Nuovo test in del e della - Sistema bibliotecario ticinese · Nuovo test di screening ... PCR...

Scuola SuperioreMedico Tecnica

Formazione Tecnico in Analisi Biomediche

Anno:2012‐2013

Nuovo test di screening

rapido per la messa in

evidenza dei micobatteri del

complesso tubercolare e della

resistenza alla rifampicina

nell’espettorato tramite

GeneXpert

Autore: Cuccu Luciana Maria

Sede: Ospedale Regionale di Mendrisio

Referenti: Dr.ssa Franca Baggi ‐ Dr.Franco Keller

AbstractIntroduzione: La tubercolosi si sta ripresentando interessando anche la Svizzera. Per i casi registrati in Ticino si tratta per lo più di immigranti soggiornanti nel Centro Asilanti di Chiasso la cui gestione è presa a carico dall’Ospedale Beata Vergine Mendrisio. Lo scopo di questo lavoro di diploma è rispondere all’esigenza di una diagnostica più veloce che migliori la gestione dei casi e aiuti il contenimento delle spese sanitarie, introducendo un nuovo test di screening rapido per la messa in evidenza dei micobatteri del complesso tubercolare, agenti eziologici della malattia.

Materiale e metodi: Sono stati analizzati 18 campioni tra: sedimenti di espettorato, lavaggi e aspirati, forniti dal Servizio di Microbiologia Eolab(SMIC), con GenExpert Dx System utilizzando il kit MTB‐Rif Xpert®. Il principio utilizzato dall’analisi è una PCR real‐time che permette la detezione dei micobatteri del complesso tubercolare e la resistenza alla rifampicina. I risultati ottenuti sono stati paragonati con i precedenti della microscopia diretta, della coltura e dove disponibile della PCR real‐time Roche utilizzati presso lo SMIC

Risultati Dal paragone dei risultati emerge che il nuovo test di screening rapido MTB‐Rif Xpert®è in grado dettetare la presenza del micobatteri del complesso tubercolare in tutti i casi con microscopia e coltura positiva costituendo un analisi con elevata sensibilità diagnostica. Rispetto alla PCR Roche è invece leggermente meno sensibile per via della soglia di detezione più alta. Non si presentano casi di falsi positivi.

Conclusioni Il test MTB‐Rif Xpert® proposto come screening rapido presenta un’ottima sensibilità diagnostica presentandosi adatto allo scopo diagnostico per cui era previsto,fornendo un primo risultato in meno di due ore. La validazione è riuscita e l’obiettivo è stato raggiunto.

Introduction:

Tuberculosis disease is coming back, also in Switzerland. In Ticino the majority of registered cases are found among immigrants that stay in the center for asylum seekers in Chiasso. These tuberculosis cases are principally treated by the Regional Hospital of Mendrisio. The purpose of this Diploma Work is improve the management of these disease cases and help to contain the healthcare costs, by introducing a new rapid screening test that can detect the m. tuberculosis complex and also the Rifampicina resistance.

Materials and methods 18 different samples of: sputum sediment, washing and aspirations , supplied by the microbiology service of Eolab,were analyzed with GenExpert Dx System using the kit MTB‐Rif Xpert. Employing PCR real‐time, this test detected the presence of m. tuberculosis complex and also mutations that cause a Rifampicina resistance. Rifampicina is an antibiotic used in the treatment of tuberculosis disease. The results obtained with this new test were finally compared with the previous results from direct microscopy, culture and Roche PCR made use of by the microbiology service of Eolab.

Results By comparing the results it can be seen that this new rapid screen test detected the presence of m. tuberculosis complex every time that is positive in microscopy and culture, showing an high diagnostic sensitivity. It is slightly less sensitive in comparison to PCR Roche because of the higher detection threshold. No false negative case were found.

Conclusion The MTB‐Rif Xpert®test can well be used as a screening test because it has an high diagnostic sensitivity, demonstrating its suitability for the use for which it was planned. With this test it’s now possible to have a first result in less than 2 hours and so the aim of the study was reached.

SommarioAbstract ................................................................................................................................................... 0

1 Introduzione: ................................................................................................................................... 2

1.1 I micobatteri: agente eziologico della tubercolosi .................................................................. 2

1.2 Classificazione dei micobatteri ................................................................................................ 3

1.3 La Tubercolosi ......................................................................................................................... 3

1.3.1 Scoperta .......................................................................................................................... 3

1.3.2 Vie di trasmissione .......................................................................................................... 3

1.3.3 Fasi cliniche della malattia .............................................................................................. 4

1.3.4 Complicazioni della tubercolosi ...................................................................................... 4

1.4 Epidemiologia della tubercolosi .............................................................................................. 6

1.4.1 Incidenza ......................................................................................................................... 6

1.4.2 Mortalità .......................................................................................................................... 6

1.4.3 Trattamento .................................................................................................................... 7

1.4.4 Resistenze antibiotiche della tubercolosi ........................................................................ 7

1.4.5 La tubercolosi nel territorio svizzero ............................................................................... 7

1.4.6 Rischio di contrarre la tubercolosi .................................................................................. 8

1.5 Diagnostica .............................................................................................................................. 9

1.5.1 Biosicurezza ..................................................................................................................... 9

1.5.2 Test diagnostici classici .................................................................................................. 10

1.5.3 Altri test ......................................................................................................................... 13

1.5.4 Test molecolari .............................................................................................................. 13

2 Motivazione della scelta del lavoro di diploma ............................................................................. 15

3 Obiettivo ........................................................................................................................................ 15

4 Test MTB‐RIF Genexpert ............................................................................................................... 16

4.1 Cappa a flusso laminare ........................................................................................................ 16

4.2 GeneXpert ............................................................................................................................. 17

4.3 Descrizione dell’analisi .......................................................................................................... 17

4.4 PCR real‐time ......................................................................................................................... 18

4.5 Regione di resistenza per la rifampicina ............................................................................... 19

5 Materiali e metodi ......................................................................................................................... 20

5.1.1 Campioni clinici ............................................................................................................. 20

5.1.2 Materiali non forniti nel kit ........................................................................................... 20

5.1.3 materiale del kit ............................................................................................................ 21

5.2 Controlli di qualità ................................................................................................................. 21

Lavoro di diploma 2013 Cuccu Luciana Maria SSMT‐TAB3

1

5.3 Principio della procedura ...................................................................................................... 21

5.4 Procedimento ........................................................................................................................ 21

5.5 Lettura del risultato ............................................................................................................... 23

5.6 Limitazioni del metodo .......................................................................................................... 25

5.7 Sensibilità rispetto al Gold Standard ..................................................................................... 25

5.8 Sensibilità analitica ................................................................................................................ 25

