Protocollo di Real-Time RT-PCR per la diagnosi del … di 1 gr. di nervature con sabbia e tampone...
Transcript of Protocollo di Real-Time RT-PCR per la diagnosi del … di 1 gr. di nervature con sabbia e tampone...
Protocollo di
Real-Time RT-PCR
per la diagnosi del fitoplasma della
Moria del Pero
Claudio Ratti, Chiara Lanzoni e Carlo Poggi Pollini
Moria del pero
(Candidatus Phytoplasma pyri)
Genoma a DNA:
cromosoma relativamente piccolo
(530-1200 kbp)
Genoma virale: 1,8-350 kbp
E. coli: 4.000 kbp
Fitoplasmi:
Microrganismi procarioti
unicellulari che, a differenza dei
batteri, non possiedono pareti
cellulari e che si possono
sviluppare esclusivamente su
tessuto vivo d’un ospite.
primers DNA polimerasi
DNA da amplificare
1955 A. Kronembreg e coll.
(Stanford University)
Scoperta della DNA-polimerasi cellulare
Basata sulla sintesi della catena complementare di DNA ad
opera di un’enzima (la polimerasi) in una reazione a catena (PCR
= polymerase chain reaction).
- Diagnosi molecolare
APERTURA
DOPPIA
ELICA DEL
DNA
LEGAME
DEI
PRIMERS DI
INNESCO
DUPLICAZIONE
DEL DNA
STAMPO
1983 Kary.B. Mullis utilizzò la DNA polimerasi in una
reazione di polimerizzazione ciclica: la PCR
Premio Nobel per la Chimica nel 1993.
IL MECCANISMO DELLA PCR:
1) Denaturazione a
94°C
2) Appaiamento dei
primers a 50-60°C
3) Estensione a
72°C
GLI STEP DELLA PCR:
PrimersDNA polimerasi
ELEMENTI NECESSARI PER LA REAZIONE DI
AMPLIFICAZIONE
DNA STAMPO
DESOSSIRIBOSIO
Base Azotata
(Adenina, Timina,
Citosina, Guanina, Uracile)
Desossi Nucleotidi trifosfati
(dNTP)
GLI «INGREDIENTI» FONDAMENTALI DELLA PCR:
Primers:corte sequenze di DNA complementari alle 2
estremità del framento da amplificare
dNTPs (dATP,dGTP,dCTP,dTTP):
nucleotidi trifosfati,
‘mattoni’ per costruire i nuovi filamenti
Taq polimerasi
(buffer, MgCl2):
enzima (DNA polimerasi) che compie la reazione
DNA stampo:Squenza bersaglio
LA REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI
(POLIMERASE CHAIN REACTION)
Per i virus il cui genoma è costituito da RNA, si utilizza la
trascrittasi inversa, che consente la sintesi di un primo filamento di
DNA (cDNA) sul quale si innesca la reazione a catena della
polimerasi
Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction(RT-PCR)
--
Bassa concentrazione del Fitoplasma nella pianta:
NESTED – PCR (nPCR)
DNA TARGET
5’ 3’
Primo step:
Primers Esterni
aumento della sensibilità, riduzione degli inibitori
Secondo Step:
Primers Interni
I AMPLIFICATO
II AMPLIFICATO
RIVELAZIONE ED ANALISI DEL PRODOTTO DI AMPLIFICAZIONE
Nested-PCR
Tecnica molto sensibile ma può presentare diverse
limitazioni, in particolare nell’esecuzione di saggi su
larga scala:
molto laboriosa con alto dispendio di tempo;
rischio di contaminazioni molto elevato.
Multiplex Real-Time PCR
È possibile monitorare in ogni istante la cinetica della reazione di
PCR mediante il rilevamento di una fluorescenza
Si riesce a misurare l’amplificazione in tempo reale durante la fase esponenziale
della PCR, quando cioè l’efficienza di amplificazione è influenzata
minimamente dalle variabili di reazione, permettendo di ottenere risultati
quantitativi molto più accurati rispetto alla PCR tradizione “end point”.
Real-Time PCR: Caratteristiche
Il prodotto di PCR non viene analizzato su gel di
agarosio
Analisi del prodotto di fluorescenza tramite computer
Rilevamento della fluorescenza associata
all’amplificazione
Real-Time PCR: Caratteristiche
LightCyclerRoche
7700Applied Biosystems
Mx3000P® QPCR SystemSTRATAGENE
Mx4000® Multiplex Quantitative PCR System
STRATAGENE
Real-time nucleic acid detection system
LightCycler® 480 SystemRoche
iQ5 Real-Time PCR Detection SystemBio-Rad
7900HT Fast Real-Time PCR SystemApplied Biosystems
Bioneer
ABI PRISM 7000 SDS Applied Biosystem
Real-Time PCR: Caratteristiche
Baseline → il segnale di fluorescenza è accumulato ma è al di sotto del limite di
rilevazione dello strumento
Linea soglia → linea che interseca tutte le curve di amplificazione dei campioni
all’inizio delle fase esponenziale
Ciclo soglia (CT) → è la frazione di ciclo in cui la fluorescenza emessa attraversa
la linea soglia
Il valore che assume è INVERSAMENTE PROPORZIONALE alla
quantità iniziale di DNA
Rn indica la fluorescenza relativa calcolata dal software: Rnf - Rnb
Sistemi basati su primer o sonde marcate:
• Molecular Beacon
• Scorpion Primer
• LUX Primer
• Simple probe
• FRET hybridization probes
• Plexor Technology
Sistemi basati sull’idrolisi di sonde
• TaqMAN
Quasi tutti gli attuali sistemi Real Time PCR sono basati sull’emissione di un segnale
di fluorescenza direttamente proporzionale alla quantità di amplicone formato.
