Metodi Spettroscopici in BiochimicaPrincipi e Applicazioni

R. ZanasiDipartimento di Chimica e Biologia

L’assorbimento e l’emissione di radiazione elettromagnetica da parte della materia sono processi molto importanti, non solo per lo studio dei sistemi biologici, ma anche per le funzioni della vita così come la conosciamo.

Chemical structure of beta-carotene. The eleven conjugated double bonds that form the chromophore of the molecule are highlighted in red.

Senza l’interazione tra luce e cromofori non ci sarebbe percezione visiva e le piante non sarebbero in grado di eseguire la fotosintesi per produrre zuccheri e altri carboidrati.

Structure of chlorophyll a

Nello studio delle strutture biologiche l’interazione tra radiazione e materia non è limitata alla sola regione visibile dello spettro elettromagnetico.

NMR

ESR

In spettroscopia biologica, radiazione di lunghezza d’onda variabile in ordine di grandezza tra km e nm è stata impiegata con successo.

Ci sono molte sorgenti di radiazione. Per esempio, la radiazione visibile (“Luce”) è generata da reazioni chimiche e trasformazioni di energia nella fiamma che si produce bruciando sostanze di vario tipo.

Nel sole, la “luce diurna” è generata dalla fusione nucleare di H in He, durante la quale un largo intervallo di radiazione è emesso che si estende ben oltre la regione visibile. Fortunatamente, l’atmosfera assorbe la maggior parte della luce ad alta energia, come la radiazione ultravioletta (UV) che è pericolosa per la vita sul nostro pianeta.

Radiazione elettromagnetica è generata da scariche elettriche come, ad esempio, fulmini, tubi al neon, ecc..

Radiazione è generata anche da circuiti elettrici, per esempio radio, televisione, cellulari, ecc..

Anche certi animali sono capaci di generare radiazione elettromagnetica. Esempi sono alcuni tipi di meduse e le lucciole.

La medusa luminescente (aequorea victoria) è capace di produrre lampi di luce blu (469 nm).

I lampi di luce blu sono prodotti da un incremento intracellulare di [Ca2+] che causa la transizione

Aequorin + 3Ca2+ Apoaequorin + CO2 + hv (469 nm) + coelenteramideApoaequirin + coelenterazine + O2 Aequorin

Aequorin ribbon diagram from PDB (Protein Data Bank) database with prosthetic group coelenterazine in blue

Mechanism of ActionThe two components of aequorin reconstitute spontaneously, forming the functional protein. The protein bears three binding sites for Ca2+ ions. When Ca2+ occupies such sites, the protein undergoes a conformational change and converts through oxidation its prosthetic group, coelenterazine, into excited coelenteramide and CO2. As the excited coelenteramide relaxes to the ground state, blue light (wavelength = 469 nm) is emitted.

La luce blu è quindi trasdotta a verde (502 nm) dalla famosa green fluorescent protein (GFP)

GFP ribbon diagram. From PDB

In 1961, Osamu Shimomura of Princeton University extracted green fluorescent protein (GFP) and another bioluminescent protein, called aequorin, from the large and abundant hydromedusa Aequorea victoria, while studying photoproteins that cause bioluminescence by this species of jellyfish. Three decades later, Douglas Prasher, a post-doctoral scientist at Woods Hole Oceanographic Institution, sequenced and cloned the gene for GFP. Martin Chalfie of Columbia University soon figured out how to use GFP as a fluorescent marker of genes inserted into other cells or organisms. Roger Tsien of University of California, San Diego, later chemically manipulated GFP in order to get other colors of fluorescence to use as markers. In 2008, Shimomura, Chalfie, and Tsien won the Nobel Prize in Chemistry for their work with GFP.

Man-made GFP is now commonly used as a fluorescent tag to show which cells or tissues express specific genes. The genetic engineering technique fuses the gene of interest to the GFP gene. The fused DNA is then put into a cell, to generate either a cell line or (via IVF techniques) an entire animal bearing the gene. In the cell or animal, the artificial gene turns on in the same tissues and the same time as the normal gene. But instead of making the normal protein, the gene makes GFP. One can then find out what tissues express that protein —or at what stage of development—by shining light on the animal or cell and observing fluorescence. The fluorescence shows where the gene is expressed.

The Nobel Prize in Chemistry 2008 was awarded jointly to Osamu Shimomura, Martin Chalfie and Roger Y. Tsien "for the discovery and development of the green fluorescent protein, GFP".

La radiazione è caratterizzata da una lunghezza d’onda, un’ampiezza e velocità di propagazione.

Energia, frequenza, lunghezza d’onda e numeri d’onda sono dati dalle seguenti equazioni

Costante di Planck

Velocità della luce nel vuoto

Numeri d’onda in cm-1

L’onda elettromagnetica è descritta come

Electromagnetic waves can be imagined as a self-propagating transverse oscillating wave of electric and magnetic fields. This diagram shows a plane linearly polarized wave propagating from left to right. The electric field is in a vertical plane and the magnetic field in a horizontal plane

Una tipica modalità spettroscopica è quella di mandare radiazione attraverso un campione, continuamente o a impulsi.