6 Validazione .................................................................................................................................... 25

7 Risultati .......................................................................................................................................... 26

7.1 Discussione ............................................................................................................................ 26

7.2 Conclusioni ............................................................................................................................ 28

8 Bibliografia .................................................................................................................................... 29


2

1 Introduzione:

1.1 Imicobatteri:agenteeziologicodellatubercolosi

Il Mycobacterium è un microrganismo della famiglia delle Mycobateriacee. Esistono oltre 20 specie

di micobatteri patogeni per l’uomo; alcune sono considerate sempre patogene altre sono patogene

opportunisticamente, spesso in pazienti immunocompromessi, ed infine specie saprofitiche che

sono per lo più micobatteri ambientali, raramente patogene per l’uomo. Questi microrganismi

hanno una forma bacillare, sono lunghi da 2 a 4 µm e larghi da 0,2 a 0,4 µm. Si possono rilevare

delle variazioni morfologiche dovute a influssi esterni come la coltura, dove i micobatteri hanno la

tendenza ad accorciarsi ed assumere una forma piuttosto cocco‐bacillare, mentre quelli estratti da

pazienti con prolungato trattamento spesso si ritrovano frammentati come a formare delle

catenelle di granuli. Hanno un metabolismo aerobio e microaerofilo, necessitano solo di piccole

quantità di ossigeno per la sopravvivenza. Essendo batteri immobili non sono in grado di muoversi;

sono anche sprovvisti di capsula e non sono in grado di produrre spore. Le caratteristiche principali

che li distinguono sono:

Lentezza replicativa:

il loro ciclo replicativo ha la durata di circa 20 ore, tempo in cui un comune battere come l’E.coli

raggiunge 4000 copie circa. Questa sua caratteristica spiega quindi la tempistica molto lunga per la

sua coltura. Bisogna comunque accennare l’esistenza di alcuni micobatteri a crescita più rapida, che

non hanno particolari esigenze nutritive e sono in grado di crescere anche su terreni aspecifici.

Composizione ad alto contenuto lipidico:

essi sono ricchi di fosfolipidi, acidi micolici e cere, quasi tutti legati a proteine e polisaccaridi. Lo

strato di peptidoiglicano cui sono legati polisaccaridi a lunga catena può causare la formazione di

granulomi. I fosfolipidi contribuiscono alla formazione di necrosi caseose ed il fattore cordale

presente in alcuni micobatteri costituisce un fattore di virulenza che è in grado d’inibire la

migrazione dei neutrofili.

L’alcool‐acido resistenza:

questa caratteristica è dovuta all’elevata quantità di lipidi della membrana batterica. I micobatteri

non si colorano bene con la colorazione di Gram, mentre trattengono molto bene coloranti acquosi

in soluzione di fenolo. Il fenolo ha la funzione di facilitare l’entrata dei coloranti nella parete

cellulare. Tali coloranti a base fenolica non vengono eliminati dal trattamento decolarante con

miscela alcol‐acido. (1)


3

1.2 Classificazionedeimicobatteri

All’interno della grande famiglia dei micobatteri si applica una principale distinzione che ha lo scopo

di dividere i micobatteri in grado di causare una tubercolosi e quelli che non sono in grado di

causare tale malattia. Si hanno quindi secondo la classificazione del Bergey’s Manual due principali

categorie:

‐ Micobatteri del complesso tubercolare (M.tubercolosis complex)

M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis B.C.G.(ceppo vaccinale) ,M.caprae, M. africanum e M.pinnipedi.

‐ MOTT (Mycobacteria Other Than Tuberculosis)

Anche chiamati atipici ovvero micobatteri diversi da quelli del complesso tubercolare. Fra i MOTT

sono di particolare interesse clinico: il M. leprae che causa la lebbra; i M. avium complex

responsabili d’infezioni polmonari e linfoadeniti, il M. kansasii responsabile anch’esso d’infezioni

con localizzazioni polmonari ed altre sedi, ed infine il M. marinum che crea ulcerazione e lesioni

superficiali cutanee. Per i MOTT vi è un’altra classificazione: la Runyon che fa capo a caratteristiche

cromogene e di velocità di crescita. (1)

1.3 LaTubercolosi

1.3.1 Scoperta

Fu il biologo tedesco Robert Koch a scoprire la tubercolosi, da egli deriva anche la seconda nomina

attribuita al M. tubercolosis: “bacillo di Koch”. Ne annunciò la scoperta il 24 marzo del 1882. Lo

identificò, dopo diversi tentativi di colorazioni su un espettorato di un paziente affetto da

tubercolosi e mediante osservazione al microscopio ne scopri la forma bacillare. Egli fu anche in

grado di isolarlo e coltivarlo per estrarne successivamente la proteina della tubercolina. Fu così lui a

scoprire che l’agente eziologico della tubercolosi era il micobatterio.

1.3.2 Vieditrasmissione

La trasmissione della tubercolosi avviene principalmente per via aerogena. Per infettarsi un

individuo deve inalare particelle di aerosol contenti i bacilli tubercolari. La diffusione di tali

particelle avviene attraverso colpi di tosse, starnuti emessi da una persona infetta ed infettiva,

quindi portatrice di una tubercolosi “aperta” e perciò in grado di trasmetterla. La prova di una

tubercolosi aperta è costituita dalla presenza di micobatteri nell’espettorato. Ovviamente se i

micobatteri presenti nell’espettorato sono morti, come può capitare in pazienti già trattati e guariti,

il pericolo d’infettarsi venendo in contatto con essi è nullo. Le particelle tubercolari quindi,

fluttuano sospese nell’aria in goccioline di 1‐5 µm e possono essere inalate da altri individui sani.

Queste goccioline una volta inalate raggiungeranno gli alveoli del nuovo ospite.


4

La probabilità di essere infettati dipende principalmente dalla concentrazione di micobatteri

nell’aria dal tempo d’esposizione e dalla situazione immunitaria della persona che viene in contatto

con queste particelle. (2)

1.3.3 Fasiclinichedellamalattia

Una volta che i micobatteri inalati raggiungono il parenchima alveolare danno una lesione di tipo

essudativo dove i macrofagi alveolari fagociteranno i micobatteri(risposta immunitaria aspecifica). Se

questo tipo di lesione non riesce ad evadere il sistema immunitario andrà incontro ad una guarigione

spontanea senza conseguenze.

