallaron múltiples valores de

UA, desde 8.4 hasta 116 UA, encontrándose la mayoría de los valores alrededor de 60 UA. De

acuerdo a estos valores de referencia, es claro, que la cantidad de amilasas extraídas con este

método y bajo las condiciones de operación, no fue lo suficientemente eficaz. Aún más, cuando

se obtuvieron valores hasta diez veces más altos con el otro método.

Fig. 10: Cuantificación de la Actividad Amilolítica presente en la Pila con Inoculante luego

de utilizar dos métodos de extracción de amilasas.

Luego de realizar el análisis t- student para determinar las diferencias entre los métodos de

extracción enzimática, se rechazó la hipótesis nula (p < 0.0001) (Fig. 12) encontrándose que el

método de extracción con buffer citrato fue el que cuantificó más UA. A partir de este estudio, se

50

puede considerar un buen método porque presentó menor desviación en los datos y una mayor

extracción de amilasas, además de una mayor estabilidad en el color luego de realizar Somogyi-

Nelson.

En la pila Control no se presentaron diferencias estadísticamente significativas en cuanto a la

cantidad de UA cuantificadas luego de realizar la extracción con los dos métodos, con p > 0.05

(Fig. 11). Aunque se reportan diferencias para el tiempo cero de 15.73 UA con buffer citrato

frente a 1.95 UA extraídas con el método del buffer Sorensen (Fig. 12 a.). Los métodos no

muestran una diferencia significativa entre si, debido a que las medias de cada técnica presentan

valores similares. Sin embargo, el método de extracción con el buffer citrato logra hacer una

mayor extracción de enzimas a partir del día ocho. Si bien el buffer citrato logra hacer una mayor

extracción de amilasas, la media de los datos obtenida, es similar a la del buffer Sorensen,

porque en el primer caso, se cuenta con valores muy distantes entre si, que hacen que la media

estadística se ubique en un valor muy cercano al del otro método (Fig. 11).

Fig. 11: Comparación de los métodos de extracción enzimática para cada uno de los tratamientos Pila con inoculante mixto Pila Control

UA

0,5

1

1,5

2

Citrato Sorensen

Buffer Extracción t-Test DF Prob> t 9.845 28 <.0001

UA

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

Citrato Sorensen

Buffer Extracción t-Test DF Prob> t 2.023 28 0.0527

51

Fig. 12: Cuantificación de la Actividad Amilolítica presente en la Pila Control luego de

emplear dos métodos de extracción de amilasas. a. Grafico integrado días 0- 7. b. Actividad

amilolítica con buffer citrato en los días 8- 15.

a.

b.

La diferencia entre los dos métodos de extracción radica en la presencia del tolueno en el método

del buffer Sorensen, puesto que con este método se formaba una solución bifásica, que por una

parte puede impedir la solubilidad de las enzimas extraídas (Peláez et al., 2004) y por otra parte,

es probable que por la temperatura y el tiempo de incubación empleados (55 ºC * 24 horas)

causaran alteraciones en su capacidad de extraer las enzimas. Mientras que el método del buffer

citrato solo formaba una fase acuosa, en la que la solubilización de las enzimas pudo haber sido

mayor.

52

Una vez establecido el método del buffer citrato como el que extrajó mayor cantidad de amilasas,

los valores de actividad amilolítica mencionados en adelante, hacen referencia a aquellos

cuantificados luego de la extracción con dicho método.

6.2.5.2.Cuantificación de la actividad amilolítica de pilas tratamiento y control

Con respecto a la actividad amilolítica para la pila con inoculante (Fig. 10), es evidente un

aumento en la UA entre los días 0 y 2, sin embargo, la actividad amilolítica no permaneció

constante a través del tiempo, puesto que presentó picos de ascenso y descenso de las UA. Esto

puede deberse a cortas inhibiciones en la producción de UA, por exceso de producto (Mathews et

al., 2002).

Si bien se muestran picos de ascenso y descenso en la cantidad de UA para la pila con inoculante

mixto, debe aclararse que la temperatura durante los primeros cinco días, se mantuvo muy

constante, comparado con lo observado en la fase I. Lo cual podría indicar que aún cuando las

UA disminuyen, la temperatura no varía, porque existen otro tipo de actividades enzimáticas

como la celulolítica, que la mantienen constante.

Al aplicar el análisis estadístico de Kruskal Wallis se encontró con p= 0.0001(Anexo 4) que

existen diferencias significativas en la actividad amilolítica presente en la pila tratamiento a

través del tiempo. Esto significa, que no hay un comportamiento estable o constante de la

actividad amilolítica en la pila, sino que la actividad amilolítica fluctúa todo el tiempo.

