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LABORATORIO DI METOLOGIE E TECNOLOGIE GENETICHE PCR (Polymerase chain reaction)

La PCR è un metodo di biologia molecolare, utile per amplificare (i.e. creare copie multiple di) DNA, inventato da Kary Mullis alla fine degli anni ’80. Lo scopo della PCR è di produrre un enorme numero di copie di una sequenza di DNA, sia essa un gene o parte di questo. Nella pratica corrente i principali componenti della PCR sono:

DNA stampo, che contiene il frammento da amplificare; Due primers (Forward e Reverse), che determinano l’inizio e la fine della regione da amplificare;

DNA Polimerasi, che copia la regione da amplificare (si usano le DNA polimerasi di batteri termofili, che sono stabili ad elevate temperature; es. Taq Polimerasi);

Nucleotidi, per la sintesi di nuovo DNA; Buffer, che fornisce l’ambiente chimico ideale per la DNA Polimerasi.

Il processo della PCR consta di tre steps principali che vengono ripetuti dalle 30 alle 40 volte, attraverso l’utilizzo di un termociclatore. 1). Denaturazione a 94oC (Melting):

Durante la denaturazione, i due filamenti di DNA si separano e tutte le reazioni enzimatiche si arrestano (es. l’estensione del filamento del ciclo precedente);

2). Annealing a 50 – 60 oC: La temperatura di questo stadio dipende dai primers usati. Durante l’annealing vengono utilizzati due primers (Forward e Reverse), che si legano ai loro siti specifici. Si formano e si rompono continuamente i legami ionici tra i filamenti dei primers ed i singoli filamenti di DNA che funzionano da templato (filamento stampo). I primers che si appaiano esattamente con il filamento stampo formano i legami più stabili ed, in questo piccolo tratto di doppia elica, si lega la polimerasi, che così inizia a copiare il filamento stampo;

3). Estensione a 70 – 75 oC (Elongation): La temperatura di elongation dipende dalla DNA Polimerasi. Durante l’estensione, la Polimerasi estende i primers aggiungendo le basi (complementari al templato) all’estremità 3’. Il risultato sono 2 copie di DNA a doppio filamento.

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Figura 1: Le tre fasi della PCR.

Poichè entrambi i filamenti sono copiati durante la PCR, si ha un aumento esponenziale del numero di copie della sequenza di DNA. X=X0(2N) N= NUMERO DI CICLI

Con 100 molecole di DNA come stampo, dopo 30 cicli, la PCR produrrà PIU’ DI 100 MILIONI DI COPIE.

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Figura 2: Amplificazione esponenziale durante la PCR.

Caratteristiche della PCR • Si possono utilizzare piccole quantità di DNA(ng); • La qualità del DNA può anche non essere buona; • Alta riproducibilità, specificità e sensibilità; • Applicazioni cliniche e nella ricerca; • Molto rapida e poco costosa; • Puo’ essere usata solo se si conosce la sequenza del DNA. A cosa serve la PCR?

La PCR può essere utilizzata in un’ampia varietà di analisi tra cui:

Genetic fingerprinting (usata in medicina legale); Test di paternità; Studi di evoluzione e filogenesi; Identificazione di malattie ereditarie; Identificazione di malattie virali; Clonaggio di un gene; Analisi di DNA antico; Genotipizzazione di specifiche mutazioni e polimorfismi.

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POLIMORFISMI I polimorfismi sono variazioni di sequenza nelle regioni codificanti e non (es.: sostituzioni nucleotidiche, delezioni/inserzioni, duplicazioni/delezioni geniche). Per definizione un polimorfismo è una variante allelica, che si verifica nella popolazione con una frequenza di almeno l’1%. Es.: I gruppi sanguigni umani ABO. Il polimorfismo si differenzia da una mutazione spontanea, che si verifica, invece, con una frequenza < 1%.

A che serve lo studio dei polimorfismi?

Le analisi dei polimorfismi sono usate:

Nella tipizzazione dei tessuti (es.: per la donazione di organi); In studi di popolazione (es.: studio del grado di diversità genetica in una

popolazione); Per l’identificazione di malattie genetiche.

Come nascono i polimorfismi?

Per mutazione.

Che cosa mantengono i polimorfismi nella popolazione?

