PCR real time nel monitoraggio dell’infezione da BKV

V.Salotti e A.Azzi

BK virus nelle urinedopo ultracentrifugazione

La scoperta di BKV

Gardner SD, Field AM, Coleman DV, Hulme B.

New human papovavirus (B.K.) isolated from urine after renal transplantation.

Lancet 1971

Infezione da BKV

• Infezione primaria

• Latenza

• Riattivazione

Prima infanziaVia respiratoriaRene trapiantato

renelinfociticervello…..

Tratto urinario

viruria

Infezione da BKV: eziopatologia

• Soggetti immunocompetenti

• Trapiantati di midollo• Trapiantati renali

• AIDS

• asintomatica

• Cistite emorragica• Stenosi ureterale

• Meningite, infezione disseminata …..

•Interstitial nephropathy (PVAN)

•Tumori ?

Ricerca del DNA virale PCR qualitativa Nelle urine

• Soggetti sani 17 %• gravidanza 15 %• Trapiantati di midollo 77 %• AIDS 40 %• Trapiantati rene [25 %]

Nei linfociti• Soggetti sani 53 %• Trapiantati di midollo 57.5 %• AIDS 62.5 %

Ricerca del DNA di BKV nel plasma /siero

• La presenza di virus libero in circolo nei trapiantati di rene è considerata un indicatore di patologia renale BKV –associata.

• Livelli significativi da definire

Organizzazione del genoma dei polyomavirus

•

PCR qualitativa per DNA di BKV

PCR quantitativa competitiva per BKV

• L’estrazione dei campioni

• La sintesi del competitore

• La calibrazione del competitore

• La reazione

• La rivelazione

Sintesi del competitore

• Mutagenesi sito-specifica/hot start PCR• NcoII: 5’TATTTTGCCATGGAGATATG 3’

• NcoI: 5’CATATCTCCATGGCAAAATA 3’

• Enzima NcoI• ccatgg• ggtacc•

PEP 1

target TA

sequence

Nco II

Nco I PEP 2Mutagenesis obtained with the primer Nco II G

CGC

Mutagenesis obtained with the primer Nco I

5’5

’ 3’3

’

Denaturation and Rinaturation

Extension with the primers PEP5’ 5

’standard

Fig.. 1 PCR site-directed mutagenesis.

• Mix + Taq gold

• 5 l estratto campione urina

• 40 fg – 200 fg – 1 pg – 5 pg – 25 pg competitore

PCR quantitativa competitiva per DNA di BKV: la rivelazione

Quantificazione dei prodotti della PCR

• Software Molecular Analyst (Bio-Rad)

• y

• .Y= OD banda comp x 1.88

• OD banda campione .• .• .• x• log[conc competitore]

• calcolo retta di regressione e coefficiente di regressione lineare

Trapiantati di midolloCistite emorragica Carica virale nelle urine

PCR quantitativa competitiva

PCR quantitativa competitiva per BKV

• Limiti– Tempi– Costi– Manualità– Sensibilità– riproducibilità