In funzione del tipo di radiazione le molecole del campione reagiscono alla perturbazione elettromagnetica mediante una alterata distribuzione delle cariche e degli spin molecolari.

Occorre spigare: 1) perché solo un certo tipo di radiazione è assorbita; 2) quanto velocemente le molecole reagiscono alla perturbazione;3) quanta materia viene alterata dalla radiazione.

Introduciamo una descrizione qualitativa dell’interazione radiazione/materia percorrendo le varie regioni spettrali che sono individuate dal tipo di risposta molecolare alla perturbazione.

Regione delle radio frequenze (rf): si estende dal MHz (km) a circa 50 GHz (cm).

Queste frequenze sono usate in spettroscopie di risonanza magnetica nucleare (NMR, MHz) e in spettroscopia di risonanza paramagnetica elettronica (EPR, anche chiamata spettroscopia di risonanza di spin elettronico, ESR, GHz).

L’assorbimento di energia radiante provoca il ribaltamento degli spin nucleari o elettronici ed è dell’ordine di 0.001-20 J/mol.

Allo spin è associato un piccolo dipolo magnetico e il ribaltamento dello spin risulta dalla interazione di questo dipolo con il campo magnetico della radiazione ad una frequenza appropriata.

All isotopes that contain an odd number of protons and/or of neutrons have an intrinsic magnetic moment, in other words a nonzero spin, while all nuclides with even numbers of both have a total spin of zero. The most commonly studied nuclei are 1H and 13C, although nuclei from isotopes of many other elements (e.g. 2H, 6Li, 10B, 11B, 14N, 15N, 17O, 19F, 23Na, 29Si, 31P, 35Cl, 113Cd, 129Xe, 195Pt) have been studied by high-field NMR spectroscopy as well.

Regione delle microonde: 30 GHz (1cm) - 3000 GHz (0.1mm).

Queste frequenze sono usate in spettroscopie rotazionale. In questo tipo di spettroscopia, solo le molecole che possiedono un momento di dipolo elettrico permanente (polari) possono interagire con la radiazione elettromagnetica.

L’energia rotazionale molecolare è quantizzata. Pertanto solo le frequenze corrispondenti alla differenza di energia tra due livelli rotazionali possono essere assorbite. Questa separazione è dell’ordine di 100 J/mol.

L’assorbimento di energia radiante provoca una diversa distribuzione della popolazione dei livelli rotazionali.

Molecole attive: H2O, HCl, HCN, CO,…Molecole non attive: H2, O2, C6H6, CH4, CO2, Cl2,…

Regione infrarossa (IR): 3x1012 Hz (0.1mm) – 3x1014 Hz (1m).

Queste frequenze sono usate in spettroscopie vibrazionale. La spettroscopia vibrazionale è particolarmente utile in chimica e biochimica.

La separazione tra i livelli di energia vibrazionale molecolari è dell’ordine di 10 kJ/mol.

L’assorbimento di radiazione provoca una diversa distribuzione di carica. Pertanto, solo i moti vibrazionali che comportano una variazione del momento di dipolo elettrico molecolare possono interagire con la radiazione.

Prendiamo il caso del biossido di carbonio ad esempio

Nella vibrazione “stretching simmetrico” la molecola di CO2 è alternativamente allungata e compressa, entrambi i legami vibrano simultaneamente (simmetricamente) e il momento di dipolo non cambia. Questo particolare moto vibrazionale non è arrivo in IR.

Regione visibile e ultravioletto (UV-Vis): 3x1014 Hz (1m) – 3x1016 Hz (10nm).

Queste frequenze sono usate in spettroscopie elettronica.

La separazione tra i livelli di energia degli elettroni di valenza è dell’ordine di 100 kJ/mol.

Le transizioni elettroniche comportano una ridistribuzione di carica e, pertanto, a una variazione del momento di dipolo elettrico molecolare, provocato dall’interazione con il campo elettrico della radiazione.

Regione dei raggi X: 3x1016 Hz (10nm) – 3x1018 Hz (100pm).

Queste frequenze provocano transizioni degli elettroni interni.

La separazione tra i livelli di energia degli elettroni interni è dell’ordine di 10000 kJ/mol.

Regione dei raggi : 3x1018 Hz (100pm) – 3x1020 Hz (1pm).

Queste frequenze provocano transizioni coinvolgenti particelle nucleari. L’energia assorbita è dell’ordine di 109-1010 J/mol.