Molti sono i fattori che mantengono un polimorfismo nella popolazione, tra cui: Effetto del fondatore; Deriva genica; Polimorfismo bilanciato.

PREVALENZA

RISCHIO INDIVIDUALE

RISCHIO ATTRIBUIBILE ALLA POPOLAZIONE

STUDI APPROPRIATI

basso

bassa (<1%)

alto

POLIMORFISMO MUTAZIONE

alta (>1%)

apprezzabile basso

studi di coorte studi di controllo famiglie

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Negli ultimi anni è stato dimostrato che più di 1/3 dei loci eucariotici sono rappresentati da varianti alleliche e che un locus è tanto più polimorfico, quanto più i suoi alleli sono equifrequenti. Le varianti alleliche possono o meno causare alterazioni funzionali della proteina e nel fenotipo, a seconda che siano presenti nelle regioni codificanti o non codificanti. Se un polimorfismo è in una sequenza codificante di un gene, in un esone, si può verificare una sostituzione aminoacidica, determinando cambiamenti nella proteina risultante. Un polimorfismo in un promotore può alterare i livelli di trascrizione. Un polimorfismo caratterizzato dalla delezione dell’intero gene, come per l’allele nullo GSTM1, elimina l’attività funzionale dell’enzima. Si possono, inoltre, verificare sostituzioni aminoacidiche, originantesi dalla sostituzione di un singolo nucleotide. Gli alleli la cui sequenza rivela solo un singolo nucleotide cambiato sono chiamati polimorfismi a singolo nucleotide o SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms). In questo caso l’effetto della sostituzione dipende dalle caratteristiche chimiche dell’amminoacido sostituito. Cambiamenti nella funzione della proteina possono avere effetti profondi sul fenotipo, che possono essere osservati sotto particolari condizioni, come l’esposizione a sostanze chimiche o stress. Molto spesso questi cambiamenti possono creare, o eliminare, siti per gli enzimi di restrizione che tagliano il DNA. La digestione con l’enzima può così produrre frammenti di DNA di diversa lunghezza, identificabili con l’elettroforesi. L’RFLP-PCR (Restriction Fragments Length Polymorphism) è un metodo indiretto di indagine utile per l’individuazione degli SNPs.

Dove può essere posizionato un SNP?

In regioni non codificanti (questi polimorfismi non sono identificabili dal prodotto proteico);

In regioni codificanti (in questi polimorfismi la struttura proteica può essere alterata).

Il genoma umano contiene approssimativamente 1 milione di SNPs dei quali 500000 in zone non codificanti e 200000 in zone codificanti, dove si hanno sostituzioni amminoacidiche. Il numero di SNPs per gene varia da 0 a 9. La diversa risposta individuale alle condizioni ambientali dipende dalla presenza delle variazioni di sequenza all’interno di geni critici. Questi polimorfismi genetici possono influenzare i livelli di espressione, la struttura, o l’attività catalitica degli enzimi del metabolismo e della riparazione del DNA, influenzando la suscettibilità individuale. Alcuni esempi includono: 1). la relazione tra enzimi che attivano o detossificano (glutatione S-transferasi) i potenziali carcinogeni, 2). La suscettibilità, degli individui con polimorfismi nel gene XRCC1, a vari tipi di danni genotossici. Ci sono una dozzina di geni che modulano la risposta alle esposizioni ambientali. L’analisi dei polimorfismi in questi geni può essere utile per capire la distribuzione del rischio all’esposizione nelle popolazioni umane e, possibilmente, predire i rischi individuali dovuti all’esposizione.

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Enzimi detossificanti (del metabolismo):

Glutatione S-transferasi. Le glutatione S-transferasi (GSTs) sono una famiglia di enzimi conosciuti per il loro importante ruolo nella detossificazioni di molti cancerogeni trovati nelle sigarette. Le GSTs sono proteine dimeriche, che catalizzano le reazioni tra il glutatione ed i loro substrati, come i radicali aromatici eterociclici e gli epossidi. La coniugazione facilita l’escrezione consentendo, dunque, la detossificazione. Figura 3: Detossificazione dei composti potenzialmente cancerogeni, da parte degli enzimi GSTs. Oltre al loro ruolo nella fase II della detossificazione, i GSTs modulano l’induzione di altri enzimi e proteine importanti per le funzioni cellulari, come la riparazione del DNA. Questa classe di enzimi è importante per mantenere l’integrità genomica e, come risultato, può svolgere un ruolo importante nella suscettibilità al cancro. Gli enzimi GTSs sono codificati da cinque distinti loci, noti come: alpha (A), mu (M), pi (P), theta (T) e zeta (Z). Due loci, in particolar modo, GSTM1 e GSTT1, svolgono un ruolo di rilevanza nella suscettibilità al cancro testa-collo.