L’infezioneprimaria: si sviluppa invece quando la sola risposta immunitaria aspecifica non riesce a

risolvere l’infezione. Così raggiunto un certo numero di macrofagi infetti, in cui i micobatteri riescono

a sopravvivere protetti dalla loro parete, tra la seconda ed ottava settimana dal contagio, entra in

atto la risposta immunitaria cellulo‐mediata che porta alla formazione del granuloma. Il granuloma è

strutturato in: una parte centrale formata da cellule giganti polinucleate che contengono i

micobatteri fagocitati, poi vi è una parte intermedia costituita da cellule epiteliodi disposte a raggiera

che fungono da isolamento della parte centrale, ed infine il tutto è avvolto da uno strato periferico di

fibroblasti, linfociti e monociti. Quando successivamente lo strato periferico viene avvolto da tessuto

fibroso e la zona centrale incorre in necrosi caseosa, questa struttura prende il nome di tubercolo. A

questo punto il tubercolo può rimanere circoscritto ed andare incontro a calcificazione, contenente

ancora all’interno micobatteri in grado di riattivarsi anche a distanza di anni; oppure la necrosi

caseosa può fuoriuscire per via della rottura del tubercolo e dare luogo ad una cosi detta cavità

tubercolare. Queste due strutture sono diagnosticabili con una radiografia toracica.

L’infezionepost‐primariaoriattivazione: può essere causa di reinfezione esogena da un nuovo

ceppo, riattivazione di micobatteri tubercolari del complesso primario oppure riattivazione di

granulomi formatisi nell’infezione primaria. I sintomi sono una continua tosse per settimane o mesi,

spesso nei fumatori passa inosservata. A livello di laboratorio segnali tipici che dovrebbero far

pensare ad tubercolosi sono: un aumento della proteina C‐reattiva, una leucocitosi spesso

accompagnata da monocitosi ed uno stato anemico. (2)

1.3.4 Complicazionidellatubercolosi

Le complicazioni che si possono verificare in seguito ad una tubercolosi sono:

Latubercolosiextra‐polmonare: ha una frequenza maggiore nei bambini piuttosto che negli

adulti. Si tratta di una delocalizzazione dei batteri tubercolari, spesso per via ematica o linfatica, che

raggiungendo altri organi possono dare luogo a queste forme particolari di tubercolosi.


5

Le tipiche forme di tubercolosi extra‐polmonari sono:

‐ Linfadenite tubercolare caratterizzata da ingrossamento spesso indolore dei linfonodi. Si

manifesta principalmente nei linfonodi cervicali e sottomandibolari e meno frequente quelli

della zona mediastinica e retroperitoneale.

‐ Tubercolosi pleurica dovuta dalla diffusione d’un infiltrato polmonare, a volte la diffusione

raggiunge la pleure per via ematica.

‐ Tubercolosi urogenitale non sempre causa di una tubercolosi primaria. Infatti nel

trattamento del carcinoma vescicale viene usato il M. B.C.G del ceppo vaccinale che favorisce

la desquamazione dell’epitelio vescicale riducendo l’entità del tumore. In questo caso si

tratta di una tubercolosi urogenitale terapeutica indotta e che non è conseguenza di una

tubercolosi primaria con delocalizzazione.

‐ Tubercolosi ossea più frequente nei pazienti anziani

‐ Meningite tubercolare anch’essa delocalizzazione del battere. Come sintomo della patologia

si manifesta febbre ed alterazione rapida dello stato generale del paziente

Latubercolosimiliare: è una forma di tubercolosi

extra‐polmonare molto particolare con prognosi

negativa, con difficile risoluzione anche con

trattamento. Colpisce soprattutto persone con un

sistema immunitario indebolito. Prende il nome

“miliare” perché la caratteristica di tale malattia è un

polmone che nella radiografia si presenta tappezzato

di numerosi piccoli granuli della grandezza di un

chicco di miglio. A causa di una mancata risposta

immunitaria efficiente i micobatteri riescono a

raggiungere le vie linfatiche ed attraverso esse

giungono nei linfonodi ed in tutto l’organismo. Si

può parlare di una sorta di setticemia tubercolare

con conseguenze gravissime per il paziente. Nella radiografia di fianco sono ben evidenziabili i

numerosi focolai che si sono formati a causa di questa diffusione batterica. (2)

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1.5 Diagnostica

1.5.1 Biosicurezza

Prima di parlare concretamente dei vari test diagnostici è importante interrogarsi sulle misure di

sicurezza da intraprendere all’interno del laboratorio. Trattare materiale infetto da micobatteri del

complesso tubercolare richiede l’utilizzo di misure di sicurezza diverse rispetto al normale

trattamento di materiale biologico per la determinazione indiretta della malattia tramite sierologia.

I batteri vengono suddivisi in quattro classi di rischio:

Agente biologico di gruppo 1

(nessuno o basso rischio individuale e

collettivo)

Un agente che con poca probabilità è causa di malattie nell’uomo

o negli animali.


(moderato rischio individuale, limitato

rischio collettivo)

Un agente patogeno che può causare malattie nell’uomo o negli

animali, ma che è poco probabile che costituisca un serio pericolo

per chi lavora in laboratorio, per la comunità, per il bestiame e per

l’ambiente. Le esposizioni in laboratorio possono causare

patologie, ma sono disponibili trattamenti efficaci e misure

preventive e il rischio di diffusione è limitato.


(elevato rischio individuale, basso rischio

collettivo)

Un agente patogeno che usualmente causa gravi patologie

nell’uomo o negli animali e costituisce un serio rischio per i

lavoratori. Difficilmente si propaga nella comunità e comunque

sono disponibili efficaci misure terapeutiche e preventive.


(elevato rischio individuale e collettivo)

Un agente patogeno che normalmente provoca gravi patologie

nell’uomo e negli animali, costituisce un serio rischio per i

lavoratori e può propagarsi rapidamente nella comunità. Non sono

di norma disponibili efficaci misure terapeutiche e preventive.

Il micobatterio fa parte della classe III della classificazione degli agenti biologici a rischio d’infezione.

Un battere di classe III può causare malattie gravi in soggetti umani e costituisce un serio rischio per i

lavoratori; l’agente biologico può propagarsi nella comunità, ma di norma sono disponibili efficaci

misure profilattiche o terapeutiche. Dopo questa classe ne segue solo una: la quarta con rischi

maggiori, dove sono classificati microrganismi che causano malattie per cui odiernamente non sono

disponibili cure, come ad esempio l’HIV. Si deve quindi pensare al livello di biosicurezza d’applicare

nel laboratorio diagnostico. Per il trattamento di espettorati senza coltura basta un livello di

biosicurezza 1 o 2, come sono attrezzati già il laboratori dell’Ente, quindi anche quello dell’Ospedale

Regionale di Mendrisio.


