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OGM: APPROCCIO ANALITICO MULTI-STEP

Enzo Cortini SC1 Analisi del Rischio e Sorveglianza in Sanità Pubblica Laboratorio Biofood

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OBIETTIVI DELL’ INTERVENTO:

1) ASPETTI E PECULIARITA' DEGLI OGM

2) ANALISI E INTERPRETAZIONE DEI DATI DI LABORATORIO

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DEFINIZIONE DI OGM:

“...un organismo diverso da un essere umano, il cui materiale genetico è stato modificato in modo diverso da quanto avviene in natura con l'accoppiamento e/o la ricombinazione genetica naturale.... (Art.2 Direttiva 2001/18/ CE del 12/03/2001) Queste modificazioni prendono il nome di Trasformazioni o Transegenesi

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L'INGEGNERIA GENETICA:

Le tecniche di ingegneria genetica consentono di produrre OGM introducendo geni estranei provenienti da altri organismi viventi:

- Microrganismi (procarioti ed eucarioti) • - Animali • - Vegetali

Il DNA cosi ottenuto è definito DNA ricombinante L'obbiettivo è in genere quello di conferire caratteristiche utili

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PIANTE GENETICAMENTE MODIFICATE (PGM):

Le PGM sono piante nelle quali è stato inserito un gene proveniente da un organismo “donatore” che può appartenere alla stessa specie della pianta “ricevente”, oppure a specie diverse, o addirittura a regni diversi PGM di Prima Generazione: destinate al miglioramento delle caratteristiche agronomiche

• - Aumento della resistenza agli insetti • - Tolleranza agli erbicidi • - Aumento della resistenza alle malattie

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COME OTTENGO UNA PGM? 1°Step Preparazione del Costrutto di DNA da impiegare nella Trasformazione

1) Scelta della/e sequenza/e di DNA e taglio con un enzima di restrizione 2) Taglio del plasmide con lo stesso enzima di restrizione per generare estremità compatibili 3) Inserimento di una o più “cassette geniche” (sequenza genica di interesse + promotore + terminatore) I) resistenza ad alcuni insetti II) resistenza ad un antibiotico attivo sui batteri III) resistenza ad un secondo antibiotico per la selezione delle cellule vegetali

4) Ligazione Costrutto = Plasmide + cassetta genica

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2° Step: Clonaggio e selezione della popolazione delle

cellule batteriche trasformate

Creato il Costrutto Genico occorre produrne un numero elevato

numero di copie inserendolo in batteri capaci di “amplificarlo”

Solo i batteri “modificati” sopravvivono alla selezione (e si

moltiplicano) grazie alla cassetta genica per la resistenza

all'antibiotico (II)

La popolazione batterica non “modificata” è invece sensibile

all'antibiotico

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3 Step: Trasformazione

L’inserzione di un tratto di DNA estraneo (costrutto genico), nel

genoma «ospite» di una cellula vegetale

Tecniche di Trasformazione maggiormente utilizzate:

1) Vettori plasmidici es…Agrobaterium Tumefaciens

2) Tecnica “biolistica”

3) Elettroporazione

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Fonte: BATS (Center for Biosafety Assesment Technology and Sustainability), Swittzerland

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4° step: Selezione assistita delle nuove piante “Evento di

trasformazione” mediante appostiti marcatori

es. - resistenza ad un antibiotico

- sistema G.U.S. (beta-glucoronidasi)

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Un esempio di pianta transgenica il Mais BT11 Nel genoma della pianta sono state inserite 6 copie del gene Cry I Ab (resistenza agli insetti) e del gene bla (resistenza alle penicelline) ed almeno 2 copie del gene bar (tolleranza al glufosinato)

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Le colture GM maggiormente diffuse sono: •soia •mais •cotone •colza Le principali modificazioni riguardano la resistenza agli erbicidi e la resistenza ad insetti.