OH

O

O

Reazioni di fase I

OSSIDAZIONI(es. CYP1A1,CYP2E1)

Reazioni di fase II

CONIUGAZIONI(es. GST, NAT2)

ELIMINAZIONE

ADDOTTO AL DNA

OH

O

O

Reazioni di fase I

OSSIDAZIONI(es. CYP1A1,CYP2E1)

Reazioni di fase II

CONIUGAZIONI(es. GST, NAT2)

ELIMINAZIONE

ADDOTTO AL DNA

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GSTM1

• Il gene GSTM1 si trova sul cromosoma 1 in posizione p13.3; • Individui con delezioni omozigoti del locus GSTM1 non hanno un’attività

enzimatica funzionale; • Sono stati identificati tre alleli al locus GSTM1:

Un allele nullo (delezione completa); Due alleli (GSTM1a e GSTM1b) che differiscono per una sostituzione C → G in posizione 534. Questa sostituzione porta ad una sostituzione amminoacidica Lys → Asn in posizione 172.

Il metabolismo dei cancerogeni coinvolge una serie di steps di attivazione, che produce intermedi reattivi e steps di detossificazione, che produce composti idrosolubili e, quindi, eliminabili. L’attivazione può comportare la formazione di composti che si legano al DNA, formando prodotti noti come “addotti”. L’accumulo di addotti a livello di loci critici, come oncogeni e geni oncosoppressori, può portare a mutazioni somatiche e ad alterazioni del ciclo cellulare. Individui che non sono capaci di produrre l’enzima GSTM1 accumulano potenzialmente più addotti al DNA. Le nostre conoscenze su come le variazioni genetiche influenzano gli enzimi del metabolismo hanno fornito nuove spiegazioni su come i carcinogeni riescono a danneggiare il DNA. Numerosi studi hanno dimostrato che i polimorfismi del metabolismo sono importanti determinanti del rischio di cancro a livello della popolazione. La formazione di addotti al DNA si verifica costantemente, nonostante i meccanismi di detossificazione. I mammiferi hanno un complesso sistema di riparazione del DNA, che corregge gli addotti al DNA, le basi danneggiate o altre lesioni prima che eventi di replicazione stabilizzino questi cambiamenti permanentemente. L’interazione di tutti questi fattori protettivi determina il grado con cui questi danni sono convertiti in mutazioni e, quindi, in malattie.

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Figura 4: Interazione tra i vari fattori protettivi. Recentemente sono stati compiuti molti sforzi per caratterizzare le variazioni nei geni della riparazione. Riparazione del DNA: Se i sistemi di riparazione del DNA correggono il danno al DNA, endogeno o indotto da cancerogeni, le conseguenze dei genotipi metabolici “ad alto rischio” possono essere meno significative. Gli enzimi della riparazione mantengono l’integrità del codice genetico minimizzando gli errori di replicazione (causati da DNA templato riarrangiato o danneggiato) e rimuovendo i segmenti di DNA danneggiato. La fedeltà dei meccanismi di riparazione può essere influenzata da polimorfismi che alterano l’attività enzimatica. E’ noto che individui che mancano di alcuni elementi della riparazione del DNA hanno una maggiore predisposizione allo sviluppo di tumori e che cambiamenti nell’attività di riparazione del DNA può influenzare la sensibilità di un tumore al trattamento con alcuni agenti anti-tumorali.