Tryptophan

Tyrosine

Phenylalanine

Amino Acid 3-Letter 1-Letter Side-chain polarity

Side-chain charge (pH 7.4)

Hydropathy index

Absorbance λmax(nm)

ε at λmax (x10−3 M−1 cm−1)

Alanine Ala A nonpolar neutral 1.8

Arginine Arg R polar positive −4.5

Asparagine Asn N polar neutral −3.5

Aspartic acid Asp D polar negative −3.5

Cysteine Cys C polar neutral 2.5 250 0.3

Glutamic acid Glu E polar negative −3.5

Glutamine Gln Q polar neutral −3.5

Glycine Gly G nonpolar Neutral −0.4

Histidine His H polar positive(10%)neutral(90%)

−3.2 211 5.9

Isoleucine Ile I nonpolar Neutral 4.5

Leucine Leu L nonpolar Neutral 3.8

Lysine Lys K polar positive −3.9

Methionine Met M nonpolar neutral 1.9

Phenylalanine Phe F nonpolar neutral 2.8 257, 206, 188 0.2, 9.3, 60.0

Proline Pro P nonpolar neutral −1.6

Serine Ser S polar neutral −0.8

Threonine Thr T polar neutral −0.7

Tryptophan Trp W nonpolar neutral −0.9 280, 219 5.6, 47.0

Tyrosine Tyr Y polar neutral −1.3 274, 222, 193 1.4, 8.0, 48.0

Valine Val V nonpolar neutral 4.2

Spettroscopia Infrarossa (IR)

La spettroscopia infrarossa è una spettroscopia tipicamente di assorbimento che interessa la regione a lunghezza d’onda maggiore (frequenza ed energia minore) rispetto alla luce visibile (1-100 1m).

L’energia della luce infrarossa non è sufficiente a indurre transizioni degli elettroni di valenza. La radiazione infrarossa eccita moti vibrazionali e rotazionali nelle molecole.

I principi della spettroscopia infrarossa sono gli stessi della spettroscopia UV-Vis. Tuttavia, gli spettri infrarossi presentano usualmente il grafico della trasmittanza percentuale in funzione del numero d’onda in cm-1.

Un tipico spettro IR copre da 4000-10000 cm-1 (limite superiore) a 100-800 cm-1 (limite inferiore).

Le transizioni vibrazionali molecolari avvengono fra livelli di energia vibrazionale distinti. La più semplice situazione possibile è la vibrazione di due atomi in una molecola biatomica. La distanza tra i due atomi varia continuamente e la distanza internucleare media definisce la distanza di legame.

Se assumiamo che il legame tra i due atomi sia comparabile a una molla tra due sfere di massa m1 e m2 e che la forza di compressione o espansione sia data dalla legge di Hook, abbiamo il cosiddetto modello dell’oscillatore armonico.

(Notare che la forza si oppone allo spostamento degli atomi.)

L’energia potenziale classica dell’oscillatore armonico

aumenta simmetricamente quando la distanza tra gli atomi varia. Il suo valore dipende dall’ampiezza del moto che classicamente può essere qualsiasi.

La vibrazione di una tale molecola diatomica è caratterizzata da una frequenza di oscillazione che è data dalla meccanica classica:

dove m è la massa ridotta del sistema:

2r0Ep/k

r/r0

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 20

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

La frequenza di oscillazione non dipende dall’ampiezza dell’oscillazione.

In contrasto alla meccanica classica, l’energia vibrazionale delle molecole è quantizzata (come ogni altra energia molecolare). I livelli di energia vibrazionale permessi sono

Dove v è il numero quantico vibrazionale e n è la frequenza di vibrazionale classica.

Il numero quantico vibrazionale può assumere i valori 0,1,2,3,… ciò implica che il più basso valore di energia non è nullo (gli atomi vibrano sempre, anche allo zero assoluto).

La quantità è nota come energia di punto zero.

Un ulteriore risultato che si ottiene applicando il trattamento quantistico al modello dell’oscillatore armonico è la semplice regola di selezione

Riassumendo:1) durante il moto vibrazionale il momento di dipolo elettrico della molecola deve cambiare;2) sono permesse solo transizioni tra livelli di energia adiacenti.

L’energia della transizione è data da:

Ciò significa che per l’oscillatore armonico i livelli di energia vibrazionale sono equidistanti, indipendentemente dal numero quantico vibrazionale .

Quando la frequenza della radiazione è identica a quella della vibrazione, si ha risonanza: la radiazione viene assorbita causando la transizione vibrazionale, sempre nel caso in cui il momento di dipolo elettrico della molecola cambi durante il moto vibrazionale.

L’intensità complessiva dell’assorbimento dipende dall’intensità della radiazione (densità di radiazione, quantità di fotoni) e dal numero di molecole in grado di compiere la transizione vibrazionale (vedi legge di Bouguer-Beer-Lambert)

Il modello dell’oscillatore armonico descrive abbastanza bene il comportamento reale.

Tuttavia, le molecole non si comportano esattamente come masse connesse da una molla, in quanto i legami chimici:

sono sì elastici, ma non obbediscono alla legge di Hook;

si rompono se allungati oltre un certo limite e la molecola dissocia;

non possono essere accorciati fino a far sovrapporre i nuclei, i quali si respingono fortemente se avvicinati.

Questo comportamento è descritto in modo più accurato dalla funzione di Morse, che è un’approssimazione migliore del potenziale dell’oscillatore armonico.

Dove a è una costante che dipende dal legame e DMin è l’energia di dissociazione del legame stesso.

La costante di anarmonicità x è piccola e positiva.