La actividad amilolítica inicial de la pila control, fue menor comparada con la del inoculante

mixto, reportando 15.7 UA frente a 41.7 UA de la pila tratamiento (Fig. 13 b.), sin embargo,

presentó el mismo comportamiento de picos de ascenso y descenso, guardando las proporciones

en la cantidad de UA de cada una.

No obstante, la pila control al cabo del día 7, presentó un incremento de la actividad amilolítica

de más de 6000 UA con el buffer citrato. Una posible razón de la mayor actividad en la pila

inoculada es la estimulación metabólica previa que tenían los microorganismos presentes en el

53

inoculante mixto, que por encontrarse en un caldo almidón 1% (p/v) en el momento de la

aplicación a la pila; la producción de amilasas era alta mientras que en la pila control los

microorganismos no estaban tan activos, y podría considerarse el intervalo entre los días 0 y 7

como una etapa de adaptación o estimulación de esos microorganismos nativos.

El comportamiento descrito por la pila control reportó también diferencias estadísticamente

significativas con respecto a la actividad amilolítica y el tiempo (p < 0.0001, Anexo 4),

presentando la mayor actividad en el día 7 y sugiriendo fluctuaciones de la actividad amilolítica,

que respalda el argumento de que la cantidad de UA es afectada negativamente por la

concentración de producto presente en la matriz (Mathews et al., 2002).

El análisis estadístico t- student aplicado para determinar diferencias significativas entre la

actividad amilolítica presente en cada uno de los tratamientos, arrojó un valor de p= 0.2540 (Fig.

13) por el cual se acepta la hipótesis nula que afirma que no existen diferencias entre los

tratamientos. Si bien durante los primeros 7 días las pilas mostraron diferencias grandes en los

valores obtenidos de UA, la pila control mostró un aumento significativo en las UA, logrando así

que el resultado final de los dos procesos fuera muy similar.

Fig.13: Comparación estadística de las actividades amilolíticas entre pilas tratamiento y

control

UA

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

Control Inóculo

TTO

1-way Test, ChiSquare Approximation

Prob>ChiSq 0.2540

54

Durante los primeros 4 días, las dos pilas redujeron sus dimensiones notablemente, situación

esperada como consecuencia del proceso de degradación y mineralización del material Ayala et

al (2001). Luego de emplear una cantidad cercana a 1000 Kg de lechuga se obtuvo 300 Kg de

compost maduro.

6.2.5.3. Cuantificación de la biomasa amilolítica presente en las pilas tratamiento y control

La pila con inoculante mixto mostró un recuento de biomasa amilolítica inicial mayor a los

observados en la fase I y en la pila control. Si bien este valor es alto, no corresponde a la biomasa

determinada en el inoculante mixto antes de la aspersión, debido a la disminución de los

microorganismos del inoculante por la presencia de otros microorganismos en la pila y por el

cambio de las condiciones en las que estaban.

Las dos pilas alcanzaron los recuentos máximos al cabo del tercer día, incremento que

corresponde a los picos de descenso de UA de las dos pilas, sustentando la afirmación que las

UA disminuyen por inhibición por producto.

Fig. 14: Recuento de biomasa amilolítica en las Pilas Control y con Inoculante.

Aún cuando se puede establecer una relación entre las UA y la biomasa amilolítica presente en

los dos tratamientos, estadísticamente no se encontró una dependencia entre ellos. Con valores

de p> 0.05 y r2 de 0.359 y 0.018 (Anexo 5) para la pila con inoculante mixto y la control

respectivamente. Lo cual indica una correlación del 35% y el 1.8 % para cada uno de ellos, es

55

decir, que la actividad amilolítica no depende directamente de la biomasa y por lo cual no se

puede establecer una proporcionalidad entre los valores de UA y biomasa amilolítica, para el

caso estudiado. O también que los microorganismos presentes en las pilas, cuentan con sistemas

enzimáticos muy eficientes, por lo que la biomasa presente es capaz de degradar el sustrato

presente en tan poco tiempo y con tal eficacia.

Al cabo del día 11, se evidencia un comportamiento de estabilización de la biomasa para las dos

pilas, como resultado de la disminución de la temperatura y el agotamiento del sustrato.

6.2.5.4. Cuantificación de los porcentajes de MOT y COT

En la fase II se decidió realizar la cuantificación de la materia orgánica por vía seca

(calcinación), ya que este método es más práctico y económico en relación con el de la fase I y

también es aplicable a muestras de compost (IHSS, 1996).