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La riparazione del DNA può verificarsi secondo molteplici pathways, che dipendono dal tipo di danno:

BBaassee eexxcciissiioonn rreeppaaiirr (BER) coinvolge più di 25 geni deputati alla riparazione delle basi danneggiate, dei siti abasici ed altri danni causati per lo più dall’azione di radicali liberi;

MMiissmmaattcchh rreeppaaiirr comprende almeno sei geni che correggono i nucletidi mal appaiati che risultano durante la replicazione del DNA;

NNuucclleeoottiiddee eexxcciissiioonn rreeppaaiirr (NER) comprende più di 35 geni coinvolti nella rimozione del danno indotto da raggi UV (dimeri di pirimidine) e addotti al DNA prodotti dall’esposizione a sostanze chimiche;

TTwwoo ddoouubbllee--ssttrraanndd--bbrreeaakk, non homologous end joining and homologous recombination repair (HRR) contano più di 20 geni coinvolti nella riparazione di rotture dell’elica del DNA prodotte dall’esposizione alle radiazioni o dovute alla riparazione incompleta da parte di altri pathway.

Polimorfismi nei geni della riparazione possono alterare la funzione della proteina corrispondente e la capacità individuale di riparare il DNA danneggiato. Recentemente è stata dimostrata una correlazione tra i polimorfismi associati al gene XRCC1 e l’insorgenza del cancro. XXRRCCCC11 ((XX--RRaayy RReeppaaiirr CCrroossss CCoommpplleemmeennttiigg 11))

Il gene XRCC1 si trova sul cromosoma 19 in posizione q13.2; E’ composto da 17 esoni; La proteina codificata è lunga 677 aa.; La proteina ha domini di legame con la Polimerase-ß, DNA ligasi III and Poly

(ADP-ribose) polimerasi (PARP) ed è coinvolta nel pathway di riparazione BER.

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Figura 5: Pathway BER e ruolo di XRCC1.

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Figura 6: Il gene XRCC1.

Polimorfismi in XRCC1 Codone 194 – Esone 6, Base 26304 C → T; Arg → Trp Frequenza allelica= 0,15 Codone 206 – Esone 9, Base 26651 A → G; Pro → Pro Frequenza allelica= 0,30 Codone 399 – Esone 10, Base 28152 G → A; Arg → Gln Frequenza allelica= 0,25. SSttuuddii ddii aassssoocciiaazziioonnee rriigguuaarrddaannttii iill ppoolliimmoorrffiissmmoo 339999 ddeell ggeennee XXRRCCCC11 La variante allelica al codone 399 è stata associata ad un aumento di addotti al DNA indotti da aflatossine. E’ stata evidenziata un’associazione positiva tra la variante allelica al codone 399 e la presenza di addotti al DNA, in cellule mononucleate presenti nel sangue, ed con un’aumentata frequenza di scambi tra cromatidi fratelli (SCE) in linfociti di individui fumatori. Esiste un’associazione positiva tra la presenza del polimorfismo nel codone 399 e l’insorgenza del cancro testa-collo, cancro polmonare, cancro allo stomaco e cancro alla mammella. Esiste invece un’associazione inversa tra lo stesso polimorfismo e l’insorgenza del cancro alla vescica e del cancro della pelle (del tipo non-melanoma).

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XXRRCCCC33 ((XX--RRaayy RReeppaaiirr CCrroossss CCoommpplleemmeennttiigg 33))

Il gene XRCC1 si trova sul cromosoma 14 in posizione q32.3; E’ composto da 10 esoni; La proteina codificata è lunga 347 aa.; Proteina facente parte della famiglia di RAD51, la quale facilita, per l’appunto,

l’assemblaggio del filamento nucleoproteico di RAD51 lungo il filamento cross-ricombinante. Interviene nella riparazione delle rotture a doppio filamento, in particolare nell’ Homologous Recombination Repair.

Figura 7: Pathway HRR e ruolo di XRCC3.

Polimorfismi in XRCC3 IVS 5-14, Base 17893 A → G; Modifica della giunzione Introne-Esone Frequenza allelica= 0,30 Codone 241 – Esone 7, Base 18067 C → T; Thr → Met Frequenza allelica= 0,25.

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SSttuuddii ddii aassssoocciiaazziioonnee rriigguuaarrddaannttii iill ppoolliimmoorrffiissmmoo 339999 ddeell ggeennee XXRRCCCC11 La variante allelica al codone 241 è stata associata ad un aumento di addotti al DNA in leucociti circolanti di persone sane e ad un aumento di aberrazioni cromosomiche. E’ stata evidenziata un’associazione positiva tra la variante allelica al codone 241 e l’insorgenza di tumore alla pelle di tipo melanoma, cancro alla vescica e di tumore alla prostata. Di contro non sono state trovate relazioni tra questo polimorfismo e l’aumentata probabilità di manifestare il tumore ai polmoni, allo stomaco, alla pelle ed alla vescica.