I livelli di energia vibrazionale non sono più equidistanti, ma si avvicinano sempre più aumentando il numero quantico vibrazionale

Le regole di selezione per l’oscillatore anarmonico sono

Comunque, l’intensità degli assorbimenti diminuisce fortemente aumentando il salto energetico, al punto che transizionisono raramente osservate.

Nel caso di molecola poliatomiche si ha più di un legame chimico. Inoltre, ci sono altri gradi di libertà vibrazionali.

Una molecola con N atomi può essere descritta localizzando ogni atomo nello spazio mediante tre coordinate x,y,z, per un totale di 3N coordinate o gradi di libertà totali.

La traslazione della molecola tutta assieme rigidamente (tutti gli atomi nella stessa direzione per un uguale spostamento) richiede 3 coordinate del centro di massa (3 gradi di libertà non vibrazionali). Allo stesso modo, la rotazione della molecola rigida attorno al centro di massa richiede 3 assi di rotazione, ovvero altri 3 gradi di libertà non vibrazionali (2 nel caso di molecole lineari).

Pertanto restano:

3N-6 (molecole non lineari ) H2O GLV=3

3N-5 (molecole lineari) CO2 GLV=4gradi di libertà vibrazionali

Ad ogni grado di libertà vibrazionale corrisponde un modo di vibrare della molecola detto fondamentale o normale.

I modi normali di vibrazione sono classificati come simmetrici o antisimmetrici se la simmetria della molecola è mantenuta o no durante la vibrazione.

H H

O

H H

OO

HH

Stiramento simmetrico

Stiramentoasimmetrico

Piegamento

O C O

O C O

O C O

O C O

Stiramentosimmetrico

Stiramento asimmetrico

Piegamento (degenere)

Symmetrical stretching

Antisymmetrical stretching

Scissoring

Rocking Wagging Twisting

Un altro risultato molto importante della meccanica quantistica, di carattere generale, descrive come una molecola che si trova in un determinato livello energetico possa assorbire o emettere radiazione.

Si dice emissione stimolata il fenomeno quantistico per cui la radiazione elettromagnetica, oltre che ad eccitare un sistema, può anche stimolarne la diseccitazione. Se si applica la teoria delle perturbazioni dipendente dal tempo si ottiene infatti che la probabilità di transizione fra due livelli è pari al 100% quando l‘energia della radiazione incidente è pari alla differenza di energia fra i due livelli. Se il sistema si trovava nel livello inferiore si ha un fenomeno di assorbimento risonante della radiazione, ovvero l‘onda viene assorbita ed il sistema si eccita al livello superiore. Se, al contrario, il sistema era già eccitato si disecciterà emettendo radiazione elettromagnetica alla stessa frequenza, e nella stessa direzione, di quella incidente.Questo fenomeno è alla base del funzionamento dei laser e dei maser.

A laser is a device that emits light (electromagnetic radiation) through a process of optical amplification based on the stimulated emission of photons. The term "laser" originated as an acronym for Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation.

Questo significa che l’assorbimento viene parzialmente compensato dalle molecole già eccitate.

Per una data transizione, l’intensità di assorbimento risulta quindi proporzionale alla differenza

tra il numero di particelle nel livello inferiore e il numero di particelle nel livello superiore.

numero d'onda cm-1 100 200 500 1000 2000 3000 4000Velocità della luce (c) m/s 2.998E+08Coantante di Plank (h) Js 6.626E-34Frequenza (n) s-1 2.998E+12 5.996E+12 1.499E+13 2.998E+13 5.996E+13 8.994E+13 1.199E+14Costante di Boltzmann (k) J/K 1.381E-23Temperatura (T) K 298.15hn/kT 0.482 0.965 2.412 4.825 9.649 14.474 19.298Nm/Nn 0.6173 0.3810 0.0896 0.0080 0.0001 0.0000 0.0000

Nn/Nm 1.6200 2.6245 11.1592 124.5273 15507.0517 1931051.4784 240468651.8675

Il rapporto tra le popolazioni è dato dalla legge di distribuzione di Boltzmann

Nel caso della spettroscopia IR, nell’intervallo tipico di numeri d’onda 500-4000 cm-1, la maggior parte delle molecole a temperatura ambiente popolano il livello di energia vibrazionale più basso.

Lo spettro IR è quindi dominato da assorbimenti di radiazione che provocano transizioni vibrazionali 0 1 (fondamentali).

Altri assorbimenti più deboli possono essere notati per transizioni vibrazionali 0 2, 0 3, … (sovratono, overtone).

In ogni caso, il momento di dipolo elettrico della molecola deve variare durante il moto vibrazionale.

Le transizioni vibrazionali si possono combinare. In questo caso l’assorbimento avviene a una frequenza pari alla somma delle frequenze dei modi individuali. E’ sufficiente che un solo modo vibrazionale provochi la variazione del momento di dipolo elettrico della molecola affinché l’assorbimento combinato sia attivo.

esempi

Che tipo di informazione può essere ottenuta dalla spettroscopia IR eseguita su campioni biologici?

Una delle principali applicazioni della spettroscopia IR in biologia riguarda l’identificazione della struttura secondaria delle proteine.