La determinación del contenido de materia orgánica en las muestras en el día 1 del proceso, se

llevó a cabo por vía húmeda y calcinación (tabla Nº 8), con el fin de comprobar la concordancia

entre las dos técnicas. Se evidenció que los dos métodos arrojan resultados similares para una

misma muestra, al menos para el caso estudiado, este resultado se puede deber a que la muestra

analizada estaba compuesta por sustratos de estructuras simples que son fácilmente oxidables,

por lo tanto es posible que el dicromato reaccionara con toda la materia orgánica presente.

Según Magdoff y Weil, 2004 cuando se realiza la determinación del % MOT por calcinación los

valores obtenidos son generalmente 25% más altos que aquellos reportados por vía húmeda

puesto que estima el total de MO presente en una muestra por la pérdida de peso al someterla a

una temperatura lo suficientemente alta como para volatilizar todo el material orgánico. Por otra

parte, el método de Walkley y Black muestra ciertas desventajas en comparación con la vía seca

como el gasto de reactivos, la oxidación de la sal ante la luz, las variaciones en los resultados del

blanco, el factor de corrección que se le debe realizar a los resultados debido a que según la

norma mexicana NMX-AA-021-1985 la reacción tiene una eficiencia del 72% y finalmente la

poca efectividad por parte del dicromato para oxidar compuestos aromáticos complejos como

56

sustancias húmicas presentes en la materia orgánica (Rumpel et al., 2007; Knicker et al., 2007).

Esta última razón indica que si se cuantifica % MOT por ambos métodos para una muestra de

compost en un estado más avanzado del proceso, los resultados seguramente no serían similares.

Tabla 8. Resultados %MOT al cabo del segundo día de compostaje por vía húmeda y seca.

Método % MOT pila control % MOT pila con

inoculante

Vía húmeda 63. 493 52.083

Vía seca 63.200 53,132

El % MOT inicial en la fase I fue mayor que el de la fase II (fig. 5 y 15), porque el material

empleado en la segunda fase se encontraba más degradado, a causa del tiempo de recolección del

material, que fue de 5 días, tiempo en el cual se inició el proceso de mineralización, que redujo la

cantidad de materia orgánica presente en la mezcla.

Fig. 15: Comportamiento la materia orgánica (% m/m) en las pilas tratamiento y control.

El porcentaje inicial de MOT depende directamente de los materiales a compostar, al igual que la

tasa de degradación (Bernal et al., 1998). El % MOT en una matriz de estudio, puede variar de

acuerdo a los materiales que contenga. En un estudio realizado por Huang et al., 2005 el

porcentaje de MOT inicial era del 64% a partir de heces de vaca y pollo, paja, residuos de

champiñones y salvado de arroz, mientras que en un estudio realizado por Sebastia et al., 2007

57

fue del 96.3% a partir de residuos de plantas coníferas, demostrando así que según el material

compostado se pueden encontrar diversos porcentajes de MOT inicial.

Como se observa en la fig. 16 a medida que transcurre el tiempo hay una disminución en el

porcentaje de materia orgánica total, lo cual se debe a la mineralización por parte de los

microorganismos presentes en el compost (Zbytniewski y Buszewski, 2005; Castaldi et al., 2005;

Zmora-Nahum et al., 2005). No obstante, las dos pilas reportaron incrementos en el % MOT en

diferentes momentos, comportamiento que puede deberse a que durante el proceso de

compostaje hay degradación del sustrato y síntesis de nuevos compuestos, como sustancias

húmicas responsables de la estabilidad del producto final (Charest et al., 2003; Said-Pullicino et

al., 2007). Hernández et al., 2005 reportaron que en un compost que contenía lodos residuales se

encontraban altas cantidades de ácido acético al final del proceso por la pirólisis de la formación

de nuevos carbohidratos. Por otra parte, el que este fenómeno ocurra primero en la pila con

inoculante hace pensar que el proceso estaba ocurriendo más rápido en dicha pila.

El test t-studient mostró un p= 0.796 lo que quiere decir que no hay diferencias significativas en

el contenido de MO en las dos pilas (Anexo 6). Al analizar el comportamiento de la MO frente al

tiempo, se encontraron valores de p= 0.0004 y p= 0.0005 para el tratamiento y el control,

respectivamente lo que indica que hay diferencias estadísticamente significativas en los dos

casos.

Existen diferentes teorías respecto a la cantidad de COT presente en la MO, Magdoff y Weil,

2004 establecen que el 77% de la MO es CO mientras que otros autores como Faithfull N, 2005

y Zmora-Nahum et al,2005 proponen que es solo del 58%. Al final del proceso el % COT para la

pila con inoculante y control fue 33,3% y 29,5% respectivamente (Fig. 16), lo cual según la NTC

5167 de 2004 para abonos orgánicos indica que el producto final es de buena calidad, ya que la

norma pide que el % COT se encuentre por encima del 15%. Este resultado coincide con el

obtenido por Huang et al., 2005 donde el porcentaje de COT al final del proceso de compostaje

(63 días) se encontraba alrededor del 33%.