SCOPO DELL’ESERCITAZIONE

Determinazione dei polimorfismi dei geni XRCC1 e XRCC3, mediante PCR. Primo Step: Purificazione di DNA da sangue intero; Quantificazione del DNA e sua diluizione;

Secondo step: Preparazione dei campioni; Reazione della PCR; Check del prodotto di PCR (per verificare l’assenza di contaminazioni);

Terzo step: Determinazione del genotipo: a). Digestione enzimatica (per XRCC1/XRCC3); b). Corsa elettroforetica; c). Lettura delle bande ottenute.

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Primo step

Purificazione di DNA da sangue intero

1) Lisi dei campioni di sangue: Mettere in una eppendorf da 1,5 ml 200 μl di sangue (a temperatura ambiente) ed aggiungere 25 μl di proteinasi K. Aggiungere 200 μl di buffer B3 ai campioni e vortexare vigorosamente (10-20S). Incubare i campioni a 70oC per 10-15 min. 2). Regolare le condizioni di legame del DNA: Aggiungere 210 μl di etanolo (96-100%) ad ogni campione e vortexare ancora. 3). Legare il DNA: Caricare ogni campione in una colonnina NucleoSpin Blood posizionata dentro una eppendorf da 1,5ml. Centrifugare 1 min. a 11,000x g.

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4). Lavare la membrana:

Primo lavaggio Mettere la colonnina NucleospinBlood in una nuova eppendorf da 1,5 ml ed aggiungere 500 μl di buffer BW. Centrifugare 1 min. a 11,000 x g.

Secondo lavaggio Mettere la colonnina NucleospinBlood in una nuova eppendorf da 1,5 ml ed aggiungere 600 μl di buffer B5. Centrifugare 1 min. a 11,000x g. 5). Eluizione del DNA: Mettere la colonnina NucleospinBlood in una nuova eppendorf da 1,5 ml ed aggiungere 100 μl di buffer BE, precedentemente riscaldato a 70oC. Incubare a temperatura ambiente per 1 min. Centrifugare 1 min. a 11,000 x g.

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Quantificazione del DNA purificato Preparare 1 eppendorf da 0,5 ml per ogni campione. Aggiungere in ogni eppendorf 390 μl di H2O distillata e 10 μl di campione. Lettura allo spettrofotometro: Prima lettura: bianco.

Mettere nella cuvetta al quarzo 400 μl di H2O distillata ed iniziare la lettura. Letture successive. Campioni

Caricare i campioni nella cuvetta al quarzo e procedere con la lettura. Lo spettrofotometro indicherà tre valori:

A260: Assorbanza del DNA

A280: Assorbanza delle proteine

A260 / A280 = Purezza del DNA (deve essere tra 1,7 e 1,8). N.B.: se la lettura è negativa, non c’è nulla. Calcolo della concentrazione del DNA:

A260 x Fattore di diluizione x 40

Con:

Fattore di diluizione → 40

40 → Valore dell’assorbanza pari a 1 quando la concentrazione del DNA è pari a 40 μg/ml. Esempio:

A260 = 0,055

La concentrazione è pari a 110 μg/ml.

La concentrazione finale del DNA deve essere di 10 ng/ μl, quindi:

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110/10 = 10 ca.

Il campione di DNA va diluito 10 volte in H2O distillata per ottenere una concentrazione finale di 10 ng/μl.

Secondo step

XRCC1 ex10/XRCC3 ex7 Preparazione dei campioni SCOPO: I polimorfismi che verrnno studiati sono delle sostituzioni aminoacidiche Arg → Gln (codone 399) e Thr → Met (codone 241), localizzate, rispettivamente, all’interno dell’esone 10 del gene XRCC1 e dell’esone 7 del gene XRCC3. Tali polimorfismi sono dovuti: per XRCC1 ad una sostituzione G → A (nucleotide 28152), in grado di eliminare un sito di restrizione specifico per l’enzima HpaII/Msp I, presente, invece, nell’allele wild-type; per XRCC3 ad una sostituzione C → T (nucleotide 18067), in grado di creare un sito di restrizione specifico per l’enzima NiaIII/Hsp92II . Dopo aver amplificato, tramite una PCR multipla (in cui vengono amplificate due frammenti genici diversi in due serie di campioni), un segmento di circa 200 bp per tutti e due i geni, la determinazione del genotipo verrà effettuata mediante digestione enzimatica. Campioni utilizzati: Totale campioni da utilizzare per ogni polimorfismo: 6 campioni genotipizzati. Per ogni serie di campioni sarà presente un controllo negativo per valutare la presenza o meno di contaminazione.

