Metodi spettroscopici: si basano sulla misura delle variazioni di energia che si verificano a carico di nuclei, atomi o molecole in seguito ad interazione tra una radiazione elettromagnetica e la materia

Spettroscopia di assorbimento: si basa sulla riduzione della intensità della radiazione elettro magnetica come conseguenza della sua interazione con l’analita

Spettroscopia di emissione: determinazione dell’intensità della radiazione emessa quando l’analita viene eccitato con energia termica elettrica o radiante

Spettroscopia atomica Spettroscopia molecolare

La radiazione elettromagnetica è una forma di energia che viene trasmessa nello spazio ad elevate velocità

La radiazione elettromagnetica può essere descritta sia in termine di onde (1) che di particelle

Modello ondulatorio: la radiazione e.m. è generalmente prodotta dal movimento periodico di una carica elettrica e consiste in campi magnetici e campi elettrici oscillanti e tra loro perpendicolari

(1) Proprietà dell’ onda elettromagnetica: (lunghezza d’onda) = distanza che intercorre tra due creste d’onda

I = ampiezza o intensità della radiazione

E, H vettore elettrico e magnetico generati dalla radiazione, che nel caso di una

radiazione polarizzata, vibrano in 2 piani tra loro perpendicolari

(frequenza) = è il numero di onde o oscillazioni contenuti nell’unità di tempo

= c

Nel vuoto la luce viaggia alla max velocità (c).

c= velocità della luce (2.998x108 m/s nel vuoto). In qualsiasi altro mezzo la

velocità della luce è c/n, dove n è l’indice di rifrazione del mezzo.

NB: la frequenza è una grandezza caratteristica di una vibrazione luminosa e

pertanto è indipendente dal mezzo in cui avviene la propagazione.

Quando la luce attraversa due mezzi con n diverso, la sua frequenza rimane

invariata ma la cambia

c

=

Da un punto di vista energetico possiamo considerare la radiazione e.m. come un treno di particelle (quanti) ciascuno dei quali è dotato di una certa energia

E= hEquazione di Planck

h = costante di Planck = 6.63 x10-22 erg sec-1

c

=Dato che

si deduce che l’energia di una radiazione e.m. è direttamente

proporzionale alla frequenza e inversamente proporzionale alla

lunghezza d’onda

E= hc/

SPETTRO ELETTROMAGNETICO

COPRE UN INTERVALLO ENORME DI ENERGIE, FREQUENZA E LUNG. D’ONDA

Mostra le regioni dello spettro e.m. usate nei metodi spettroscopiciTipi di transizioni che risultano dalle interazioni della radiazione con un campione

Metodi ottici

Spettroscopia di assorbimento di radiazioni (UV-VIS-IR)

Le interazioni delle radiazioni e.m. con le molecole può indurre:

1) Variazione della frequenza di rotazione della molecola intorno ad un loro asse (spettri

rotazionali)

2) Variazione della frequenza di vibrazione a carico di un legame tra due atomi (spettri

vibrazionali)

3) La transizione di un elettrone di valenza nel caso di atomi o di un elettrone di un orbitale

molecolare nel caso di molecole, da un livello interno ad uno più esterno (spettro

elettronico)

I tre tipi di spettri si ottengono con energie molto diverse: infatti una transizione

elettronica può essere prodotta solo da radiazioni UV-VIS, mentre le transizioni

vibrazionali e rotazionali da radiazioni IR lontano o vicino

Orbitali atomici

Gli orbitali atomici interessati nelle transizioni elettroniche sono quelli di tipo s, p,d

Orbitali s: a simmetria sferica: la carica dell’elettrone è distribuita in modo

simmetrico rispetto al nucleo. Si possono rappresentare con una sfera entro la

quale la funzione d’onda è sempre positiva.

Nell’orbitale 1s non ci sono nodi, ossia non ci sono punti in cui la probabilità di

trovare l’elettrone sia nulla.