10

Solo in caso di coltura sarà necessario avere un livello di biosicurezza 3 che prevede un’aria dedita

solo per tali manipolazioni con accesso controllato , ventilazione a pressione negativa senza riciclo

d’aria, cappe di sicurezza come il livello due. (4)

1.5.2 Testdiagnosticiclassici

Di regola uno dei primi esami diagnostici che si esegue davanti ad un sospetto di tubercolosi è la

radiografia polmonare accompagnata da esami di batteriologia.

La radiografia polmonare permette di identificare alterazioni polmonari ed indurre quindi a

proseguire l’indagine medica. Generalmente l’immagine radiologica positiva va di pari passo con la

successiva identificazione della presenza di micobatteri tubercolari nella batteriologia. Le lesioni

tipiche riscontrabili sono le caverne e le lesioni da tubercolosi miliare. A causa delle lesioni

aspecifiche, che possono esserci anche se non si tratta di tubercolosi, essa non può costituire da sola

un mezzo diagnostico.

La batteriologia si base sull’esaminazione di materiale clinico sospetto per presenza di micobatteri. I

materiali indagati sono molteplici. Si tratta principalmente di espettorato spontaneo o indotto, ma si

può eseguire una ricerca di micobatteri su liquido di lavaggio ed aspirato bronchiale, urina, puntati,

secreti, pus, dializzato, linfonodi, liquor, succo gastrico (tipicamente nei bambini),biopsie, feci,

sangue e midollo osseo. I materiali non sterili dovranno subire un processo di decontaminazione ed

arricchimento prima di essere inseminati su terreni di cultura. I campioni dovranno subire dei

pretrattamenti. Questi pretrattamenti sono: la decontaminazione e la digestione:

‐ La fluidificazione che consiste nel sciogliere lo sputo in modo da ottenere un campione più

fluido e meglio maneggiabile. Generalmente si usa della sputolisina.

‐ La decontaminazione prevista per i materiali che in origine non sono sterili per la presenza

della flora batterica residente.

‐ La risospensione dopo centrifugazione in tampone fosfato

Il materiale può essere anche concentrato tramite centrifugazioni. Una volta fissato il materiale sul

vetrino si potrà procedere con le colorazioni. (2)

Microscopia delle colorazione dei micobatteri

A causa dell’alcol‐acido resistenza, non si utilizza la colorazione di Gram per identificare

microscopicamente i micobatteri. Sono necessarie delle colorazioni speciali Attualmente al servizio

di microbiologia Eolab sono utilizzate due colorazioni specifiche per questo tipo di batteri: Ziehl‐

Nielsen ed auramina.


11

‐ Colorazione Ziehl‐Nielsen:

mette in evidenza i bacilli alcol‐

acido resistenti. Viene adagiata la

soluzione di fucsina sul vetrino e

successivamente scaldando a

fiamma il preparato si creano dei

pori nella parete dei micobatteri e il

colorante riesce cosi a penetrare

nella parete batterica. Segue una

decolorazione con alcol‐acido e una

colorazione di contrasto con blu di metilene. I batteri alcol‐acido resistenti risulteranno colorati di

rosso, mentre i batteri che non possiedono tale resistenza assumeranno una colorazione blu come

si vede dall’immagine accanto.

‐ Colorazione fluorocromica con Auramina:

questa è una colorazione in fluorescenza. I

preparati andranno dunque osservati

sotto microscopio a fluorescenza. Il limite di

questa tecnica è la rilevabilità a

concentrazioni di almeno 10’000 bacilli

per millilitro. Con questa colorazione i

bacilli risulteranno colorati di giallo su uno

sfondo nero, mentre gli altri batteri non

saranno visibili (microscopio a

fluorescenza).

Il vantaggio della colorazione ad auramina è che aumenta la possibilità di visualizzare anche pochi

micobatteri poiché solo loro emettono fluorescenza mentre la flora residente,che è presente

normalmente negli espettorati,non emettendo fluorescenza, non costituisce intralcio nella

visualizzazione.

Nell’osservazione microscopica dei preparati colorati con le colorazioni sopracitate si darà un valore

in base alla quantità di micobatteri riscontrabili: pochissimi, pochi, alcuni, numerosi e numerosissimi.

Questo valore costituisce il risultato dell’analisi microscopica.

Figura3:http://www.oocities.org/gbruno_2000/mico.htm

Figura4:http://www.lung.ca/tb/images/full_archive/107_bacillus.jpg


12

Coltura:

è complementare all’osservazione microscopica sia perché la coltura permette la valutazione di

vitalità dei micobatteri sia perché se la quantità di micobatteri presenti nell’espettorato fosse cosi

bassa da non essere visibile nella microscopia in coltura moltiplicandosi sarebbe evidenziabile la loro

presenza. Si possono verificare casi in cui campioni con una microscopia negativa siano positivi per la

coltura.

Esistono terreni di coltura:

‐ Solidi: tubi contenti il terreno. Vengono utilizzati due tipi differenti di terreni: il Löwenstein‐

Jensen ed il Colestos. Una volta inseminati i terreni vengono incubati a 37° per otto

settimane in posizione orizzontale, per favorire l’inseminazione dell’intera superfici. I tappi a

vite dei tubi vengono aperti leggermente per far entrare l’anidride carbonica (che è presente

tramite bombola nell’incubatore) poiché ne favorisce la crescita dei micobatteri.

‐ Liquidi: contengono antibiotici con arricchimento di crescita. L’antibiotico aiuterà a non far

crescere rimasugli della flora residente. Questi tubi di terreno liquido vengono incubati in un

apparecchio, il MGIT, il quale con lettura fotometrica segnalerà la presenza di una crescita

nelle successive otto settimane d’incubazione.

Il MGIT viene utilizzato anche per testare le sensibilità antibiotiche dei micobatteri resistenti. Il

principio di lettura è sempre fotometrico.

La coltura può positivizzarsi anche dopo una settimana, tutto dipende dalla quantità di micobatteri

inseminati e dalla loro vitalità e velocità di crescita. Per ogni coltura positiva viene poi effettuata una

colorazione di Gram ed un Ziehl‐Nielsen per essere certi di avere una crescita micobatterica ed

escludere un’eventuale crescita di altri batteri che si trovavano nel materiale, flora residente del

luogo di prelievo del campione. Crescite aspecifiche saranno comunque di rilevanza clinica nel caso il

materiale di partenza doveva presentarsi fisiologicamente sterile. I test di sensibilità agli antibiotici

vengono effettuati sempre tramite MGIT. Il MGIT è un apparecchio che funziona come incubatore a

37°C per le provette contenti i campioni in coltura liquida; esso è in grado di rilevare l’anidride

carbonica prodotta dall’utilizzo di ossigeno dei micobatteri poiché marcata radioattivamente.