COLTIVAZIONI OGM NEL MONDO

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Stato delle autorizzazioni degli alimenti e dei mangimi GM in EU:

12 eventi soia (di cui 1 stacked)

(+7 in corso di autorizzazione)

39 eventi mais (di cui 26 stacked)

(+9 in corso di autorizzazione)

7 eventi colza (di cui 3 stacked)

(+2 in corso di autorizzazione)

10 eventi cotone (di cui 3 stacked)

(+1 in corso di autorizzazione)

1 evento barbabietola da zucchero

2 Microorganismi GM

71 eventi autorizzati

+

19 eventi che ricadono

Reg.(UE) 619/2011

Aggiornamento 17/06/2015

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QUADRO NORMATIVO OGM

Direttiva 2001/18/CE Reg.(CE) n. 1829/2003

Reg.(CE) n. 1830/2003

Reg.(UE) n. 619/2011

Reg.(UE) n. 691/2013 del 19 Luglio 2013

Reg.(CE) n. 834/2007

Reg.(CE) n. 65/2004

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LIMITI DI LEGGE Reg.(CE) n. 1829/2003

OGM autorizzati : obbligo di etichettatura > 0.9% di un singolo ingrediente alimentare o al singolo componente di un mangime OGM autorizzati : non sussiste obbligo di etichettatura ≤ 0.9% di un singolo ingrediente alimentare o al singolo componente alimentare purché la presenza sia accidentale o tecnicamente inevitabile

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Piano Nazionale di

controllo alimenti GM

2015-2018

CONTROLLO UFFICIALE OGM IN ITALIA

Piano Nazionale di

controllo mangimi

GM 2015-2017

Piani Regionali

EMERGENZE - RASFF

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b) ESTRAZIONE DEL DNA

c) ANALISI IN REAL TIME PCR

FLUSSO ANALITICO DEI CAMPIONI PER RICERCA DI OGM

a) PREPARAZIONE DEL CAMPIONE DI LABORATORIO

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MATRICI OGGETTO DI RICERCA OGM GRANELLE: gli OGM sono considerati sostanze distribuite in modo NON OMOGENEO nel prodotto

1 solo chicco può essere GM

Per ovviare al problema occorre rendere OMOGENEO il campione in analisi all’atto del campionamento attraverso la macinazione

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ARRIVO DEL CAMPIONE IN LABORATORIO

N.B: Il campione deve essere miscelato il più possibile e ciò si ottiene attraverso l'uso di un frullatore a lame o nel caso di materie prime in grani attraverso un mulino

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Miscelazione manuale

Formazione del campione analitico

250 g di campione

Il campione deve essere miscelato il più possibile e ciò si ottiene attraverso l'uso di un frullatore a lame o nel caso di materie prime in grani attraverso un mulino

Pesata del campione

2 g (5 g per riso e mangimi)

a) PREPARAZIONE DEL CAMPIONE DI LABORATORIO

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b) ESTRAZIONE DEL DNA Da ricordare sempre L'obiettivo di un metodo di estrazione è quello di ottenere un «DNA»: In quantità adeguata Non degradato Puro e privo di sostanze inibenti Con un metodo che sia veloce ed economico nella sua esecuzione

Due replicati di estrazione di DNA per ciascun campione analitico

A B

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Proteinasi K

+ Campione

+ Lysis /

Binding

Buffer

Membrana di

silice

Eluente (Eluition

Buffer o H2O) a

bassa

concentrazione

salina

NB: Per

rimuov

ere

impurit

à.

METODO CON COLONNINE IN SILICE

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Lisi del campione in buffer acquoso CTAB (hexadecyl-trimetyl ammoniumbromide)

Necessario a solubulizzare la membrana plasmatica delle cellule da cui si ottiene una

miscela di componenti intracellulari (DNA, RNA, proteine e carboidrati).

l'EDTA presente nel tampone di lisi elimina i cationi bivalenti e inibisce l'azione

delle DNAsi.