I gruppi di atomi in una sequenza poli-peptidica di una proteina vibrano diversamente se la struttura secondaria è di tipo alfa elica (a-helix) o foglietto beta (b-sheet).

Questi motivi strutturali vennero correttamente predetti da Pauling e Corey usando considerazioni teoriche ancora prima della loro effettiva determinazione sperimentalmente.

Linus Pauling and Robert Corey examining models of protein structure molecules. approx. 1951.

Proc. N.A.S. 1951,37, 205

Julian Voss-Andreae's Alpha Helix for Linus Pauling (2004), powder coated steel, height 10 ft (3 m). The sculpture stands in front of Pauling's childhood home on 3945 SE Hawthorne Boulevard in Portland, Oregon, USA.

Un vantaggio delle tecniche spettroscopiche rispetto alla cristallografia a raggi x, che richiede cristalli di proteina allo stato solido, è che queste tecniche possono essere usate per determinare gli elementi strutturali delle proteine in soluzione acquosa.

Questi metodi sono molto utili perché permettono di chiarire velocemente la struttura secondaria di una proteina e di determinare se ci sono variazioni strutturali in seguito all’interazione con altre molecole.

Inoltre, la moderna spettroscopia IR consente esperimenti risolti nel tempo (time resolved) per monitorare i cambiamenti di folding delle proteine e nello studio della funzione delle proteine.

La spettroscopia IR può essere applicata a proteine molto grandi, a differenza della spettroscopia NMR.

Nelle a eliche lo scheletro del polipeptide risulta strettamente arrotolato attorno a un asse centrale immaginario, mentre i gruppi laterali degli amminoacidi sporgono radialmente all'esterno dell'elica.

L’ a elica è stabilizzata da legami idrogeno tra i gruppi NH e CO della catena centrale. Il gruppo CO di ogni amminoacido è legato al gruppo NH dell’amminoacido che è quattro residui più avanti nella sequenza lineare, così che tutti i gruppi CO e NH della catena principale sono legati fra loro mediante legami idrogeno.

3.6 residui formano un giro completo. L’angolo tra due amminoacidi è di 100 a la loro distanza proiettata sull’asse dell’elica è 1.5 Å, corrispondente a uno spostamento di 5.4 Å per giro completo.

a helix

Il foglietto β è la seconda forma più diffusa di struttura secondaria delle proteine, che consiste di più filamenti β disposti uno accanto all'altro e collegati tra loro da tre o più legami idrogeno che formano una struttura planare molto compatta.

Si definisce filamento β (β-strand) una sequenza peptidica di amminoacidi (tipicamente composta da 5 – 10 amminoacidi) che si dispone linearmente ed è in grado di instaurare legami idrogeno.Catene adiacenti possono essere parallele, se sono orientate nella stessa direzione, o antiparallele (direzione opposta).Il cambio di direzione della catena di un polipeptide tra due β-strands è detto β-turn.

b sheet

Nei peptidi e nelle proteine ci sono tre bande di assorbimento IR importanti:

amide A band a 3300 cm-1 dovuta alla vibrazione di stretching del legame N-H

amide I band a 1650 cm-1 dovuta alla vibrazione di stretching del legame C=O

amide II band a1550 cm-1 dovuta alla vibrazione di bending del legame N-H

Queste vibrazioni non sono indipendenti. A causa della formazione dei legami idrogeno i gruppi CO ed NH diventano oscillatori accoppiati.

Nelle a eliche e nei foglietti b l’accoppiamento degli oscillatori è differente, pertanto gli spettri IR dipendono dalla struttura secondaria.

La grande differenza tra le bande di assorbimento per le diverse conformazioni delle proteine si osserva in generale.

Sulla base di queste relazioni tra struttura secondaria e frequenze di assorbimento IR, le componenti strutturali delle proteine possono essere determinate.

Tuttavia, le bande di assorbimento sono larghe e spesso si sovrappongono tra loro per produrre un profilo di assorbimento complesso.

Per trovare le componenti strutturali delle proteine è necessario ricorrere a processi di deconvoluzione.

Deconvolution is an algorithm-based process used to reverse the effects of convolution on recorded data. In general, the object of deconvolution is to find the solution of a convolution equation of the form:

f*g=hUsually, h is some recorded signal, and ƒ is some signal that we wish to recover, but has been convolved with some other signal g before we recorded it. This is most often done using methods of statistical estimation.

Spettroscopia di Assorbimento UV-Vis

La regione spettrale di interesse per la spettroscopia UV-Vis copre l’intervallo

3x1014 Hz – 3x1016 Hz 1m – 10nm

Che corrisponde a valori di energia in grado di provocare transizioni elettroniche.

Questo tipo di spettroscopia trova applicazioni sia in assorbimento che in emissione.