Quando si trova la coltura positiva si può procedere anche ai test di resistenza antibiotica sempre

tramite MGIT. Questo consente di fornire al medico informazioni importanti per la scelta del

trattamento farmacologico per la terapia di pazienti affetti da tubercolosi.

La microscopia e la coltura costituiscono ancora oggi il Gold‐Standard per la ricerca dei micobatteri

tubercolari. Come Gold Standard s’intendono le analisi atte ad eliminare dubbi che possono sorgere


13

con altre analisi. Quindi per la rilevazione dei micobatteri l’analisi più efficace ed efficiente è la

microscopia con la coltura. (5) (6).

1.5.3 Altritest

oltre alla batteriologia classica sono disponibili:

‐ Test della tubercolina

È un intracutaneo, viene iniettata della tubercolina, si formerà una bolla ed a seconda della

presenza o meno di anticorpi contro questa proteina del micobatterio si svilupperà una zona

indurità. La lettura del test avviene dopo 72 ore e si misura questo indurimento in termini di

millimetri. Sono noti falsi positivi da infezione con micobatteri ambientali e precedente

vaccino con ceppo BGC. Questo perché la positività al test indica solo che il paziente è venuto

in contatto con il micobattere e che ne ha una memoria immunologica.

‐ IGRA (Interferon Gamma Release Assays)

Questo test si basa sulla produzione di Interferone Gamma da parte dei linfociti T stimolati

con dopo incubazione con tre antigeni di Mycobacterium tuberculosis: ESAT‐6, CFP‐10 e

TB7.7. Il vantaggio di questi test è l’assenza di falsi negativi da vaccino con BGC. o da infezioni

con altri micobatteri non tubercolari. Attualmente i più comuni IGRA test sono:

il QuantiFERON‐TB® Gold In‐Tube ed il T‐SPOT.TB® (2) (5)

1.5.4 Testmolecolari

I test di biologia molecolare con ricerca del materiale genetico tubercolare costituiscono oggi un

complementare ai gold standard della batteriologia classica. Sono dei metodi PCR cioè di

amplificazione genetica. Sono meno sensibili ma altamente specifici. Purtroppo con un’analisi di

questo tipo non si verifica la vitalità dei micobatteri, ciò significa che potrebbero essere trovati anche

micobatteri morti. Questi utilizzano la tecinica PCR e Real Time PCR.

1.5.4.1 PCRePCR‐real‐time.

La tecnica PCR consiste nell’utilizzare una coppia di primer ed una DNA polimerasi per amplificare un

segmento specifico di DNA. Si susseguiranno dei cicli termici che consistono in una fase di

denaturazione del DNA a temperatura elevata, una fase di appaiamento dei primer, a temperatura

inferiore rispetto alla denaturazione ed una fase di estensione del filamento a singola catena del DNA

con una temperatura intermedia. L’amplificazione sarà esponenziale. La real‐time PCR utilizza delle

sonde a fluorescenza, rileva e quantifica un segnale di fluorescenza, che direttamente proporzionale

alla quantità di materiale amplificato, ciò permette di monitorare l’amplificazione durante i cicli. La

quantità di target è inversamente proporzionale al numero di cicli necessari al rilevamento del


14

segnale fluorescente soglia definito anche CT (threshold cycle). Threshold Cycle è il numero del ciclo

in cui la fluorescenza diventa positiva e quindi rilevabile.

Poiché il CT viene determinato durante la fase esponenziale di amplificazione, il risultato è di gran

lunga più affidabile di quello ottenibile in end‐point con la PCR tradizionale. Come End Point si

intende un risultato disponibile solo alla fine dell’amplificazione e non indica a che ciclo il materiale è

messo in evidenza. Per la ricerca dei micobatteri tubercolari si possono utilizzare varie zone del DNA

come target. Dovranno essere delle zone conservate in tutti i micobatteri del complesso tubercolare

Le più note sono:

‐ il rDNA 16S

una fra le regione più conservate nei batteri

‐ IS6110

è una sequenza di 1.361 basi in grado di duplicarsi e di spostarsi all’interno del genoma di

micobatteri del complesso tubercolare; di essa è possibile ritrovarne fino a 25 copie, anche

se nella grande maggioranza dei ceppi il numero è compreso fra 5 e 20 (5).


15

2 Motivazionedellasceltadellavorodidiploma

La tubercolosi, malattia fino a poco tempo fa considerata debellata nei paesi occidentali, si sta

ripresentando. La riemergenza sarebbe dovuta a flussi migratori, zone in gravi condizioni di povertà e

casi d’immunodepressione. Questa problematica interessa anche la Svizzera e la realtà ticinese. Nella

maggior parte dei casi che si presentano in Ticino, si tratta di soggiornanti nel centro asilanti di

Chiasso. La gestione di tali casi è presa principalmente in gestione dall’Ospedale Regionale di

Mendrisio (OBV). Introdurre una diagnostica rapida come quella del kit MTB‐RIF Xpert®

permetterebbe una diagnostica della tubercolosi in tempi brevi e consentirebbe d’isolare

precocemente il paziente, evitando cosi altri contatti e contaminazioni, nonché aiuterebbe a

contenere parte delle spese sanitarie, particolarmente quelle generate dall’isolamento del paziente.

3 Obiettivo

Lo scopo di questo lavoro di diploma è quello di validare l’analisi per la ricerca di micobatteri del

complesso tubercolare con il kit MTB‐RIF GeneXpert della Cepheid. Kit che oltre a rilevare la presenza

del M. tubercolosis Complex è in grado di rilevare la presenza delle resistenze alla Rifampicina,

medicamento di prima linea per il trattamento delle tubercolosi. L’introduzione in routine di tale

analisi non andrebbe comunque a sostituire le attuali analisi di microscopia diretta e coltura dei

micobatteri presso il servizio di microbiologia Eolab. Si tratterebbe di aver un primo risultato in due

ore, che in caso di positività consentirebbe d’isolare immediatamente il paziente aiutando quindi il

trattamento di tali casi all’interno dell’equipe medica. In caso di rilevamento della resistenza alla

rifampicina, si avrebbe una prima indicazione terapeutica.


16

4 TestMTB‐RIFGenexpert®

L’ Xpert MTB‐RIF è un sistema semiquantitativo per la messa in evidenza di DNA di micobatteri del

complesso tubercolare (MTBC) e presenza delle mutazioni del gene rpoB responsabili della resistenza

alla rifampicina su campioni d’espettorato, tramite real‐time PCR utilizzando come apparecchio il

Genexpert System.