Aggiunta di Rnase A e Proteinase K e incubazione a 65°C x 30'

Separazione mediante centrifugazione della parte solida di estrazione

Solubilizzazione della contaminante proteica con Cloroformio

Precipitazione del DNA con Isopropanolo

METODO CTAB

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QUANTIFICAZIONE DEL DNA

Lettura spettrofotometrica basata sull'Assorbanza del DNA a 260nm

rapporto di Assorbanza 260/280 > 1.8

In base alla concentrazione del DNA ottenuta si proseguirà nelle analisi in

Real Time PCR, per ciascun replicato di estrazione in doppia replica

come segue:

Monitor run HMG-LECTINA-GS- PLD DNA> 40ng/uL Analisi: DNA a 40ng/uL e 10ng/uL

Monitor run HMG-LECTINA-GS- PLD DNA < 40ng/uL Analisi: DNA Tal quale e dil 1:4

Monitor run SAD DNA < 20ng/uL Analisi: DNA Tal quale e dil 1:4

Monitor run SAD

DNA > 20ng/uL

Analisi: DNA a 20ng/uL e 5ng/uL

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APPROCCIO MULTI STEP ALL’ANALISI OGM

1) Screening specie vegetale dichiarata in etichetta (geni endogeni di specie)

2) Screening costrutti genici

3) Ricerca evento transgenico specifico

4) Quantificazione evento transgenico rilevato

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HMG LECTINA

Reg. (CE) n. 1829/2003

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ESTRA

1) Screening specie vegetali dichiarate in etichetta

Presenza di DNA di Soia… POS

NEG DNA di specie assente o non amplificabile

La “monitor PCR” specie-specifica, detta anche “Inhibition run” fornisce evidenza della presenza , nel campione, di DNA amplificabile appartenente alla specie vegetale dichiarata in etichetta o nel documento commerciale Valutazione del ∆Ct tra le curve a differente concentrazione

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MAIS HMG: sequenza che codifica per la proteina High Mobility group

SOIA LECTINA: sequenza che codifica per la Lectina

RISO PLD: sequenza che codifica per la proteina

Fosfolipasi D

1) Screening specie vegetale dichiarata in etichetta (geni endogeni di specie)

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Barbabietola

da

zucchero

GS: seqenza che codifica per la proteina Glutamine Synthetase

LINO SAD: sequenza che codifica per la proteina stearoyl-acyl carrier desaturase

UPGase: sequenza che codifica per la proteina

UDP-glucose pyrophosphorilase PATATA

1) Screening specie vegetale dichiarata in etichetta (geni endogeni di specie)

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COLZA

COTONE Acp1 sequenza che codifica per Acyl carrier protein

1) Screening specie vegetale dichiarata in etichetta (geni endogeni di specie)

CruA promotore del gene cruciferina A

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Promotore 35S: sequenza promotore 35S del Virus del mosaico del cavolfiore Terminatore NOS: gene Nopalina sintetasi di Agrobacterium tumefacies PAT: gene fosfotricin acetiltransferasi di Streptomyces viridocrhromogenes NPTII: gene per neomicin fosfotransferasi II di Escherichia coli CP4-EPSPS: derivato dal ceppo CP4 di Agrobacterium tumefacies Costrutto CTP-CP4-EPSPS: derivato dalla congiunzione della sequenza codificante per CTP da Arabidopsis thaliana e la sequenza EPSPS dal ceppo CP4 di Agrobacterium tumefacies

2) Screening costrutti genici

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1) Screening specie vegetale dichiarate in etichetta

2) Screening costrutti genici

POS

POS Presenza gene/costrutto

NEG Assenza gene/costrutto

ESISTONO ECCEZIONI

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p35S Tnos NPTII PAT CP4-

EPSPS

(IT)

CTP-

CP4EPSP

S (IT)

CTP2-

CP4EPSP

S

(DE/ISO)