58

Fig. 16: Carbono Orgánico Total presente en las pilas tratamiento y control

Las sustancias húmicas son resistentes a la degradación y la mayoría de sus componentes

contienen carbono orgánico en el compost maduro; por esta razón la disminución en el carbono

orgánico es un buen indicador de la madurez del producto final (García et al., 1991; Inbar et al.,

1991; Zmora-Nahum et al., 2005). Bernal et al., (1998) encontró que el carbono orgánico está

altamente correlacionado con la cantidad de carbono mineralizado, observando esto en siete

compost realizados a partir de desechos agrícolas y residuos municipales. Las altas tasas de

mineralización en un compost inmaduro pueden causar efectos perjudiciales sobre el crecimiento

de las plantas ya que generan la competencia por el nitrógeno y el oxígeno.

6.2.5.5. Análisis de la temperatura y el pH

La temperatura a lo largo del proceso se comportó de forma similar en ambas pilas (Figura 17),

demostrando que aunque la pila con inoculante poseía en teoría una mayor cantidad de

microorganismos termófilos, en realidad este hecho no sirvió para marcar una diferencia

estadísticamente significativa respecto a la pila control con un p = 0.796 (Anexo 7). Esto se

puede deber a varias razones; primero a que los microorganismos del inoculante demostraron

una actividad óptima en el laboratorio a los 55 ºC, temperatura que no se logró en campo, debido

la incapacidad de las pilas de mantener el calor o también a las dimensiones de las mismas.

Por otra parte, es bien conocido que después de agregar un inoculante, la biomasa de este

disminuye por el cambio drástico de ambiente representado en la interacción con otros

microorganismos y la presencia de otras fuentes nutricionales; y finalmente, a que los

59

microorganismos del inoculante fueron aislados de las pilas de compost elaboradas en la fase I,

por lo tanto la pila control también poseía las mismas poblaciones microbianas y al añadir el

agua melaza se estimuló el aumento de dichos microorganismos, quienes a su vez incrementaron

la actividad amilolítica luego de un periodo de 7 días (Fig. 12).

Fig. 17: Temperaturas alcanzadas por las pilas tratamiento y control.

En los primeros 6 días del proceso, la temperatura se mantuvo alrededor de los 40 ºC, que fue la

más alta alcanzada durante todo el proceso. En estos primeros días fue cuando ocurrió el mayor

cambio del material compostado, ya que la pila disminuye drásticamente de tamaño, y la lechuga

fue degradada casi por completo.

A partir del día 7 se observó un descenso constante en la temperatura hasta alcanzar su valor el

cual para la pila control fue de 20 ºC y para la pila con inoculante de 18 ºC (Fig. 17). Según

Saebo y Ferrini (2006), el pH y la temperatura son dos variables dependientes entre sí, de tal

manera que a medida que aumenta la temperatura del compost, se espera un descenso en el pH.

Esto ocurre debido a que los microorganismos mineralizan los sustratos presentes en las pilas

generando calor a partir de sus reacciones metabólicas (lo que explica el aumento de la

temperatura) y se generen ácidos orgánicos que bajan el pH (Avendaño, 2003).

Todo lo anterior concuerda con lo observado en la figura 18, ya que en los primeros días

mientras la temperatura incrementó, el pH disminuyó y alrededor del día 7 aumentó como

consecuencia de la formación de amoníaco y el consumo de los ácidos producidos en los

60

primeros días (Guerra et al., 2001), hasta neutralizarse al final del proceso debido a las

propiedades naturales de tampón de la materia orgánica (Graves, 2000). Finalmente se puede

decir que según los valores finales tanto de la temperatura como del pH en ambas pilas el

compost ya se encontraba maduro en el día 15 del proceso (Saebo y Ferrini., 2006).

Fig. 18. Comportamiento del pH en las pilas Control y con Inoculante

Finalmente, se encontró que en cuanto al pH tampoco se presentaron diferencias

estadísticamente significativas entre los tratamientos (p= 0.92, Anexo 7), lo que indica que en

términos generales los procesos de descomposición en las pilas fue muy similar.

6.2.5.6. Características Fisicoquímicas obtenidas en los tratamientos

Se determinaron las características fisicoquímicas de cada uno de los tratamientos y se

compararon con los valores de referencia exigidos por la NTC 5167/04. Los análisis fueron

llevados a cabo por Agrilab, laboratorio certificado por el ICA.