1s

Aumentando il numero quantico passiamo all’orbitale 2s, sferico, in cui è presente un nodo (> energia)

(+) (-)

Orbitale 2p: orbitale di tipo di ellissoide, con segni opposti di nei due lobi (esiste un nodo)

nodo

Orbitale 3s: 2 nodi (aumentando il numero quantico aumentano i nodo e l’energia)

Orbitali molecolari

La combinazione lineare di due orbitali 1s può dare luogo a due diversi orbitali , uno definito legante e l’altro antilegante

La radiazione UV di 120 nm determina una transizione *

Sovrapposizione orbitali 2p

Un terzo tipo di orbitale molecolare è costituito dagli orbitali non leganti, formati cioè dagli elettroni atomici esterni, non impegnati in un legame molecolare (es. gli elettroni non condivisi dell’ossigeno dei gruppi carbonilici).

Questi elettroni possono essere promossi dall’orbitale non legante “n” stabile, ad uno antilegante

n *

n *

Tipi di transizione

ene

rgia

Antilegante *

Antilegante *

Non legante n

legante

legante

* L’energia perché avvenga tale transizione è molto elevata: fornita solo da

radiazioni UV lontano Un elettrone in un orbitale di legame s viene eccitato al

corrispondente orbitale di non legame. L’energia richiesta è grande. Ad esempio il metano,

che possiede solo legami s C-H, può dar luogo solo a questo tipo di transizione mostra un

massimo di assorbanza a 125nm . Transizioni di questo tipo non sono quindi visibili con i

normali spettrofotometri e bisogna far ricorso a tecniche di registrazione “in vuoto”.

Transizioni tipiche degli idrocarburi

n * corrisponde alla promozioni di un e di non legame ad uno di antilegame * (es

eteri, ammine, solfuri, alogenuri). Le transizioni n * possono dare luogo ad assorbimento

a diverse, a seconda della natura dell’eteroatomo: alcoli ed eteri assorbono nell’UV

lontano e sono quindi trasparenti nella zona di lunghezza d’onda > 180 nm; ammine, solfuri,

alogenuri assorbono nell’UV vicino a causa del fatto che i loro rispettivi elettroni di non

legame sono trattenuti meno stabilmente nei corrispondenti orbitali atomici di non legame

208Bromuro di metileBromuro

173Cloruro metilicoCloruro

259Ioduro metilicoIoduro

213MetilamminaAmminico

210DimetilsolfuroTioetere

185DietiletereEtere

231ButantioloSulfidrile

183MetanoloOssidrile

176AcquaOssidrile

max (nm)EsempioGruppo

Esempi di transizioni n *

Alcoli ed eteri assorbono nell' UV lontano dipende dalla natura dell' eteroatomo

* composti che contengono un solo doppio legame etilenico, triplo legame

di tipo acetilenico o nitrilico danno luogo a transizioni * nell’ UV lontano,

mentre composti contenenti gruppi carbonilici (aldeidi-chetoni), carbossilico,

azo, nitro, nitroso, nitrato, nitrito danno

* ( > 200 nm) nell’ UV vicino

Le bande * si suddividono in:

a) K o di coniugazione - sistemi molto delocalizzati come sistemi aromatici e coniugati 220 – 750 nm > 104

a) B benzenoide – aromatici, banda classica benzene, non permessa dalla restrizioni di simmetria e quindi poco intensa

= 270 nm > 102

a) E etilenica – tipica di sistemi insaturi non coniugati = 180 – 230 nm = 2x103- 104

Orbitale di antilegame C=O

Orbitale di non legame O

Orbitale di legame C=O

Orbitale di legame

Diagramma degli orbitali molecolari della formaldeide

C O

H

H

C O

H

H

Cromoforo: porzione della molecola responsabile dell’assorbimento.Tutti i gruppi cromofori producono shift BATOCROMICI (o shift rosso),cioè uno spostamento del massimo di assorbimento verso lunghezzed’onda maggiori. Solitamente cromofori isolati danno assorbimenti di bassa intensità e a valori di < 200 nm. Quando in una molecola sono presenti cromofori tra loro coniugati si ottengono picchi di assorbimento intensi e a > 200 nm. La saturazione di un gruppo insaturo produce uno shift IPSOCROMICO (o shift blu), cioè unospostamento verso minori.