L’integrazione in routine dell’MTB‐RIF fornisce due informazioni importanti per il sospetto di

tubercolosi:

‐ La detezione di genoma micobatterico del complesso tubercolare

‐ Un’eventuale mutazione che porta alla resistenza alla rifampicina

L’esecuzione di questo test comporta la manipolazioni con campioni con potenziale presenza di

micobatteri del complesso tubercolare. È necessarie quindi misure di sicurezza adeguate al

trattamento di un battere di classe III. Il laboratorio dovrà perciò disporre di una cappa a flusso

laminare dove poter effettuare le manipolazioni sul materiale clinico d’analisi in totale sicurezza.

4.1 Cappaaflussolaminare

Il primo passo per l’introduzione di tale analisi è stato quindi l’acquisto di una cappa a flusso

laminare di cui il laboratorio dell’Ospedale di Mendrisio non era a disposizione. La scelta è stata una

cappa biologica a flusso laminare verticale di tipo due. La principale caratteristica è quella di

proteggere l’operatore grazie al flusso verticale ed allo schermo regolabile che separa l’operatore

dalla zona di lavoro. È dotata di: quattro filtri HEPA (High Efficiency Particulate Air filter),

d’illuminazione, prese di corrente attivabili dai tasti esterni , lampada raggi UV con attacco a calamita

e possibilità di regolazione timer.

Funzionamento: l’aria pressurizzata spinta nell’aria di lavoro,

attraverso motoventilatore, passa , insieme all’aria proveniente

dall’esterno attraverso la griglia bucherellata ,che costituisce la

superficie del piano di lavoro. Da li viene aspirata nel canale che

porterà l’aria nel retro della cappa dove passa attraverso il filtro

HEPA. Parte di essa viene rigettata all’esterno nell’ambiente e parte

torna nella zona di lavoro. Il nome “flusso laminare” è dovuto

proprio a quest’unidirezionalità dell’aria che crea una corrente d’aria

omogenea priva di turbolenze. Per assicurare il flusso laminare

l’operatore dovrà utilizzare la cappa nel modo corretto, cioè tenere

l’apertura al minimo indispensabile 20 cm circa e non coprire la

Figura 5: movimento aria in una cappa a flusso laminare


17

superficie poiché interrompe il flusso omogeneo e causa il rigetto dell’aria della zona di lavoro

all’esterno costituendo cosi un pericolo di contaminazione della zona circostante l’aria di lavoro

qualora si fosse creato dell’aerosol durante la manipolazione di campioni infetti da TBC.

Cura della cappa: terminate le manipolazioni si pulisce la cappa con disinfettanti appositi per i

micobatteri, si chiude la cappa e si attiva la lampada raggi UV per circa tre ore per effettuare una

sterilizzazione dell’aria di lavoro, eliminando eventuali tracce di micobatteri che durante le

manipolazioni possono essere stati sparsi nell’aria di lavoro. (7)

4.2 GeneXpert

GeneXpert della ditta Cepheid è un apparecchio di biologia molecolare automatizzato in grado di

eseguire una PCR real‐time e dei principiali processi associato ad esso cioè: l’estrazione del DNA,

l’amplificazione del Target e il rilevamento; utilizzando delle cartucce fornite dai vari kit per le diverse

analisi. I kit che siamo andati a utilizzare con il sistema GeneXpert è l’Xpert MTB‐RIF, per la ricerca dei

micobatteri del complesso tubercolare, fornito sempre dalla ditta Cepheid.

4.3 Descrizionedell’analisi

Prima di poter iniziare con l’analisi, si deve pretrattare il campione. Il pretrattamento consiste nel

fluidificare il campione utilizzando il reagente campione, che ha la funzione di omogenizzare il

campione e ridurre la vitalità dei micobatteri per abbassare i rischi infettivi.

La cartuccia utilizzata, fornita nel kit, è costituita da quattro aree di reazione un tubo di aspirazione

centrale che comunica con il filtro sottostante e degli scompartimenti dove sono contenuti i reagenti,

che contengono i tamponi con surfattanti, e le microsfere, che contengono i costituenti necessari per

la PCR real‐time (primer, sonde, KCl, MgCl₂, HEPES pH 8,BSA, HEPES pH 7,2, polimerasi, dNTP). Una

volta dispensato il campione nella camera del campione ed inserita la cartuccia nel modulo,

l’apparecchio introdurrà il pistone nella camera di aspirazione e procederà all’aspirazione del

campione nella zona attiva. Con un sistema di pressione spinge il campione sul filtro aspira i diversi

reagenti contenti i tamponi e procede con la fase di estrazione del DNA,che avviene mediante un

corno sonoro che causa la lisi dei bacilli tramite ultrasuoni. Il materiale genetico liberato passa oltre

la membrana del filtro e viene spinto nelle camere di contenimento delle prime due microsfere.

Tramite il controllo PCC l’apparecchio verifica l’idratazione delle sfere liofilizzate ed al momento

opportuno inietta il campione con le sfere reidratate nella camera di reazione dove avverrà la prima

reazione PCR. Terminata la prima reazione dispensa il materiale nella camera contente le altre sfere

liofilizzate. Come prima appena l’idratazione sarà completa ridispensa il campione nella camera di

reazione e avviene un altro ciclo con l’utilizzo della detezione della fluorescenza.


18

4.4 PCRreal‐time

La PCR real‐time viene utilizzata come applicazione in campo medico per determinare la presenza di

DNA anche a concentrazioni molto basse. Costituisce cioè un metodo altamente sensibile.

Utilizza dei cicli termici per le differenti fasi della PCR:

‐ Denaturazione (94‐96°)

In questa fase avviene l’apertura della catena a doppia elica

‐ Ibridazione (56‐56°)

La temperatura dipende dai primer utilizzati. In questa fase i primer si legheranno al Dna

Target single strand.

‐ Estensione del filamento

Fase in cui la polimerasi andrà a costruire il filamento complementare al DNA target

utilizzando i dNTPs.

Nel susseguirsi di questi cicli, generalmente 30, le copie di filamento che verranno a formarsi saranno

raddoppiate per ogni ciclo completato. Si ha quindi un’amplificazione esponenziale dei filamenti di

DNA target. L’amplificazione non andrà avanti all’infinito, è limitata dalla quantità dei dNTPs,

dall’attività della polimerasi e dall’ibridazione dei filamenti del DNA target. Si raggiunge quindi una

fase di plateau, dove il numero di copie rimane invariato. Il numero di copie ottenuto è proporzionale

alla quantità di DNA templato inizialmente presente nel campione. La real‐time PCR ha proprio il

vantaggio di poter monitorare la crescita esponenziale, fornendo dei risultati semiquantitativi in

tempo reale. Ciò avviene grazie all’utilizzo della fluorescenza. Questa fluorescenza si ottiene o con

l’intercalare nel DNA di sostanze coloranti fluorescenti o con l’ibridazione di sonde specifiche

fluorescenti, come nel caso del kit MTB‐RIF. La lettura della fluorescenza avviene attraverso un light

termocycler che nel caso del GeneXpert è contenuto nel modulo.