BAR

ATTESO

VERIFI

CATO ATTESO

VERIFI

CATO

ATTE

SO

VERIFI

CATO

ATTE

SO

VERIFI

CATO

ATTE

SO**

VERIFICA

TO

VERIFICA

TO

VERIFICA

TO ATTESO

VERIFI

CATO

cotone MON1445 7 P + P + P + A - P - + +3

A -4

cotone MON15985 8 P + P + P + A - A - - A -4

cotone MON531 7 P + P + P + A - A - - A -4

cotone LL25 P + P + A - A - A - - P +3;4

cotone GHB614 A - A - A - A - A - - A

cotone 3006-210-23 x 281-24-236 A - A - A - P + A - - A -4

cotone MON88913 8 P1

+ A - A2

+ A - P - + +3

A -3

cotone GHB119 P + P + A - A - A - - P +3

cotone T304-40 P + P + A - A - A - - P +3

mais Bt11 P + P + A - P + A - - A -4

mais DAS1507 P + A - A - P + A - - -3;4

A -4

mais DAS59122 P + A - A - P + A - - -4

A -4

mais GA21 A - P + A - A - A - - -3;4

A -4

mais MIR162 A - P + A - A - A - - -3

A

mais MIR604 A - P + A - A - A - - -3

A -4

mais MON810 P + A - A - A - A - - -3;4

A -4

mais MON863 P + P + P + A - A - - A -4

mais MON88017 P + P + A - A - P + - +3;4

A -4

mais NK603 P + P + A - A - P + - +3;4

A -4

mais T25 P + A - A - P + A - - -4

A -4

mais MON89034 P + P + A - A - A - - A

mais 3272 A - P + A - A - A - - -4

A -3;4

mais 98140 P + A - A - A - A - - A

mais DAS40278-9 A - A - A - A - A - - A -3

mais MON87460 P + P + P + A - A - - - A -

mais Bt176 (b) 6 P + A - A - A - A - - -4

P +3;4

mais LY038 A - A - A - A - A - - -3

A -3

mais DAS59132-8 (Event 32 or E-32) P + A - A - P + A - - A

colza MS8/RF3 A - P + A - A - A - - -4

P +3;4

ELEMENTO DI SCREENING

COSTRUTTO CTP-EPSPS (3 METODI):

Specie vegetale Evento GM

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1) Screening specie vegetale dichiarate in etichetta

2) Screening costrutti genici

3) Ricerca evento specifico

POS

POS

POS Rilevato DNA di Soia RRS… NEG

Contaminzaione botanica? Contaminazione in tracce?

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1) Screening specie vegetale dichiarate in etichetta

2) Screening costrutti genici

3) Ricerca evento specifico

4) Quantificazione evento transgenico rilevato

POS

POS

POS

Valore riscontrato in %

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Il metodo che utilizziamo è la Quantificazione Relativa è basato sulla valutazione del Ct: Ct dell' evento transgenico che si sta cercando (es. RRS Round up Ready Soy evento MON 40-3-2) VS Il Ct del gene specifico di specie (es. Lectina) Per fare questo si costruisce una curva standard utilizzando Materiale certificato (CRM) a concentrazione nota di materiale GM

4) Quantificazione evento transgenico rilevato

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Algoritmo di calcolo quantificazione relativa

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PER CONCLUDERE (1):

Se si tratta di OGM autorizzati > 0.9% dichiarato in etichetta: CAMPIONE CONFORME

< 0.9% NON dichiarato in etichetta: CAMPIONE CONFORME > 0.9% NON dichiarato in etichetta: CAMPIONE NON CONFORME

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PER CONCLUDERE (2):

Il crescente numero a livello Europeo di eventi di trasfromazione che vengono

autorizzati rende, dal punto di vista analitico, sempre più difficile per i laboratori

rimanere al passo.

A tal riguardo lo sviluppo tecnologico sarà un valido supporto????

– Sviluppo di metododi di screening usando multiplex real time PCR

– DDPCR (Digital Droplet PCR)

– NGS Next Generetion Sequencing

SI

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ecortini@izsvenezie.it

Grazie per l'attenzione