Solar spectrum with Fraunhofer lines

Designation ElementWavelength (nm)

Designation ElementWavelength (nm)

y O2 898.765 c Fe 495.761

Z O2 822.696 F Hβ 486.134

A O2 759.370 d Fe 466.814

B O2 686.719 e Fe 438.355C Hα 656.281 G' Hγ 434.047a O2 627.661 G Fe 430.790D1 Na 589.592 G Ca 430.774D2 Na 588.995 h Hδ 410.175D3 or d He 587.5618 H Ca+ 396.847e Hg 546.073 K Ca+ 393.368E2 Fe 527.039 L Fe 382.044b1 Mg 518.362 N Fe 358.121b2 Mg 517.270 P Ti+ 336.112b3 Fe 516.891 T Fe 302.108b4 Fe 516.891 t Ni 299.444b4 Mg 516.733

Gli atomi producono spettri elettronici puri che sono relativamente semplici da interpretare.

Ad esempio, La spettrofotometria di assorbimento atomico (AAS) è una tecnica analitica impiegata per la determinazione sia quantitativa che qualitativa di ioni metallici in soluzione. A differenza delle molecole gli atomi non contengono sottostrutture rotazionali o vibrazionali e pertanto l'assorbimento di una radiazione elettromagnetica non avviene in una banda di frequenze ma ad una e una sola frequenza. Tutto ciò implica che ogni atomo avrà il suo spettro di assorbimento caratteristico e per ogni lunghezza d'onda, a cui corrisponde una transizione sufficientemente probabile, è possibile effettuare misure quantitative applicando la legge li Lambert-Beer.

Xenon lamp as a continuous radiation source

Hollow cathode lamp (HCL)

La spettroscopia di emissione atomica, spesso indicata con l’acronimo AES (Atomic emission spectroscopy) o OES (Optical emission spectroscopy), è una tecnica spettroscopica di emissione utilizzata in analisi chimica. Essa sfrutta la somministrazione di energia relativamente elevata, tanto da provocare la dissociazione in atomi e l’eccitazione di quest’ultimi. In base alla lunghezza d’onda emessa è possibile risalire alla specie incognita, mentre misurando l’intensità dell'emissione si può effettuare anche l’analisi quantitativa.

Cu Na

Le molecole hanno spettri elettronici molto più complessi a causa della presenza dei nuclei.

Gli spettri elettronici molecolari vengono interpretati mediante un certo numero di approssimazioni, la più importante delle quali (approssimazione di Born-Oppenheimer) consente di separare il moto elettronico da quello nucleare.

L'approssimazione di Born-Oppenheimer, nota anche come approssimazione adiabatica, è una tecnica usata in chimica quantistica al fine di disaccoppiare i moti di nuclei ed elettroni, cioè per separare le variabili corrispondenti al moto nucleare e le coordinate elettroniche. Si basa sul fatto che le tipiche velocità elettroniche sono molto maggiori di quelle nucleari.

Poiché le masse dei nuclei atomici sono molto maggiori di quelle degli elettroni orbitanti (un nucleone pesa circa 2000 volte più di un elettrone), gli elettroni hanno velocità molto maggiori di quelle dei nuclei. Per avere un'idea degli ordini di grandezza coinvolti, notiamo che la velocità tipica di un elettrone all'interno di un atomo è circa 106 ms-1 (velocità di Fermi) mentre quella di un nucleo è circa 103 ms-1 (velocità del suono). Il sistema di elettroni può quindi rispondere rapidamente a cambiamenti nella configurazione dei nuclei.

+-

In questa approssimazione l’energia totale molecolare può essere separata in contributi indipendenti dovuti ai moti elettronico, vibrazionale e rotazionale (trascurando il contributo traslazionale)

Anche le transizioni tra i differenti livelli di energia possono avvenire indipendentemente

Di norma si ha che

Poiché la variazione della distribuzione elettronica che avviene in seguito a una transizione elettronica è accompagnata sempre da una variazione del momento di dipolo elettrico molecolare, tutte le molecole hanno spettri di assorbimento elettronici, anche quelle che non hanno spettri rotazionali e roto-vibrazionali (vedi H2, O2).

Quindi, si ha che durante una data transizione elettronica avvengono contemporaneamente transizioni vibrazionali e rotazionali.

Le transizioni vibrazionali danno luogo alla struttura grossolana a bande di assorbimento, mentre quelle rotazionali producono una struttura fine nella quale le bande possono essere risolte adoperando strumenti adeguati.

Trascurando il contributo rotazionale, l’energia di una particolare molecola può essere riscritta come (in numeri d’onda)

L’insieme delle transizioni, che iniziano tipicamente dallo stato fondamentale elettronico + vibrazionale, formano una banda poiché, a bassa risoluzione, appaiono allargate e diffuse.

Normalmente, le molecole hanno molti stati eccitati elettronici, così l’intero spettro di assorbimento, anche di una molecola biatomica, è più complicato di quello in figura.

GGGli spettri di emissione molecolari sono di norma estremamente più complicati.

Anche se la meccanica quantistica non impone restrizioni sulla variazione nel numero quantico vibrazionale durante una transizione elettronica, le linee vibrazionali che compongono una banda non hanno tutte la stessa intensità.

In alcuni spettri la transizione (0,0) è la più intensa, in altri l’intensità aumenta fino ad un massimo per un certo valore del numero quantico vibrazionale, in altri ancora solo poche linee vibrazionali sono visibili seguite da un continuo.

