Le nuove acquisizioni della diagnosi biochimica e

genetica: quanto manca per caratterizzare i pazienti

mitocondriali?

Valeria Tiranti

2° Convegno Nazionale sulle Malattie Mitocondriali

Firenze26-27 maggio 2012

Le malattie mitocondriali sono difetti multisistemici causati da alterazioni della

OXPHOS

Analisi biochimica della catena respiratoria, PDH, ciclo di Krebs

PCR quantitativa per delezione o deplezione del mtDNA

Ricerca di mutazioni frequenti del mtDNA

Sequenza dell'intero mtDNA

Analisi HRM e sequenza di geni nucleariEXOME SEQUENCING

Diagnostica avanzata=Diagnostica integrata

biopsia muscolare

Valutazione clinica, MRI

Cells Permeabilization by Digitonin

Digitonin

Mitochondrial Enriched Fraction•store at -80°C until use•just before assay 3 rounds freeze/thaw

CytosolCytosol

Cytosol

Cytosol

Fibroblasts>106 cells

Cholesterol

Cyto

solic f

racti

on

Mit

och

on

dri

al fr

acti

on

Cells h

om

og

en

ate

LDH activity

CS activity

Respiratory Chain Complexes

H H ++

1/2 O1/2 O22 HH22OO

H H ++

SuccinateSuccinateFumarateFumarateNADHNADH

H H ++

CoQ

Cyt c

Complex IComplex I Complex IIComplex II Complex IIIComplex III Complex IVComplex IV Complex VComplex V

NADNAD++

Intermembrane spaceIntermembrane space

MatrixMatrix

ATPATP

H H ++

ADP + PiADP + Pi

H H ++

I dosaggi spettrofotometrici misurano l’attività biochimica dei singoli complessi respiratori

Il materiale biologico è a volte insufficiente

Sensibilità del metodo non elevata Specificità tissutale: attenuazione o scomparsa del difetto biochimico presente nel muscolo o nel fegato, nei fibroblasti in coltura dello stesso paziente

Cosa fare con le determinazioni molecolari successive????

Limiti

Misurazioni in tempo reale su cellule adese e vitali in piastre da 96 pozzetti di: consumo ossigeno (OCR)

acidificazione del terreno (ECAR)

SEAHORSE XF96

Consumo O2 (OCR) e acidificazione terreno (ECAR)

Obiettivi specifici

Definire i protocolli sperimentali in fibroblasti con difetti OXPHOS geneticamente determinati

Verificare se l’ossigrafia su microscala potesse svelare la presenza di difetti in fibroblasti con normale attività biochimica spettrofotometrica, ma derivati da soggetti con difetto biochimico presente nel muscolo

Ridurre il numero di cellule necessarie per la definizione biochimica e l’inquadramento diagnostito del paziente.

6 pazienti con difetto Complesso I :Difetto biochimico muscolo 5/6Difetto biochimico fibroblasti 3/6

3 pazienti con difetto Complesso III :Difetto biochimico muscolo 2/3Difetto biochimico fibroblasti 1/3

6 pazienti con difetto Complesso IV :Difetto biochimico muscolo 4/6Difetto biochimico fibroblasti 5/6

19 linee di fibroblasti geneticamente determinati

4 pazienti con difetto Complesso V :Difetto biochimico muscolo 2/4Difetto biochimico fibroblasti 2/4

0

0,002

0,004

0,006

0,008

0,01

0,012

OC

R (

pM

ole

sO2/

min

/cel

ls)

control P1 P2

**

*

control

P1

P2

OC

R (

pM

ole

sO2/m

in)

Time (min)

4

5

9

FCCPOligo

Profilo OCR dopo aggiunta oligomicina e FCCP

1) Maximum respiration rate (MRR) viene calcolata come respirazione massima dopo aggiunta di FCCP (OCR-F)

2) Respiratory control ratio (RCR) viene calcolato come il rapporto tra OCR-F/OCR-O

3) Il metabolismo glicolitico rispetto a quello ossidativo viene calcolato come rapporto tra OCR/ECAR, in condizioni basali

4) Spare respiratory capacity viene misurata come differenza tra OCR-F and OCR in condizioni basali

Parametri di disfunzione mitocondriale

MRR in difetti di Complesso I

P1ND3 P2ND3 P3ND5 P4NDUFV1 P5NDUFA10 P6NDUFS1

mtDNA mutations Nuclear DNA mutations

0

20

40

60

80

100

120

140

160

% M

RR

*

**

*

**

****

C

P1-P3-P4 avevano attività spettrofotometriche normali

%C

I A

cti

vit

y

MRR in difetti di Complesso III

0

20

40

60

80

100

120

140

160

C P7 P8 P9

% M

RR

BCS1 mutations

** * **

0

20

40

60

80

100

120

140

160

P8-P9 avevano attività spettrofotometriche normali%

CII

I A

cti

vit

y

MRR in difetti di Complesso IV

0

20

40

60

80

100

120

140

160

C P10 P11 P14P13P12 P15

% M

RR

SURF1 SCO2COX15 COX6B1

**

** *** **

**

0

20

40

60

80

100

120

140

160

P14 aveva attività spettrofotometriche normale

%C

IV A

cti

vit

y

MRR in difetti di Complesso V da mutazioni in mtATP6

0

20

40

60

80

100

120

140

160

C P16 (8993T>G)