La coniugazione consente una delocalizzazione degli elettroni di legame con

conseguente stabilizzazione degli orbitali di antilegame * e conseguente

abbassamento del loro livello energetico.

Auxocromo: un gruppo saturo con elettroni non leganti che quando legato ad un

cromoforo comporta una variazione dell’intensità e della (es. OH, NH2, Cl-)Un effetto che produca una variazione del coefficiente di estinzione molare viene definito IPERCROMICO oIPOCROMICO, a seconda che la variazione si positiva o negativa. Effetti Iper- ed Ipocromici sono causati da sostituenti non cromofori detti AUXOCROMI e sono rappresentati in genere da gruppi contenti doppietti elettronici non condivisi.

200 250 300 350 400

Shift batocromico (red shift)Shift ipsocromico (blu shift)

Shift ipercromico

Shift ipocromico

Transizioni energetiche

A temperatura ambiente atomi e molecole si trovano nel rispettivo stato fondamentale, cui

corrisponde la minima energia; quando vengono sollecitati da una opportuna quantità di

energia, passano in uno stato eccitato, cui corrisponde una maggiore energia.

Lo stato eccitato non è stabile e dura per tempi brevissimi, atomi e molecole tendono a

tornare allo stato fondamentale restituendo all’ambiente l’energia assorbita (l’energia

assorbita viene riemessa sotto forma di calore, radiazione)

E1

E2

Assorbimento Rilassamento

+E - E

Energia interna delle molecole

Come nel caso degli atomi, anche le molecole hanno una energia interna dovuta ai diversi

contributi:

Emolecola= Eelettronica +Erotazionale+Evibrazionale

Erotazionale è associata alla rotazione della molecola su se stessa (intorno a uno o più assi),

Evibrazionale è associata al movimento reciproco degli atomi nella molecola

Erotazionale+ Evibrazionale definiscono la energia cinetica della molecola (proporzionale alla

temperatura).

Tipi di vibrazioni molecolari

Rappresentazione schematica dei livelli energetici molecolari. A ogni livello elettronico sono associati diversi livelli vibrazionali e a ciascuno di questi, a sua volta, diversi livelli rotazionali

Eto

tale =

Eel

ettr

onic

a +

Ero

tazi

onal

e+E

vibr

azio

nale

Stati elettronici Stati vibrazionali Stati rotazionali

L’energia delle molecole (come quella degli atomi) è quantizzata, per cui

sono “permessi” solo determinati livelli di energia

La banda di assorbimento consiste quindi di un numero molto elevato di linee, corrispondenti alle diverse transizioni vibrazionali e rotazionali.

In una soluzione, le specie assorbenti sono circondate dal solvente e la natura a banda dell’assorbimento diventa slargata poiché le collisioni che si verificano in soluzione tendono ad allargare le energie degli stati quantici

Spettro UV-VIS della1,2,4,5 tetrazina

Regole di selezione

Le regole di selezione, previste dalla meccanica quantistica, indicano quali transizioni sono permesse e quali no, o più precisamente, quali sono le transizioni più probabili.

La regola di selezione principale è che in corrispondenza di una transizione energetica è necessario che il sistema possa comportarsi come un dipolo elettrico oscillante (un dipolo è un sistema costituito da due cariche di segno opposte distanziate).

Questa regola si spiega tenendo presente che il campo elettrico associato a ogni radiazione e.m. può scambiare energia con la materia solo a condizione che quest’ultima possa comportarsi in modo analogo: un dipolo oscillante genera un campo elettrico oscillante in grado di interagire con quello della radiazione

La probabilità di transizione è tanto maggiore quanto più il momento di transizione è diverso da zero : una molecola può assorbire energia solo se i momenti dipolari elettrici dello stato eccitato e di quello fondamentale sono diversi da 0

La legge dell’assorbimento

Legge sperimentale che descrive i fenomeni di assorbimento di radiazioni elettromagnetiche (legge di Lambert-Beer): la q.tà di radiazione attenuata (assorbita) dipende dalla concentrazione delle molecole che assorbono e dal cammino ottico nel quale avviene l’assorbimento

Trasmittanza (T) = P

P0

T% = P

P0

X 100Assorbanza (A) = - logT = log

P0

P

Trasmittanza è la frazione diluce incidente trasmessa dallasoluzione.