Tutti questi tipi si spettri trovano una spiegazione nel principio di Franck-Condon.

Da un punto di vista classico, il principio di Franck-Condon afferma che durante una transizione elettronica il moto dei nuclei viene considerato nullo, in quanto le loro posizioni variano molto più lentamente rispetto a quelle degli elettroni, dato che la loro massa è maggiore rispetto quella di questi ultimi. Il moto dei nuclei diventa quindi trascurabile in confronto a quello degli elettroni. (Transizioni verticali)

Consideriamo una molecola biatomica, il suo stato elettronico fondamentale e uno stato elettronico eccitato stabile rispetto alla dissociazione degli atomi.

In questo caso possiamo rappresentare i due stati elettronici mediante due curve di Morse, tutto sommato abbastanza simili anche se non necessariamente uguali.

Lo stato eccitato presenta di norma una distanza di legame >= di quella dello stato fondamentale.

Nel caso si molecole poliatomiche si introduce il concetto di cromoforo.

Con il termine cromoforo si definisce, in senso ampio, un gruppo di atomi capaci di conferire colorazione ad una sostanza. Più specificamente, un cromoforo rappresenta un atomo o gruppo di atomi di una entità molecolare responsabili dell'insorgere di una data banda spettrale a seguito di una transizione elettronica. Ciò è possibile in quanto la configurazione degli orbitali molecolari consente transizioni elettroniche dovute all’assorbimento di radiazione visibile e assorbimento nell’UV non lontano; risultano quindi escluse le transizioni σ → σ*. In genere, tutti i gruppi insaturi possono definirsi cromofori, in particolare:

C≡C, C=C, C=N, C=O, C=S, N=N, N=O;sistemi polienici;anelli aromatici.

Sono cromofori anche gli elementi dei blocchi d ed f.

In chimica, un orbitale molecolare (MO) è una funzione matematica che descrive il comportamento ondulatorio di un elettrone in una molecola. Questa funzione può essere usata per calcolare proprietà chimiche e fisiche come la probabilità di trovare un elettrone in ogni dato punto dello spazio molecolare.

Gli orbitali molecolari vennero introdotti da Friedrich Hund e Robert S. Mulliken nel 1927 e 1928.Gli orbitali molecolari che si formano in seguito al legame che si instaura tra gli atomi di una molecola, possono essere stimati come combinazione lineare di orbitali atomici (LCAO).

La combinazione lineare di orbitali atomici venne introdotta da John Lennard-Jones nel 1929.

Per le molecole biatomiche, gli orbitali molecolari si ottengono molto semplicemente come

Ψ = caψa + cbψb

Ψ * = caψa − cbψb

dove Ψ e Ψ* rappresentano gli orbitali molecolari di legame e antilegame rispettivamente; ψa e ψb sono gli orbitali atomici degli atomi a e b che si uniscono nella molecola e ca e cb sono coefficienti che devono essere determinati sotto certe condizioni.

La combinazione può essere interpretata nel seguente modo: avvicinando i due atomi i loro orbitali atomici si sovrappongono per produrre zone di densità elettronica che, interponendosi fra i nuclei, consentono un equilibrio elettrostatico fra cariche negative e positive, formando così un orbitale molecolare di legame occupato dalla coppia elettronica che si colloca a una energia più bassa rispetto a quella degli orbitali atomici originali.

La combinazione opposta è prevista dalla meccanica quantistica e rappresenta uno stato eccitato (energia più alta) disponibile per la transizione elettronica.

σ bonds

I legami sigma sono i legami covalenti più forti. Si formano dalla sovrapposizione di orbitali atomici lungo la direzione interatomica. Un legame sigma è simmetrico rispetto alla rotazione attorno all’asse del legame. Forme comuni di legami sigma sono s+s, pz+pz, s+pz and dz

2+dz2 (dove z è l’asse di legame).

Il corrispondente antilegame σ* è definito dalla presenza di un piano nodale tra i due atomi legati.

p bonds

I legami pi sono legami covalenti che si formano sovrapponendo due lobi di un orbitale atomico con due lobi di un secondo orbitali atomico. Questi orbitali condividono un piano nodale che passa attraverso i nuclei degli atomi coinvolti nel legame.

Forme comuni di legami pi sono px+px, py+py and dxy+dxy (dove x,y sono direzioni perpendicolari all’asse di legame).

Il corrispondente antilegame p* contiene un secondo piano nodale tra i due atomi legati.

Transizioni elettroniche

s → s*

Elettroni che occupano un HOMO di un legame sigma possono essere eccitate al LUMO del medesimo legame.

p → p*

Promozione di un elettrone di un orbitale pi di legame ad un orbitale pi di antilegame.

n → s* , n → p*

Transizioni che provocano l’eccitazione di elettroni appartenenti a una coppia solitaria.