En la tabla Nº 9 se puede apreciar que los valores para la mayoría de los parámetros evaluados

no difieren mucho entre el tratamiento y el control, puntualmente en aspectos importantes como

C/N, pH y nitrógeno orgánico, cumpliendo con los parámetros fisicoquímicos exigidos por la

norma.

La caracterización fisicoquímica (tabla Nº 9) pone de manifiesto la excelente calidad del abono

orgánico obtenido en los dos casos. Una relación C/N de 11 y 12 para el tratamiento y control,

61

que según la NTC 5167 debe ser inferior a 25 y cercana a 15 según Ribeiro et al.,(2007). De

igual forma, Ballesteros (2001) propone que el carbono disminuye debido a que el carbono se

convierte en anhídro carbónico, por lo cual la relación C/N debe alcanzar un valor cercano a 10/1

al concluir el proceso; esto concuerda con los resultados obtenidos por Kalil et al (2007) donde

después de 75 días de compostaje de residuos de plaza, poda y contenido ruminal, obtuvo una

relación C/N final de 11.

Las diferencias en los valores de MOT y COT reportados por Agrilab (tabla Nº 9) y los

obtenidos en el Laboratorio de Microbiología Ambiental y de Suelos, radica en los métodos

empleados, puesto que ellos utilizan Walkley y Black, mientras que para este caso se empleó

calcinación.

El pH es otro parámetro importante, puesto que la aplicación de un compost con pH muy ácidos

o alcalinos, puede afectar la estabilidad del suelo acidificándolo o alcalinizándolo. En los dos

casos, los valores fueron muy cercanos a 7, lo cual demuestra la estabilidad y madurez del

compost obtenido.

La humedad fue un parámetro que no cumplió ninguno de los dos productos finales, dado que

fue mayor a 35%, sin embargo, el compost puede ser sometido a un proceso de secado,

extendiéndolo en una superficie plana, de tal manera que logre secarse. La pila con inoculante

resultó tener un mayor porcentaje de humedad que la pila control, en parte debido a que los

microorganismos fueron adicionados en suspensión y esto puedo contribuir al aumento de la

humedad.

El contenido tanto de macro como de microelementos del compost, cumple con la normatividad

colombiana vigente, sugiriendo el alto valor nutricional que tiene el abono como tal y

respondiendo a la efectividad y calidad del proceso. Además, se puede establecer que aún cuando

el tiempo de compostaje fue reducido en más del 50 % con respecto a la fase I, se conservó la

calidad fisicoquímica del producto final.

62

Tabla Nº 9: Características fisicoquímicas del compost obtenido durante la fase II.

UNIDAD PILA CONTROL

PILA INOCULANTE

MIXTO

LIMITES PERMITIDOS (NTC 5167/04)

FISICOQUIMICA

pH 6.86 6.87 5-8

Densidad Aparente

g/mL 0.54 0.56 MENOR DE 0.6

Humedad % 46.6 53.5 MENOR DE 35

C.I.C meq/100g 55.6 59.2 MAYOR DE 30

C/N 12 11 MENOR DE 25

Carbono orgánico

Oxidable

% 19

17.8

MAYOR DE 15

Nitrógeno % 1.59 1.57 DECLARARLO SI SON MAYORES DE

1% Fósforo % 1.07 1.12

Potasio % 2.39 2.57

Calcio % 1.22 1.27

Magnesio % 0.49 0.54

Azufre % 0.21 0.21

Boro ppm 21 23

Cobre ppm 13 12

Manganeso ppm 245 213

Hierro % 0.47 0.50

Zinc % 115 109

Sodio % 1450 1400

(Fuente: Agrilab, 2007)

6.2.5.7. Calidad microbiológica del compost obtenido

Existe un importante aspecto de salud relacionado con la aplicación del compost, el cual está

dado por la incidencia de enfermedades producidas por los microorganismos patógenos durante

la disposición y utilización insalubre de estos productos. Buenas prácticas agrícolas y de higiene

63

son necesarias para proteger los cultivos de la contaminación con los patógenos presentes en

estos biofertilizantes, además de que se precisan de más investigaciones para determinar como se

propagan en el campo estos microorganismos (Gómez et al., 2004).

Los resultados obtenidos por el CIAA se muestran en la tabla 10, en la cual se observa la

presencia de Salmonella sp. y E. coli en el compost obtenido a partir de las dos pilas.