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Preparare la miscela di reazione (Master Mix) per ogni gene in una eppendorf da 0,5/1,5 ml, secondo il seguente protocollo: Allestire una microprovetta da 0,2 ml (strip) per ogni campione. Aggiungere in ogni strip 1 μl di DNA diluito (10 ng/μl) e 19 μl di Master Mix, per un volume totale di reazione di 20 μl. Nel controllo negativo non va aggiunto DNA, ma solo 20 μl di Master Mix. N.B.: Durante la preparazione della Master Mix tutti i suoi componenti vanno tenuti in ghiaccio. La Taq polimerasi va aggiunta all’ultimo poco prima della reazione di PCR per impedire amplificazioni aspecifiche. Inoltre la Taq (HOTSTART Taq) che andremo ad utilizzare possiede una carattersistica che cerca di limitare le amplificazioni aspecifiche che possono avvenire a temperatura ambiente. Infatti possiede un ligando nel sito attivo che viene rimosso soltanto dopo uno step iniziale a 95°C per 5 minuti.

PCR CALCULATION SHEET Date: 07/12/2005

XRCC1 ex10-XRCC3 ex7 Esercitazione

Components Name or Stock solution Added Final concentrationbrand amount in µl in PCR

Other component DMSO 1 X 0,0 0,00 XdH2O dw 1 X 102,0 0,69 X

10x buffer 10 X 14,8 1,00 XMgCl2 50 mM 5,9 2,00 mMdNTP 1,25 mM 13,1 0,11 mM

Primer 1 20 µM 2,2 0,30 µMPrimer 2 20 µM 2,2 0,30 µMGlycerol 1 X 0,0 0,00 X

DNA Polymerase Taq 5 U/µl 0,7 0,03 U/µl Desired MasterMix volume -> 141,0

To be used in PCR -> 133,0DNA Polymerase added in Hot Start (µl/sample) 0,0 1:10 or 1:5 dilution !!Sample volume (µl) 1,0 Number of samples 7,0 Calculation OKTotal volume of PCR reaction 20,0Add MasterMix 19,0

Total volume -> 140

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Reazione della Multiplex PCR

Condizioni della PCR per XRCC1 399: 94oC 30 sec. - Denaturazione 61oC 30 sec. – Annealing 35 cicli 72 oC 30 sec - Estensione 72 oC 5 min. 4oC for ever.

Condizioni della PCR per XRCC3 241:

94oC 30 sec. - Denaturazione 60oC 30 sec. – Annealing 35 cicli 72 oC 30 sec - Estensione 72 oC 5 min. 4 oC for ever.

Condizioni per la PCR multipla: E’ possibile effettuare una PCR multipla poichè le T di annealing sono molto simili. In questo caso verrà utilizzata la T di annealimg per XRCC1 (61°C).

95°C 5 min – Attivazione della HOTSTART Taq 94oC 30 sec. - Denaturazione 61oC 30 sec. – Annealing 35 cicli 72 oC 30 sec - Estensione 72 oC 5 min. 4 oC for ever.

Check del prodotto di PCR

Prima che il prodotto di PCR venga utilizzato, è necessario verificare che : • Il prodotto si sia formato; • Il prodotto sia della dimensione corretta; • Non ci sia stata contaminazione (in questo caso è presente una banda anche nel

controllo negativo) Preparazione del gel di agarosio Si utilizza un buffer (TBE) 10X, che va quindi diluito 10 volte. Gel al 2%:

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2g di agarosio in 100 ml di buffer 1:10 (diluito, cioè, con H2O distillata).