A = k d c

Dove A = assorbanza (adimensionale)

d = cammino ottico (cm) (spessore della soluzione attraversata dal

raggio)

C = concentrazione della specie che assorbe (espressa in mol/L o g/L o

g/100 ml)

k = è una costante che dipende dalla sostanza esaminata, dal solvente,

dalla lunghezza d’onda ed ha valori numerici e sigle diversi a seconda delle unità

di misura utilizzate per esprimere la concentrazione

L’assorbanza si determina sperimentalmente mediante strumenti chiamati spettrofotometri, ponendo la soluzione da esaminare in una cella (cuvetta) trasparente alla radiazione e.m. e di cammino ottico noto

In particolare:

-Quando C è espressa in moli/L, k , indicato con prende il nome di assorbività

molare o coefficiente di estinzione molare. Le dimensione di sono quindi L

mol-1 cm -1

-Quando C viene espresso in g/L, k, indicato con la lettera a, prende il nome di

assorbività. Le dimensione di a sono L g-1 cm-1. Questo modo di esprimere k è

tipico della letteratura americana e si utilizza quando il PM non è noto

-Qundo C viene espresso in g/100 ml, k, viene indicato con A(1%, 1cm) e prende

il nome di assorbanza specifica (si trova anche espresso come E(1%1cm), coeff.

di estinzione specifico)

La conversione da una forma all’altra è possibile tramite le relazioni seguenti:

aA(1%,1cm)

10

PM= =

Il valore della costante k dipende dalla lunghezza d’onda a cui viene effettuata la misura dell’assorbanza. Per convenzione viene riportato il valore di misurato alla max (max)

Caratteristiche di assorbimento di composti organici

1. Composti contenenti solo elettroni Idrocarburi saturi. Dato che l’energia per transizioni * è dell’ordine di 185

kcal/mole, tale transizione avviene solamente nell’UV lontano <180 nm

2. Composti saturi contenenti elettroni n

Composti saturi contenenti eteroatomi come ossigeno, azoto, zolfo o alogeni,

posseggono elettroni non leganti (n) oltre a elettroni di tipo . La transizione n

* richiede meno energia * e questo consente un assorbimento 200-

220nm. Solfuri, disolfuri, tioli, ammine, bromuri e ioduri possono mostrare un

assorbimento > 200 nm ma solitamente di debole intensità per essere

considerato diagnostico

3. Composti contenenti elettroni Cromofori singoli assorbono nel lontano UV e non nel vicino UV (solo

assorbimento di bassa intensità)

3.1 Cromofori etileniciIl cromoforo etilenico isolato assorbe nell’UV lontano (*). La sostituzione alchilico comporta uno shift batocromico e aumenta all’aumentare del numero di sostituenti alchilici. Le caratteristiche di assorbimento dei cicloalcheni è simile a quelle dei composti aciclici

Quando una molecola contiene due o più legami etilenici, isolati tra loro da almeno un gruppo metilenico, la molecola assorbe alla stessa di una molecola contenente un solo legame etilenico (l’intensità è proporzionale al numero di doppi legami presenti)

200 250 300 350 400

Shift batocromico (red shift)Shift ipsocromico (blu shift)

Shift ipercromico

Shift ipocromico

In un sistema dienico coniugato (es 1,3 butadiene), quando la coplanarità lo permette, si instaura una sovrapposizione degli orbitali , che risulta in un sistema - coniugato.La coniugazione comporta la creazione di due nuovi stati energetici

Antileganti *

Leganti *

All’aumentare della

coniugazione, la di

energia tra orbitali e *

diminuisce: aumentano gli

orbitali per combinazione

lineare dei singoli

cromofori

Un metodo empirico per predire l’effetto batocromico di sostituenti alchilici

nell’1,3butadiene è stato formulato da Fieser e Woodward (buona predizione fino a 4 doppi

legami):