Tabla Nº 10: Caracterización microbiológica del compost

Tratamiento Análisis Resultado

Inoculante Mixto Recuento de E. coli por NMP 480 NMP/g

Recuento de Salmonella sp. Por NMP 1,01 NMP/4g

Control Recuento de E. coli por NMP >2400 NMP/g

Recuento de Salmonella sp. Por NMP < 0.59 NMP/4g

De acuerdo con la norma chilena 2880 de 2004, la cantidad de Salmonella sp debe ser < 3 NMP/

4g, indicando que con respecto a este microorganismo patógeno el compost obtenido por los dos

tratamientos cumplen con los requisitos sanitarios impuestos por la norma. Sin embargo, el valor

permisible para coliformes es < 1000 NMP/g, como se observa en la tabla 10, el compost

obtenido para el control reporta para E. coli un valor superior, por lo cual debe ser reportado

como no apto para su uso en cultivos. Mientras que para el compost obtenido por tratamiento con

inoculante mixto, se observa que para E.coli el valor es inferior al requerido por la norma, por lo

cual, podría utilizarse en los cultivos de lechuga.

E.coli no es considerado un microorganismo patógeno si no un indicador de contaminación fecal,

por lo tanto la presencia de esta bacteria en el compost puede estar dada por una mala higiene por

parte de lo trabajadores de la finca o el uso de pasto que tuvo contacto con los animales. Por otra

parte, este microorganismo es encontrado normalmente en el suelo, el problema consiste en que

cuando la temperatura alcanza los 37 °C su población aumenta pudiendo ser un riesgo para la

salud de las personas si se aplica el compost al cultivo.

La incidencia de Salmonella sp. y E.coli en primer lugar se debe a que la temperatura no fue lo

suficientemente alta y duradera como para eliminar estos microorganismos durante el proceso de

64

compostaje, que como Ribeiro et al, 2007 reportan, debe ser mayor a 40 ºC y con una duración

mayor a una semana. Dado que ninguno de los dos tratamientos logró este comportamiento, era

de esperarse que los microorganismos persistieran. Por otro lado, el tiempo y la temperatura

necesaria para eliminar o reducir los peligros microbianos en el compost u otras materias

orgánicas puede variar según el clima de la región y las prácticas concretas de gestión ambiental

aplicadas en cada caso (FAO, 2000).

Pietronave et al, 2004 afirman que una gran variedad de microorganismos patógenos pueden ser

encontrados en las materias primas empleadas en un proceso de compostaje, siendo la causa mas

frecuente de contaminación el contacto de los materiales con heces fecales. Sin embargo, Islam

et al., (2005) asegura que la contaminación puede provenir de otras fuentes como riego con agua

contaminada, contacto con compost no apto microbiológicamente, suelo, aire y manipulación

humana.

Una de las actividades incluidas en la siembra de lechuga en la “Hacienda Villa Amparo”

incluye la aplicación de compost proveniente del cultivo de flores. Debido a que no se tienen

datos de la calidad de dicho compost y que según Lyon, 2000 los microorganismos patógenos

pueden sobrevivir en el compost hasta 60 días, se podría pensar en este como una fuente de

contaminación.

Por otra parte, Islam et al., (2005) reporta que organismos como E.coli, pueden sobrevivir en el

suelo hasta por 196 días. Teniendo en cuenta lo anterior, se puede decir que el suelo fue un factor

importante de contaminación, puesto que en un principio el suelo estaba descubierto y propenso

al contacto con aire, lluvia y heces de animales, además del hecho de que la impermeabilización

del suelo era parcial, por lo que con los volteos las pilas en algún momento estuvieron en

contacto con el suelo.

65

7. CONCLUSIONES

De acuerdo a los resultados obtenidos, se puede concluir que:

1. Se logró aislar exitosamente cinco cepas de microorganismos amilolíticos, descritas

como AA1, AA2, AA3, AA4 y AA5. Reportándose AA1 y AA2 como las cepa con

mayor actividad amilolítica con valores máximos de 41509 UA y 40077 UA,

respectivamente.

2. Se logró obtener compost a partir de residuos de lechuga, cascarilla de arroz y poda de

pasto kikuyo, demostrando que con el uso en determinada proporción de estos

materiales se puede lograr la relación C/N optima para obtener un compost

fisicoquímicamente de buena calidad (nitrógeno, fósforo y potasio mayor a 1%, pH

neutro y relación C/N menor a 25) de acuerdo a la Norma Técnica Colombiana 5167 de

2004.

3. Se cuantificó la actividad amilolítica como indicador del progreso del proceso de

degradación de la materia orgánica, encontrándose una mayor producción de amilasas en

la pila tratamiento.

4. La evaluación del método de extracción enzimática, permitió demostrar estadísticamente

que la extracción con buffer citrato fosfato resulta mucho mejor en la recuperación de

amilasas a partir de muestras de compost.