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20

5 Materialiemetodi

5.1.1 Campioniclinici

I campioni clinici su cui si può effettuare l’analisi MTB‐RIF GeneXpert sono:

‐ Espettorato spontaneo o indotto

‐ Sedimento di espettorato dopo decontaminazione (forniti dal servizio di microbiologia)

Tutti i materiali vanno considerati potenzialmente infetti

5.1.2 Materialinonfornitinelkit

‐ Cappa a flusso laminare:

ditta: EHRET

modello: BIOSAFE 8‐130‐2

numero di serie: 4574

‐ Genexpert:

ditta: Cepheid

modello:

numero di serie:

analizzatore automatico di biologia molecolare, con computer, lettore cd, lettore codice a

barre e manuale dell’operatore

‐ non disponibile la stampante

‐ pipette sterili

‐ falcon per diluire il campione

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‐ contenitore per smaltimento rifiuti

‐ disinfettante

‐ portaprovette per falcon


21

5.1.3 materialedelkit

‐ cd:

file di definizione del saggio

istruzioni per l’importazione dellAFD nel software GX

foglio illustrativo

‐ pipette di trasferimento con tacca che segna il volume minimo di campione

‐ 10 cartucce Xpert MTB/RIF con provette di reazione integrate

‐ 10 flaconi da 8ml di Reagente del Campione(RC) :idrossido di sodio e isopropanolo

In ogni cartuccia:

‐ Microsfera 1: primer, sonde, KCl, MgCl₂, HEPES Ph 8, BSA(sieroalbumina bovina)

‐ Microsfera2:sonda, polimerasi, KCL, MgCl₂, dNTP, HEPES, pH 7,2 ,BSA

‐ Microsfera 3: circa 6000 spore di controllo non infette per la preparazione del campione

‐ Reagente 1: 4ml tampone Tris,EDTA e surfattanti

‐ Reagente 2: 4ml tampone Tris,EDTA e surfattanti (8)

5.2 Controllidiqualità

Ogni analisi include:

‐ un controllo di elaborazione del campione (SPC)

‐ e un controllo per la sonda (PCC)

L’SPC contiene spore non infette mentre il PCC misura il segnale emesso dalle sonde per

controllare la reidratazione delle sonde contenute nelle microsfere liofilizzate. (8)

5.3 Principiodellaprocedura

GeneXpert Dx System consente di integrare e automatizzare l’analisi dei campioni, l’amplificazione

degli acidi nucleici e il rilevamento delle sequenze bersaglio in campioni semplici o complessi,

utilizzando la PCR in tempo reale e trascrittasi inversa.

Il kit non fornisce le temperature di denaturazione di ibridazione e di estensione del filamento. (8)

5.4 Procedimento

Preparazione del campione di espettorato(lavoro sotto cappa a flusso laminare)

‐ Assicurarsi che il campione non contenga materiale alimentare.

‐ Etichettare le cartucce con l’identità del paziente o scrivervi il nome ai lati

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23

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24

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25

5.6 Limitazionidelmetodo

‐ Il rilevamento dei micobatteri del complesso tubercolare dipende dal numero di

microrganismi presenti nel campione caricato nella cartuccia.

‐ Il test positivo non indica necessariamente che i micobatteri siano vitali.

‐ Il DNA micobatterico può persistere anche dopo la terapia antibiotica, probabilmente si

tratterà di micobatteri morti.

‐ Mutazioni o polimorfismi nelle regioni dove andrà a legarsi il primer possono compromettere

il rilevamento di varianti nuove o conosciute di ceppi mutliresistenti. (8)

5.7 SensibilitàrispettoalGoldStandard

Risultati con 3 campioni d’espettorato per paziente (8)

Microscopia Coltura Sensibilità

Positiva Positiva 99,5%

Negativa Positiva 90%

Risultati con 1 campione d’espettorato per paziente (8)

Microscopia Coltura Sensibilità

Positiva Positiva 97,8%

Negativa Positiva 73,1%

5.8 Sensibilitàanalitica

Il limite di rilevamento (LoD) è definito come il numero più basso di unità formanti colonie (CFU) per

campione che possono essere distinte da campioni negativi con limite di confidenza del 95%.

Il test ha un LoD di 131CFU/ml intervallo di confidenza del 95% compreso tra:106,2‐176,4 CFU. (8)

6 Validazione

I campioni su cui è stata effettuata la validazione sono 17 campioni di espettorato, lavaggio o

aspirato, porzionati in precedenza al servizio di microbiologia Eolab da campioni su cui è stata

effettuata la microscopia e la messa in coltura per la ricerca di micobatteri del complesso tubercolare

, più un controllo di qualità poiché l’unico positivo per la resistenza alla rifampicina in modo da poter

testare il funzionamento anche per l’amplificazione della zona di resistenza. Queste porzioni

conservate in Eppendorf sono state sottoposte a processo di neutralizzazione. La neutralizzazione

consiste nella disattivazione del materiale portandolo ad una temperatura di 80°. In questo modo si

ha la denaturazione del DNA e quindi una morte degli eventuali micobatteri. Con la denaturazione


26

del DNA dei micobatteri il materiale non costituisce più pericolo infettivo. Successivamente i

campioni sono stati trasportati all’Ospedale Regionale di Mendrisio dove sono stati conservati in frigo

a 4°C ed utilizzati come campioni per la validazione del metodo MTB‐RIF Xpert ®.

7 Risultati

Risultati SMIC Risultati GenXpert

Nr.

Campione Materiale Microscopia

PCR

Roche Coltura Antibiogramma MTB

RIF

resistance

level

1 espettorato numerosissimi + MTBC sensibile detected high not detected

2 lavaggio numerosissimi + MTBC sensibile detected high not detected

3 aspirato alcuni + MTBC sensibile detected medium not detected

4 lavaggio numerosissimi + MTBC sensibile detected medium not detected

5 espettorato numerosissimi + MTBC sensibile detected medium not detected

6 lavaggio negativa + negativa - not detected - -

7 espettorato alcuni + MTBC sensibile detected medium not detected

8 espettorato rarissimi + MTBC sensibile detected medium not detected

9 espettorato rarissimi n.d. negativa - detected

very

low not detected

10 espettorato negativa + MTBC sensibile detected low not detected

11 espettorato alcuni + MTBC sensibile invalid - -

12 espettorato numerosi + MTBC

Rif Resistente

(Ser531Leu) detected high Detected

13 espettorato numerosi n.d. MTBC sensibile detected low not detected

14 espettorato numerosi n.d. MTBC sensibile detected low not detected

15 espettorato rari Nd MTBC sensibile detected medium not detected

16 espettorato alcuni + MTBC sensibile detected low not detected

17 espettorato alcuni + MTBC sensibile detected low not detected

18 espettorato rarissimi + MTBC sensibile invalid - -

7.1 Discussione

I raggruppamenti di colore identificano i singoli pazienti, mentre le righe, i singoli campioni. Per tutti i

campioni si hanno a disposizione i risultati della microscopia, coltura e della PCR real‐time con MTB‐

RIF Xpert®, in alcuni casi è disponibile anche il risultato della PCR Roche eseguita al servizio di

microbiologia Eolab.