P17(8993T>C)

% M

RR

*

**

0

20

40

60

80

100

120

140

160

P18(TMEM70)

*

P19(TMEM70)

*

%C

V A

cti

vit

y

P16 e P17 avevano attività spettrofotometriche normali

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

SRC MRR RCR

controlsCICIIICIVCV

esti

mate

d m

arg

inal m

ean

s

esti

mate

d m

arg

inal m

ean

s

-1,0

OCR-B OCR-O OCR-F

controlsCICIIICIVCV

2,0

1,5

1,0

0,5

0

-0,5

controls

95

%C

on

f.In

t.

Normal Enzyme

Activities

0

1

2

3

4 Defective Enzyme

Activities

Vantaggi Limiti

SeaHorse XF96

Aumento sensibilitàRidotto numero di celluleRapidità e semplicitàMisurazioni in condizioni fisiologiche Le cellule rimangono vitali dopo le misure

Molti reagenti e substrati non entrano nelle cellule se non permeabilizzate: non si può stabilire quale complesso respiratorio è difettivo I risultati non sono di semplice interpretazione

Un nuovo agente permeabilizzante in difetti di Complesso I Glutamate (10mM)/Malate (5mM)

ADP (4mM)

Rotenone (2M)

Ct

Pt1Pt2

Un nuovo agente permeabilizzante in difetti di Complesso I Succinate (10mM)

ADP (4mM)

Antimycin (2M)

Ct

Pt1Pt2

Analisi di linkage e mappaggio per omozigosi

Identificazione geni candidati

Identificazione di geni-malattia: il vecchio metodo

Famiglie con malattie mitocondriali autosomiche recessive

Screening mutazionale

La ricerca di geni malattia: il nuovo approccio

EXOME SEQUENCING

Filtraggio e selezione dei geni candidati+ validazione patogenicità delle mutazioni

Pazienti singoli e piccole famiglie

EXOME SEQUENCING

Strategia per sequenziare selettivamente le regioni codificanti del genoma:ESOMA

L’esoma rappresenta l’insieme di tutte le sequenze esoniche del genoma umano

L’esoma costituisce circa 1% del genoma (30 MB) e dovrebbe contenere circa l’85% delle mutazioni associate a patologia

Consente di identificare le variazioni di sequenza a carico di potenziali geni-malattia

Exome sequencing: come funziona

E’ necessario sequenziare specifici frammenti di DNA costruendo una library arricchita per le regioni di interesse

Il DNA genomico viene frammentato

Vengono attaccati dei linker per il sequenziamento successivo

Filtraggio varianti identificate

Pannelli di riferimento1000 Genomes Project

Conservazione e patogenicità del cambio aa

Geni codificanti per proteine mitocondriali

Validazione patogenicità delle varianti

L’exome sequencing di un singolo campione di DNA produce circa 25000 varianti

Come fare per identificare la specifica mutazione responsabile della patologia??

EXOME SEQUENCING

Vantaggi

Applicazioni su casi singoli o su piccole famiglie

Mantiene una buona copertura delle sequenze di interesse

Costi più contenuti rispetto all’analisi dell’intero genoma

Tecnica di screening molto efficiente che consente di identificare geni responsabili di malattia

Limiti

Rileva solo le varianti presenti nella regione codificante dei geni

Non rileva le varianti strutturali e non codificanti associate a patologia (99% del genoma non è analizzato)

Delezioni/duplicazioni di interi esoni non vengono identificate

L’analisi statistica di un’ampia mole di dati può essere difficoltosa

Ci sono criticità legate alla presenza di falsi positivi e falsi negativi

EXOME SEQUENCING

2008 2009 2010 2011 2012

EXOME SEQUENCING n. pubblicazioni

EXOME SEQUENCING & MITO n. pubblicazioni

2010 2011 2012

4 pazienti diagnosticati

3 pazienti diagnosticati

EXOME SEQUENCING: 8 pazienti analizzati 5 casi risolti1 in corso di validazione2 negativi

11 pazienti diagnosticati

2 pazienti diagnosticati

Ricerca medica=Ricerca per il paziente

KOKO

WTWT

Funzione proteina?

modelli in vitro & in vivo

bioinformatica

Dal paziente

Al bancone

Identificazione di nuovi geni-malattiaEXOME SEQUENCING

Inquadramento clinico e biochimico