Far sciogliere alla T = 100o C. Caricare il gel nell’apposita celletta. Far solidificare il gel (occorrono 30 min.) Corsa elettroforetica

Mettere su carta parafilm 1μl di colorante (loading dye) ed aggiungere 5 μl di campione, mettere i campioni colorati nei relativi pozzetti. Lasciare lo spazio per il controllo negativo e per il marker (DNA Ladder 50pb); vanno aggiunti 0,5 – 0,7 μl di marker. Valori per l’elettroforesi: 300 mA;

100 V; 1:20 h (80 min.); 4 W.

Dopo l’elettroforesi, prendere il panetto di gel e lasciarlo immerso per 30 min. in BrEt (1 goccia di BrEt diluito 1:10, in un contenitore di H2O), al buio, a +4oC. Successivamente prelevare il panetto ed immergerlo in H2O per 15 min., per eliminare l’eccesso di colorante, al buio, a +4oC. Verificare alla lampada UV la presenza di DNA. Lettura delle bande

Analizzare le bande ottenute con l’amplificazione. La dimensione delle bande viene calcolata rispetto alle bande del marker (ogni banda ha una dimensione di 50 bp). Dall’analisi delle bande bisogna ottenere:

- una sola banda da 213 bp per XRCC1; - una sola banda da 215 bp per XRCC3; - Controllo negativo → nessuna banda (se compare una banda si è avuta una

contaminazione con DNA che è stato amplificato).

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Terzo Step

Determinazione del genotipo

Digestione enzimatica tramite l’enzima HpaII/MspI per XRCC1 e NiaIII/Hsp92II per XRCC3: Aggiungere ad ogni campione 0,5 μl dell’ enzima di restrizione corrispondente ed incubare a 37oC overnight (o per 4 ore). L’identificazione del genotipo dei campioni esaminati verrà effettuata in base alla presenza di due frammenti di restrizione: XRCC1 ex 10 (l’enzima taglia il sito wt): wt 2 bande a 161bp e 52bp het 3 bande a 213bp, 161bp e 52bp homo 1 banda a 213bp XRCC3 ex 7 (l’enzima taglia il sito polimorfico): wt 1 banda a 215bp het 3 bande a 215bp, 105bp e 110bp homo 2 bande a 105bp e 110bp Esempio di foto di gel: hom het wt hom het het wt hom wt M50 wt hom wt hom het wt M50 Legenda: wt omozigote selvatico; het eterozigote; homo omozigote mutante; Neg controllo negativo.

XRCC1 (Arg 399 Gln)

XRCC3 (Thr241 Met)

213bp 161bp

52bp

215bp

110bp 105bp

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Corsa elettroforetica Successivamente alla digestione enzimatica, i campioni vanno sottoposti ad elettroforesi, in un gel di poliacrilamide; questo passaggio consente la separazione delle bande (qualora il segmento di DNA da studiare sia stato digerito) e, quindi, permette di identificare la presenza del polimorfismo. Gel di poliacrilamide Volume totale : 10 ml. Gel al 10% in TBE. 5,5 ml H2O distillata; 3,5 ml acrilammide (30% ca.); 1 ml buffer (TBE o TAE); 100 μl APS (10%) – (Ammonium Persulfate, si prepara una soluzione di 0,1 g di APS in 1 ml di H2O distillata); 7,5 μl TEMED. L’APS ed il TEMED vanno aggiunti per ultimi, perché determinano la polimerizzazione del gel. Far polimerizzare il gel (40 min. ca.). Elettroforesi Mettere su carta parafilm 1μl di colorante (loading dye) ed aggiungere 5 μl di campione, mettere i campioni colorati nei relativi pozzetti. Lasciare lo spazio per il marker (DNA Ladder 50pb); vanno aggiunti 0,5 – 0,7 μl di marker. Se è stato fatto il check, non è necessario aggiungere il controllo negativo nei pozzetti. Valori per l’elettroforesi: 400 mA;

200 V; 00:20 h (20 min.); 17 W.

Dopo l’elettroforesi, prendere il gel e lasciarlo immerso per 15 min. in BrEt (1 goccia di BrEt diluito 1:10, in un contenitore di H2O), al buio, a +4oC. Successivamente prelevare il gel ed immergerlo in H2O il tempo necessario per l’analisi alla lampada UV. Verificare alla lampada UV la presenza di DNA digerito. Lettura delle bande ottenute Fotografare il gel con la Polaroid ed analizzare le bande ottenute