5. El porcentaje de materia orgánica inicial para las pilas tratamiento y control se encontró

alrededor del 70%, aunque el tratamiento presentó una mayor degradación durante la

primera semana en comparación con la pila control. Sin embargo, al final del proceso las

dos pilas reportaron valores para MOT similares, permitiendo concluir que aunque el

inoculante mixto acelera el proceso en un principio, las características finales del

compost obtenido por los dos métodos son muy similares para los dos tratamientos.

66

8. RECOMENDACIONES

A partir de esta experiencia se sugiere:

Evaluar diferentes mezclas y materias primas manteniendo la relación C/N inicial de 25 a

30, para evaluar si dichas mezclas logran tener un efecto en la temperatura,

aumentándola y manteniéndola por más tiempo.

Asegurarse de que la zona de compostaje este totalmente aislada del medio exterior, con

el fin de reducir al máximo las fluctuaciones de temperatura en las pilas, debidas a los

impactos ambientales no controlados que varían el proceso.

Cuantificar el porcentaje de materia orgánica (MOT) por vía seca o calcinación, puesto

que este método muestra menos desventajas respecto a la vía húmeda.

Evaluar si bajo diferentes condiciones de temperatura y tiempo de incubación, la

eficiencia en la extracción de las amilasas mostrada en este estudio por el método del

buffer citrato, se mantiene con respecto al método del buffer Sorensen.

67

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79

ANEXO 1

COMPOSICIÓN DE BUFFERS SORENSEN Y CITRATO- FOSFATO

• BUFFER SORENSEN 0.5 M, pH 5.5 (Ruzin S., 1999).

Preparación para 2 L

NaH2PO4 117.676 g

Na2HPO4 2.715 g

Agua destilada 2 L

• BUFFER CITRATO FOSFATO 0.1 M pH 5.8 (Ruzin S., 1999).

1. Preparar una solución de fosfato dibásico de sodio (Na2HPO4 * 12 H2O) al 0.2 M con un

volumen final de 557.5 mL. Para esto se debe agregar 15.833 g de fosfato dibásico de

sodio a 557.5 mL de agua destilada.

2. Preparar una solución de ácido cítrico al 0.1 M con un volumen final de 442.5mL. Para

esto se debe agregar 8.496 g de ácido cítrico a 442.5 mL de agua destilada.

3. Mezclar las dos soluciones realizadas anteriormente.

4. Medir el pH y ajustar con el ácido o la base según sea necesario para alcanzar un pH

final de 5.8.

80

ANEXO 2

• AGAR ALMIDÓN al 1% p/v (preparación para 1 L)

Almidón 10 g

Extracto de levadura 2.5 g

Peptona universal 2.5 g

Sulfato de amonio 0.5 g

Cloruro de calcio 0.5 g

Fosfato monobásico de potasio 0.1 g

Fosfato dibásico de potasio 0.1 g

Agar 15 g

(Esterilizar 7 minutos a 7 lb de presión). pH 7 +/- 0.2

• SAL FERROSA

1. Pesar 12,0432 g de FeSO4 7H2O y disolver en 4 L de agua destilada fría.

2. Almacenar en un frasco ámbar.

Recomendaciones

- Preparar el reactivo el mismo día en que se va a usar, de lo contrario las sales que lo componen

se precipitarán y el resultado no seria significativo.

- Adicionar el agua destilada fría, de lo contrario el hierro se oxidará.

• AGUA- MELAZA Agregar 25 Kg de melaza por cada 2 litros de agua.

81

ANEXO 3

• CURVA DE CALIBRACION PARA SOMOGYI- NELSON

82

ANEXO 4

ACTIVIDAD ENZIMÁTICA (CITRATO)

CONTROL Oneway Analysis of UA By Time

UA

0102030405060708090

100

0 1 10 11 12 13 14 2 3 4 5 6 7 8 9

Time

Wilcoxon / Kruskal-Wallis Tests (Rank Sums) Level Count Score Sum Score Mean (Mean-Mean0)/Std0

0 3 33 11,0000 -1,616 1 3 110 36,6667 1,843

10 3 113 37,6667 1,980 11 3 87 29,0000 0,796 12 3 57 19,0000 -0,523 13 3 52 17,3333 -0,751 14 3 75 25,0000 0,250 2 3 132 44,0000 2,844 3 3 66 22,0000 -0,114 4 3 24 8,0000 -2,025 5 3 50 16,6667 -0,842 6 3 13 4,3333 -2,526 7 3 8 2,6667 -2,753 8 3 119 39,6667 2,253 9 3 96 32,0000 1,206