- Ogni gruppo alchilico (o residuo di anello) legato al sistema dienico comporta uno shift

batocromico di 5 nm

- Ogni doppio legame esociclico comporta un ulteriore contributo di 5 nm

Sistema eteroanulare

Sistema omoanulare

Nel caso in cui il poliene coniugato contiene più di quattro doppi legami, si utilizzano le

regole di Fieser Kuhn

Licopene

-carotene

Cromofori carbonilici

I composti carbonilici contengono: -una coppia di e -una coppia di e -due coppie di e di non legame

Quindi le possibili transizioni sono le seguenti: * (150 nm)- n * (190 nm)- n * (270-300nm – banda R- , molto debole <30)

Aldeidi e chetoni saturi

L’assorbimento n * di aldeidi e chetoni è estremamente debole. L’introduzione di un -alogeno ha un minimo effetto

Aldeidi e chetoni ,-insaturi

Composti contenenti un gruppo carbonilico coniugato con un gruppo etilenico

sono chiamati enoni. Da un punto generale gli enoni sono caratterizzati da

una intensa banda di assorbimento (banda K) nella regione 215-250 nm ( 10000-20000) e una banda debole (n *) (banda R) a 310-330 nnm

Acidi carbossilici saturi e coniugati

Acidi carbossilici saturi mostrano un debole assorbimento a circa 200 nm dovuto

alla transizione proibita n *

Acidi carbossilici insaturi mostrano una caratteristica e intensa banda K a 200

nm e = 10000

Esteri e lattoni

Esteri e sali sodici di acidi carbossilici mostrano un assorbimento a lunghezze

d’onda e di intensità comparabile ai corrispondenti acidi. La coniugazione ha un

effetto simile ai corrispondenti acidi

Regole per la predizione assorbimento di enoni e dienoni

Dato che i composti carbonilici sono polari, risentono dell’effetto solvente. La banda R risente dell’effetto ipsocromico associato all’aumentata polarità del solvente

STRUMENTAZIONE

SORGENTESORGENTE

MONOCROMATOREMONOCROMATORE

CELLACELLA

RIVELATORERIVELATORE

ELABORATORE DATIELABORATORE DATI

-sorgente: lampada che emette radiazioni nell’intervallo spettrale di misura

-monocromatore: sistema che permette di selezionare r.e.m monocromatiche

-cella: in cui è posto il campione

-rivelatore: che misura intensità della radiazione

111

È costituita da lampade che emettono radiazioni nell’intervallo spettrale di misura, che può essere il campo spettrale dell’UV oppure del visibile.

regione del visibilevisibile. Si usano lampade a incandescenza come quelle a filamento di tungsteno. Coprono l’intervallo di lunghezza d’onda da 930 a 320 nm

regione dell’UV. Si usano lampade a deuterio. Si tratta di lampade ad arco in cui il bulbo di quarzo è riempito di deuterio che, eccitato, emette uno spettro continuo di radiazioni al di sotto di 400nm.

Sorgente

Lampada al D2Lampada al tungsteno

112

MONOCROMATORI

Le lampade emettono radiazioni in tutte le direzioni dello spazio e quindi per

ottenere un fascio di luce sottile e ben focalizzato, è necessario un sistema ottico

costituito da lenti, specchi e fenditure. Tale fascio viene quindi inviato sul

monocromatore che “scompone” la radiazione policromatica in bande il più

possibile monocromatiche. La PRECISIONE d’analisi dipende dal fatto che la

radiazione incidente sul campione sia monocromatica

Ne esistono di due tipi:

FILTRIFILTRI, che assorbono una parte delle componenti spettrali della radiazione

incidente e ne trasmettono una gamma più o meno ampia

• PRISMI o RETICOLIPRISMI o RETICOLI, che diffrangono la luce policromatica “separandola” nelle

diverse componenti monocromatiche

114

1) AMPIEZZA DELLA BANDA PASSANTE

Intervallo di lunghezze d’onda del fascio che emerge dalla fenditura con

un’energia superiore al 50%dell’energia della radiazione nominale (espressa

in nm)

Imax

½ Imax

Inte

nsità

de

lla r

adi

azio

ne

(nm)

1

0.5

580560 600

Una radiazione di 580 nm (nominale), di

un monocromatore con banda banda

passante passante di 20 nm, comprende anche

le radiazioni fra 570 nm e 590 nm, con

intensità pari alla metà (0.5 Imax) di

quella nominale.