Classificazione chimiche di rilevazione
Sistemi basati su molecole leganti il doppio filamento di DNA:
•Etidio Bromuro
•SYBR Green
•BOXTO
CARATTERISTICA: presenza sonda.
– Oligonucleotide di circa 14-18 bp
– Ibridazione lungo la sequenza bersaglio
– Reporter al terminale 5’ e Quencher al terminale 3’
– Il terminale 3’ non può essere esteso dalla Taq Polimerasi
– Temperatura di dissociazione circa 10°C più elevata
rispetto alla coppia di primer usati nella reazione
TaqMAN
From PacMan to TaqMan - a computer game revisitedThe TaqMan process is based on the PacMan principle - a computer game introduced more than twenty years ago.
http://www.vetscite.org/issue1/tools/leute_2_0800.htm
Estrazione degli acidi nucleici
Estrarre gli acidi nucleici del fitoplasma + acidi nucleici della
pianta dai tessuti vegetali
Protocollo CTAB
Protocollo SPOT
Omogeneizzazione di 1 gr. di nervature con sabbia e
tampone Dellaporta (grinding buffer)
Centrifugazione a 4000rpm per 5 min a 4°C
Centrifugazione del sopranatante a 11000rpm per 25
min a 4°C
Risospensione pellet in tampone di estrazione Doyle &
Doyle, trasferimento in tubo Eppendorf e incubazione a
60°C per 30 min.
Aggiunta di cloroformio:alcol isoamilico (IAA) (24:1) e
centrifuga a 6000rpm per 5 min a RT
Precipitazione fase acquosa con 1 vol. di isopropanolo
freddo a -80°C per 15 min.
Centrifugazione a 13000rpm per 15 min a 4°C
Lavaggio del pellet con etanolo 70% e precipitazione
con sodio acetato (NaOAc) e etanolo assoluto a -80°C
per 10 min.
Centrifugazione a 13000rpm per 15 min a 4°C
Lavaggio del pellet con etanolo 70% e risospensione
con 100μl di acqua distillata sterile trattata con DEPC
(dietilpirocarbonato)
Protocollo di estrazione
CTAB
(5 h)
Protocollo di estrazione
SPOT
(15 - 20 min)
Macinare 1gr di floema in 5 mL di Tampone di estrazione
Caricare 5 uL di ogni campione omogeneizzato su dischetti
di nylon e asciugare
Aggiungere 100 uL di buffer di risospensione
Denaturare10 min a 95 C
Centrifugare le strip almeno 2 min.
Prelevare 2 uL e aggiungerli alla mix di Real Time.
Sonde e primers specifici per il fitoplasma della
Moria del Pero sono stati disegnati su una zona
variabile del gene 16S rDNA, utilizzando il
software Primer Express 2.0 (Applied Biosystem).
Sonde TaqMAN - PD
Controllo endogeno: primers e sonda disegnati
sul gene che codifica per la sub-unità 18S.
Marcate con due fluorocromi differenti
all’estremità 5’, per poterle usare simultaneamente
nella reazione.
Come ottimizzare la sensibilità della
diagnosi
• Diagnosi classica: amplificazione DNA del
Fitoplasma (nPCR, Real-Time PCR…)
• Il Fitoplasma (DNA) ha una bassa concentrazione
nella pianta.
• Il Fitoplasma produce un alto numero di copie di
RNA durante la propria moltiplicazione.
• L’RNA è indice di attività metabolica del
Fitoplasma
• Amplificare anche l’RNA del Fitoplasma per
aumentare la sensibilità della diagnosi
Multiplex Real-Time PCR: conclusioni
Alta specificità
Riproducibilità dei risultati
Alta sensibilità
Multiplex Real-Time RT-PCR:
Sistema “chiuso”: rischio di contaminazione molto
limitato e assenza di falsi positivi
Saggi molto rapidi: circa 1/4 del tempo richiesto
dai protocolli classici di nested-PCR
Presenza del controllo endogeno (18 S) rende il
metodo più affidabile: assenza di falsi negativi
La SPOT Real-Time RT-PCR risulta la tecnologia
ideale da applicare alla diagnosi del fitoplasma
della Moria del Pero, in particolare per analisi su
larga scala