Tutti campioni postivi alla microscopia sono identificati postivi anche col l’analisi MTB‐RIF Xpert®. Il

kit testato è stato anche in grado di rilevare la presenza del micobattere anche in un caso in cui la

microscopia aveva dato esito negativo mentre poi la coltura ha confermato la presenza. In due casi il

risultato dell’analisi è risultato invalido, l’apparecchio ha segnalato un errore 2008 che indica un

errore di pressione della siringa di aspirazione che può anche essere dovuto alla viscosità del

campione, mentre nel secondo caso si tratta di un errore di comunicazione tra il modulo e il

computer e quindi non vi è risultato, segnalato con l’errore 2127. A causa dell’insufficienza del

materiale e della limitata disponibilità dei test per la validazione non è stato possibile rianalizzare


27

questi due campioni. Come risultato negativo vi è un solo caso è si tratta di un campione risultato

negativo anche alla microscopia e nella coltura ma risultato positivo nella PCR Roche. Questo non

deve destare alcuna perplessità poiché la PCR Roche ha un limite di rilevamento più basso rispetto a

quello del kit MTB‐RIF Xpert®. Per quanto riguarda i livelli di positività con cui il risultato viene

espresso non è sempre congruente alla perfezione con la microscopia ma è abbastanza

rappresentativo nella maggiorparte dei casi.

Volendo dare un valore simile alle quantità sia ai risultati della microscopia sia a quelli ottenuti con il

kit MTB.RIF Xpert®

MTB.RIF Xpert Valore assegnato microscopia

Very low 1 Rarissimi

Low 2 Rari

Medium 3 Alcuni

High 4 Numerosi

Very High 5 numerosissimi

Ora proviamo a paragonare le quantità:

CAMPIONE MTB.RIF Xpert MICROSCOPIA Differenze

1 5 4 1

2 5 4 1

3 3 3 0

4 5 3 2

5 5 3 2

7 3 3 0

8 1 3 2

9 1 1 0

10 0 2 2

12 4 4 0

13 4 2 2

14 4 2 2

15 2 3 1

16 3 2 1

17 3 2 1


28

Calcolando la media delle differenze si hanno una differenza pari a 1. Si può quindi dire che anche i

livelli di qualità sono abbastanza rappresentativi. Le differenze che a volte sono più marcate in alcuni

campioni sono da ricondurre anche alla omogeneità del campione. con i dato ottenuti il calcolo della

specificità e della sensibilità non è rappresentativo si fa quindi riferimento a quella fornita dal kit

sopraelencata nelle tabelle del capitolo 5.7.

7.2 Conclusioni

Possiamo quindi affermare che il kit MTB‐RIF Xpert è in grado di rilevare la presenza dei micobatteri

del complesso tubercolare nei casi positivi mostrando un ottima concordanza con i risultati ottenuti

con la microscopia diretta; in questo caso del 100% nei test riusciti.

In conclusione la validazione del MTB.RIF Xpert ® è riuscita e il test può a tutti gli effetti entrare in

routine. L’obiettivo di questo lavoro di diploma è stato raggiunto.

8 RingraziamentiRingrazio l‘Ospedale Regionale di Mendrisio per avermi permesso di sviluppare questo lavoro di

diploma. Un grazie alla mia referente Dr.ssa F. Baggi per avermi dato le dritte nel campo della

microbiologia e aver curato tutta la parte specialistica, ringrazio anche il Dr. F. Keller.

Il ringraziamento più sentito va al laboratorio di Mendrisio soprattutto alla capolaboratorio Rosita

Ghidossi e alla mia referente degli allievi Ines Salina per avermi supportato in ogni modo e

ovviamente un grazie di cuore a tutti voi tab di Mendrisio che mi avete sopportato e sostenuto in

questo periodo.

Ringrazio anche tutte le persone che mi stanno vicino e nel cuore in tutti i giorni della mia vita la mia

mamma e i miei amici dagli abbracci più sinceri che anche se non capivano molto del mio lavoro mi

son stati accanto e mi hanno supportato.

Grazie anche alla scuola e al supporto ricevuto negli ultimi mesi, ma soprattutto grazie a quelle

compagne di classe che mi hanno rassicurato davanti alle mie insicurezze.


29

9 Bibliografia

1. Pasquinelli, Filippo. diagnostica e tecniche di laboratorio.

2. ticinese, lega polmonare. manuale della tubercolosi 2011.

3. Organisation, World Healt. Global Tubercolosis Report 2012.

4. manuale di sicurezza nei laboratori di ricerca. [Online] università di padova azienda ospedaliera.

http://www.bio.unipd.it/safety/man/manbio.html.

5. micobatteriologia clinica. [Online] AMCLI. http://www.mycobactoscana.it/micobatteriologia/.

6. schede operative smic.

7. EHREIT. operating instruction Biosafe cabinet.

8. Cepheid. Cd del kit MTB‐RIF Xpert‐ metodica.

Figura 1: http://medicinecookbook.blogspot.it/ .................................................................................... 5

Figura 2:incidenza TBC nel mondo anno 2011 ........................................................................................ 6

Figura3:http://www.oocities.org/gbruno_2000/mico.htm .................................................................. 11

Figura4:http://www.lung.ca/tb/images/full_archive/107_bacillus.jpg ............................................... 11

Figura 5. http://www.gruppostrola.com/index.asp?p=GS800%20LAF................................................. 16

Figura 6: sequenza del gene di resistenza alla rifampicina da manuale del kit .................................... 19

10 Abbreviazioni:OBV ospedale beate vergine di Mendrisio

SMIC servizio di microbiologia Eolab

WHO World Heath Organisation

TBC tubercolosi

MTB micobacterium tuberculosis

RIF rifampicina

TAB tecnico in analisi biomediche


30

11 Allegati:1. www.cepheid.com/.../XpertMTB_Broch_R9_EU.p... 2. contenuto cd con metodica in pdf 3. risultati delle analisi in pdf

Nuovo test in del e della - Sistema bibliotecario ticinese · Nuovo test di screening ... PCR...

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