1-way Test, ChiSquare Approximation ChiSquare DF Prob>ChiSq

42,8248 14 <.0001

INOCULANTE MIXTO

UA

0102030405060708090

100110

0 1 10 11 12 13 14 2 3 4 5 6 7 8 9

Time

83

Wilcoxon / Kruskal-Wallis Tests (Rank Sums) Level Count Score Sum Score Mean (Mean-Mean0)/Std0 0 3 56 18,6667 -0,569 1 3 112 37,3333 1,934 10 3 119 39,6667 2,252 11 3 85 28,3333 0,705 12 3 39 13,0000 -1,342 13 3 23 7,6667 -2,070 14 3 85 28,3333 0,705 2 3 131 43,6667 2,798 3 3 6 2,0000 -2,844 4 3 16 5,3333 -2,389 5 3 40 13,3333 -1,297 6 3 52 17,3333 -0,751 7 3 108 36,0000 1,752 8 3 81 27,0000 0,523 9 3 82 27,3333 0,569


41,8037 14 0,0001

BUFFER CITRATO COMPARANDO TTOS

UA

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

Control Inóculo

TTO


1,3011 1 0,2540

84

ANEXO 5

CORRELACIÓN BIOMASA Vs UA INOCULANTE

(r25 = 0.359, p > 0.05) Independent: Biomasa

Dependent Mth Rsq d.f. F Sigf b0 b1 UA LIN ,359 5 2,80 ,155 102,259 -5,9950

BIOMASA Vs UA CONTROL

Independent: Biomasa Dependent Mth Rsq d.f. F Sigf b0 b1 UA LIN ,018 5 ,09 ,775 1033,85 128,115

0.00

20.00

40.00

60.00

80.00

6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00

Biomasa

ObservedLinear

UA

0.00

1000.00

2000.00

3000.00

4000.00

5000.00

6000.00

7000.00

4.00 6.00 8.00 10.00 12.00

Biomasa

ObservedLinear

UA

85

ANEXO 6

% MO EN LOS TRATAMIENTOS.

% M

OT

Inoc

ulo

40

45

50

55

60

65

70

75

Control Inoculo

TTO

t-Test

Difference t-Test DF Prob > |t| Estimate -0,7973 -0,261 24 0,7965 Std Error 3,0578

Lower 95% -7,1083 Upper 95% 5,5137

Assuming equal variances

86

INOCULANTE

% M

.O

40

45

50

55

60

65

70

0 1 10 13 14 15 2 3 4 5 6 7 8

Time

Wilcoxon / Kruskal-Wallis Tests (Rank Sums) Level Count Score Sum Score Mean (Mean-Mean0)/Std0 0 3 114 38,0000 2,820 1 3 71 23,6667 0,553 10 3 16 5,3333 -2,293 13 3 10 3,3333 -2,609 14 3 67 22,3333 0,343 15 3 87 29,0000 1,397 2 3 55 18,3333 -0,237 3 3 102 34,0000 2,187 4 3 99 33,0000 2,029 5 3 63 21,0000 0,132 6 3 29,5 9,8333 -1,581 7 3 35,5 11,8333 -1,265 8 3 31 10,3333 -1,502


35,7511 12 0,0004

CONTROL

% M

.O

40

45

50

55

60

65

70

0 1 10 13 14 15 2 3 4 5 6 7 8

Time

Wilcoxon / Kruskal-Wallis Tests (Rank Sums)

Level Count Score Sum Score Mean (Mean-Mean0)/Std0

87

Level Count Score Sum Score Mean (Mean-Mean0)/Std0 0 3 110 36,6667 2,761 1 3 103 34,3333 2,382 10 3 34 11,3333 -1,299 13 3 6 2,0000 -2,815 14 3 22 7,3333 -1,949 15 3 62 20,6667 0,162 2 3 77 25,6667 0,974 3 3 80 26,6667 1,137 4 2 45 22,5000 0,360 5 3 93 31,0000 1,841 6 3 42,5 14,1667 -0,839 7 3 34,5 11,5000 -1,272 8 3 32 10,6667 -1,408


34,8662 12 0,0005

88

ANEXO 7

COMPARACION DEL pH EN LOS TRATAMIENTOS EVALUADOS

pH

7

7,5

8

8,5

Control Inoculoante

TTo

t-Test Difference t-Test DF Prob > |t|

Estimate 0,01600 0,099 28 0,9221 Std Error 0,16220

Lower 95% -0,31626 Upper 95% 0,34826

Assuming equal variantes


14,0000 14 0,4497 COMPARACION DE LA TEMPERATURA EN LOS TRATAMIENTOS EVALUADOS

T°

15

20

25

30

35

40

45

Control Inoculoante

TTO

t-Test Difference t-Test DF Prob > |t| Estimate -0,7100 -0,261 28 0,7960 Std Error 2,7209 Lower 95% -6,2836 Upper 95% 4,8636

PRODUCCION Y EVALUACION DE UN INOCULANTE …

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