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I componenti della miscela di reazione

Magnesio

La concentrazione del Magnesio è un fattore cruciale, che influenza la performance della Taq DNA Polimerasi. I componenti della reazione, incluso il DNA templato, gli agenti alchilanti presenti nei campioni (EDTA o citrato), dNTPs e le proteine, influenzano la quantità di Magnesio libero. E’ importante, dunque, che nella preparazione della miscela di reazione non ci siano elevate concentrazioni di agenti alchilanti, come EDTA, o di gruppi ionici negativi, come i fosfati. I dNTPs rappresentano la maggiore parte dei gruppi fosfato nella reazione, quindi una qualsiasi variazione della loro concentrazione influenza la concentrazione del Magnesio disponibile. In assenza di un’adeguata quantità di Magnesio disponibile, la Taq DNA Polimerasi non è attiva. Inoltre, un eccesso di Magnesio disponibile riduce la “fedeltà” dell’enzima e può aumentare il livello di amplificazioni aspecifiche.

Buffer

Il buffer standard per la PCR contiene 50 mM KCl, 10 mM Tris-Cl (PH 8.3 a temperatura ambiente). Quando incubato a 72oC, il PH della reazione diminuisce più di un’unità, producendo un buffer il cui PH è approssimativamente 7.2.

Primers

Gli oligonucleotidi usati per i primers devono avere una lunghezza di almeno 16 nucleotidi e, preferibilmente, di 20-24 nucleotidi. Questi oligonucletidi sono troppo corti per formare ibridi stabili alle temperature usate per la polimerizzazione (72 oC). La Taq Polimerasi inizia a lavorare non appena i primers si sono legati al loro templato alle basse temperature (50-60

oC). I prodotti così estesi sono abbastanza lunghi da rimanere legati al templato, non appena la temperatura è rapidamente aumentata a 72 oC. I primers devono contenere il 40-60% di G+C e va fatta molta attenzione nella scelta della sequenza, perchè con un’ elevata quantità di G+C è possibile la formazione di strutture secondarie interne. Le estremità 3’ dei primers non devono essere complementari, per impedire la produzione di dimeri tra i primer durante la reazione di PCR. Idealmente entrambi i primers si “annilano” alla stessa temperatura. La temperatura di annealing dipende dal primer con la temperatura più bassa (melting temperature – Tm). Generalmente gli oligonucletodi sono usati ad una concentrazione di 1 μM. Questa concentrazione è sufficiente per almeno 30 cicli di amplificazione. La presenza di concentrazioni più elevate di oligonucleotidi può causare “priming” a siti ectopici, con conseguente amplificazione di sequenze indesiderate. Al contrario, la PCR è estremamente inefficiente quando la concentrazione dei primers è limitata.

Deossiribonucleotidi trifosfati (dNTPs)

I dNTPs sono usati a concentrazioni saturanti.

II

Taq DNA Polimerasi

Possono essere utilizzate due forme di Taq DNA Polimerasi: l’enzima purificato dal microorganismo Thermus acquaticus ed una forma geneticamente ingegnerizzata dell’enzima sintetizzato in E.coli. Entrambe le forme di polimerasi hanno un’attività esonucleasica 5’ → 3’, ma mancano dell’attività 3’ → 5’. Le proprietà delle due polimerasi sono sostanzialmente equivalenti. L’aggiunta di un eccesso di enzima può portare ad amplificazioni di sequenze non bersaglio.

Sequenza target

Un’amplificazione corretta della regione d’interesse dipende dalla quantità e dalla qualità del DNA templato. I reagenti comunemente utilizzati per purificare gli acidi nucleici (sali, guanidina, proteasi, solventi organici e SDS) sono dei potenti inibitori delle DNA polimerasi. La precipitazione con etanolo dei campioni di acici nucleici elimina la maggior parte degli agenti inibitori. La quantità di templato richiesta per un’amplificazione corretta dipende dalla complessità del campione di DNA.

Effetti indesiderati durante la reazione a catena

Spesso si possono verificare reazioni a catena indesiderate, che iniziano a temperatura ambiente, una volta che tutti i componenti della reazione sono stati aggiunti. Queste reazioni non volute, includono amplificazioni aspecifiche e formazioni di dimeri tra primers.