La qualità di un monocromatore è definita da due parametri: l’ampiezza della banda passante e il potere risolvente

2) POTERE RISOLVENTE (o RISOLUZIONE SPETTRALE)

Capacità del monocromatore di separare fra loro due diverse lunghezze d’onda.

R = / lDifferenza fra le due lunghezze d’onda

Distanza misurata sul piano della fenditura di uscita del monocromatore (mm)

113

FILTRI

I più comuni sono i filtri di assorbimento (simili a quelli un tempo usati in fotografia) e

vengono utilizzati nei colorimetri piu economici. Dato che sono in vetro , non possono

essere utilizzati per analisi nell’UV. La banda passante è solitamente elevata

PRISMI e RETICOLI

Il prisma ottico è in grado di scomporre la luce policromatica nelle sue componenti

monocromatiche. La selezione della radiazione monocromatiche viene quindi effettuata

mediante la fenditura

I reticoli di riflessione (da 3 a 10 cm) sono costituiti da una serie di solchi paralleli (da 200 a 3000 solchi/mm) tracciati sopra una superficie riflettente (resina ricoperta da alluminio oro o platino), piana o concava

Reticolo a gradini

116

Cellette o cuvette

Servono per contenere il campione.

Sono cotruiti con materiale trasparente

alla regione spettrale di interesse:

- vetro o di polistirene (monouso) per il

visibile

- Quarzo per l’UV

Il cammino ottico può variare a seconda

dell’impiego (solitamente 1 cm).

Si distinguono inoltre dalla forma e dal

volume contenuto (es. 1 ml, 3ml)

Solitamente le cuvette sono caratterizzate da due facce ottiche (attraverso le quali passa la

radiazione) e da due facce (opache) che servono per maneggiarle.

Le facce ottiche devono essere perfettamente pulite ed asciutte.

117

Trasforma l’energia radiante in un segnale elettrico, proporzionale all’energia che lo investe.

1)1) Celle fotovoltaicheCelle fotovoltaiche. Si basano sulle proprietà dei semiconduttori (selenio) i cui e più esterni possono essere eccitati con relativa facilità. Le radiazioni UV/visibile hanno sufficiente energia per promuovere queste transizioni elettroniche che a loro volta generano una corrente elettrica (proporzionale al numero di fotoni che raggiunge il rivelatore)

Caratteristiche: intervallo ristretto di (400 – 750 nm) bassa sensibilità tendenza all’affaticamento robusti costi contenuti

RIVELATORE

118

2) Fototubi La risposta di un fototubo è basato sull’effetto fotoelettrico (emissioni di e dalla

superficie di alcuni materiali cui sia applicata una ddp, qualora colpito da una radiazione

luminosa). Un fototubo consiste in un catodo semicilindrico e un anodo a filamento

inseriti in un tubo di vetro o quarzo sottovuoto. Il catodo supporta un materiale

fotoemissivo (metallo alcalino) che emette elettroni quando irradiato con radiazioni di

opportuna energia. I fotoelettroni emessi sono quindi attratti dall’anodo

Caratteristiche:

• intervallo ampio di (190 –

1000 nm)

• migliori prestazioni rispetto

alle celle f.

• tendenza all’affaticamento

(protetti dalla luce ambientale)

• costo medio

119

3) Fotomoltiplicatori3) Fotomoltiplicatori. Variante dei fototubi, caratterizzati da una sensibilità superiore; gli

e emessi dal catodo vengono accelerati da un campo elettrico e quindi acquistano

energia; quando colpiscono una seconda superficie fotoemissiva (diodo), liberano

un numero di e superiore; gli e cosi liberati colpiscono i dinodi successivi in modo da

amplificare il segnale. Il rapporto di amplificazione (guadagno) può arrivare fino a

109 e per ogni fotone incidente

Caratteristiche:

• elevata sensibilità

• costo elevato

4) FotodiodiIl silicio cristallino è un semiconduttore (conducibilità elettrica intermedia tra quella di un

metallo e di un isolante) 4 e di valenza 4 legami covalenti. A T ambiente, l’energia

è sufficiente a liberare un e dallo stato di legame (formazione carica positiva o buca). La

conduzione comporta lo spostamento di e e buche in direzioni opposte. La conducibilità

è aumentata per aggiunta di piccole q-tà di un elemento del V gruppo (Arsenico, 5 e di

valenza) o del III gruppo (Gallio, 3 e di valenza) doping

Giunzione pn o diodo pn

Gli e e le buche si muovono verso la

giunzione in cui si annullano. Il terminale

neg. induce nuovi e, che continuano il

processo di conduzione. Il terminale pos.

estrae e creando nuove buche

Nel diodo a polarizzazione inversa si

instaura uno strato di deplezione. La luce

incidente comporta la formazione di

coppie e/buche che aumentano la

conducibilità del diodo che viene registrata

Polarizzazione diretta Polarizzazione indiretta

Rivelatore a serie di diodi

E possibilie affiancare su un singolo chip 1000 o più diodi di silicio (larghezza di un diodo

0.02 mm) rivelatori in serie di diodi (DAD= Diode Array Detector).

In tali detector la piastre di diodi è posta sul piano focale del monocromatore in modo che

ogni radiazione a diversa lunghezza d’onda colpisca un singolo diodo. si ottiene la

registrazione contemporanea di tutte le assorbanze alle diverse lunghezze d’onda

simultanea acquisizione dello spettro

Perdite per riflessione e dispersione per una soluzione contenuta in cuvetta

Lo strumento deve essere azzerato prima

di ogni misura ovvero si deve stabilire il

valore di assorbimento nullo (P0)

Trasmittanza (T) = P

P0

T% = P

P0

X 100

Spettro. a mono raggio

Spettro. a doppio raggio

120

Spettrofotometro a singolo raggio

Usati prevalentemente in analisi qualitativa. Lo strumento deve essere azzerato prima di ogni serie di misure per eliminare l’assorbimento, anche se minimo, dovuto al solvente e/o alla matrice in cui l’analita è disperso.

Con questo tipo di strumento, occorre eseguire l’azzeramento ad ogni misura e ad ogni , oppure registrare prima lo spettro del BIANCO poi lo spettro del campione ed infine sottrarre al secondo il primo.

121

Spettrofotometro a doppio raggio

È costituto da un sistema che invia due raggi, identici per frequenza e intensità,

uno attraverso il campione e l'altro attraverso il bianco, per cui si ha un confronto

continuo tra l'assorbanza del campione e quella del bianco. Grazie a queste

caratteristiche è possibile effettuare misure direttamente a qualsiasi senza

ripetere gli azzeramenti.

Spettrofotometro a doppio raggio

122

Spettrofotometro a serie di diodi

Registra simultaneamente (in 1/10 di secondo) tutto lo spettro (non ci sono parti

in movimento; grazie a questo sono adatti ad essere collegati all'uscita di

strumenti di separazione di miscele (tipo HPLC) in modo da registrare in tempo

reale, secondo per secondo, l'intero spettro della miscela in uscita.

Taratura degli strumenti

Taratura della scala di assorbanza

La farmacopea britannica usa una soluzione di bicromato di potassio (0.0065% p/v) in soluzione di H2SO4 0.005M per calibrare la scala di assorbanza di uno spettrofotometro (i valori sono espressi in A(1%1cm)

235 nm (122.9 -126.2)257 nm (142.4-145.7)313 nm (47.0-50.3)350 nm (104.9-108.2)

Taratura della scala della lunghezza d’onda

Solitamente lo strumento si calibra secondo le linee spettrali della lampada a scarica di deuterio. In alternativa si può procedere con una verifica utilizzando come std. una soluzione al 5% di perclorato di olmio. Le tolleranze stabilite dalla farmacopea europea sono:

241.15 1 nm287.15 1 nm361.5 1 nm