SHMo2

Simple Huckel Molecular Orbital Theory Calculator

Carotene is responsible for the orange colour of the carrots and many other fruits and vegetables

Lesser Flamingos in the Ngorongoro Crater, Tanzania. The pink colour of wild flamingos is due to beta carotene they absorb from the blue-green algae in their diet. If fed a carotene-free diet they become white

Bacteriochlorophylls are photosynthetic pigments that occur in various phototrophic bacteria. They were discovered by Von Neil in 1932 . They are related to chlorophylls, which are the primary pigments in plants, algae, and cyanobacteria. Groups that contain bacteriochlorophyll conduct photosynthesis, but do not produce oxygen. They use wavelengths of light not absorbed by plants or Cyanobacteria

Finora abbiamo considerato fenomeni di assorbimento (o di emissione) che non dipendono dallo stato di polarizzazione della radiazione.

I metodi spettroscopici che impiegano luce polarizzata sono di importanza fondamentale quando il mezzo che interagisce con la radiazione è di natura chirale.

La chiralità (dal greco χείρ cheir, "mano"), è in senso generale la proprietà di avere un'immagine speculare non sovrapponibile a sé stessa come avviene, appunto, nel caso di una mano. Un oggetto con questa proprietà è detto chirale.

Molecole che non contengono piani di simmetria sono chirali.

Spettroscopie ChirotticheSpettroscopie Chirottiche

Un mezzo chirale si dice otticamente attivo perché ha la proprietà di ruotare il piano della luce polarizzata linearmente che lo attraversa.La prima osservazione risale al 1811, quando François Arago trovò che il quarzo ha questa proprietà nella direzione dell’asse ottico.

Convenzionalmente il potere rotatorio di un mezzo è riportato in gradi/decimetro e si indica con il simbolo . Il potere rotatorio specifico, o più comunemente rotazione specifica, è definito come

Dove r è la densità del materiale otticamente attivo in grammi/cm3, pertanto le unità di misura della rotazione specifica sono

gradi/dm(gr/cm3)-1

La Chiralità.

Un mezzo chirale presenta anche il fenomeno del dicroismo circolare scoperto nel 1896 da Aimé Auguste Cotton.

In the absorption bands of chiral molecules, he discovered large values of optical rotatory dispersion (ORD), or variation of optical rotation as a function of wavelength (Cotton effect), as well as circular dichroism or differences of absorption between left and right circularly polarized light.

E’ utile ricordare, che se una molecola contiene un atomo asimmetricamente sostituito non ha piani di simmetria ed è, pertanto, chirale.

Occorre tenere presente che una molecola può essere chirale anche in assenza di atomi asimmetricamente sostituiti. In questo caso si parla di chiralità intrinseca, come nel caso delle a-eliche.

Una a-elica proteica ha due motivi chirali: l’elica stessa e i singoli amminoacidi che contengono almeno un carbonio asimmetrico (unica eccezione la glicina).

La Biochimica Terrestre è Omochirale

Omochiralità è un termine usato per descrivere un gruppo di molecole che possiedono la stessa chiralità.

Le proteine degli organismi viventi sono formate (quasi) esclusivamente da L-a-amminoacidi

Gli acidi nucleici contengono solo gli isomeri D del ribosio

o del deossiribosio

Per gli zuccheri ed altre molecole di interesse biochimico non si fa uso dei prefissi (R) ed (S). Si assegnano i prefissi D ed L a seconda che i sostituenti legati all'atomo di carbonio asimmetrico più distante da quello che lega il gruppo carbonilico abbiano disposizione simile a quella della L-gliceraldeide o a quella della D-gliceraldeide.

Cahn–Ingold–Prelog The CIP system or CIP conventions

Come e quando le bio-macromolecole sono apparse sulla terra?

Miller and Urey experiment

The common 20 amino acids were formed, in various concentrations, both left-handed (L) and right-handed (D) optical isomers were created in a racemic mixture.

Come e quando l’omochiralità della biochimica terrestre abbia avuto inizio è ancora un problema irrisolto. Molte controverse ipotesi sono ancora sul tappeto, nessuna delle quali ha avuto conferma sperimentale.

Origine extraterrestre: scoperta di uno sbilancio enantiomerico nel meteorite di Murchison, Australia 1969.

Violazione della parità: la forza nucleare debole distingue destra e sinistra, gli enantiomeri di una molecola chirale non hanno esattamente la stessa energia, c’è una piccolissima differenza.

Origine terrestre: catalisi asimmetrica dovuta a minerali particolari quali zeoliti.

Tuttavia, sembra ci sia la fondamentale, anche se non completamente verificata, ipotesi che la vita, così come la conosciamo, non sarebbe mai apparsa senza la scelta omochirale.

Generalmente gli L-amminoacidi formano eliche destrogire. Similarmente, i b-sheets non sono completamente piani ma, se fatti di L-amminoacidi, mostrano un leggero twist destrogiro.

Una catena di D-amminoacidi produce eliche e fogli levogiri.

Ad esempio, la struttura del peptide b-amyloid ottenuto con i D-enantiomeri dei 42 residui amminoacidi che lo compongono è esattamente opposto a quello del peptide “naturale” [Cribbs et al. J Biol Chem 1997, 272, 7431].

In alcuni casi è stato provato che la conformazione speculare comporta una funzionalità stereospecifica, come nel caso dell’enzima HIV-1 protease

Gli enantiomeri dell’enzima esibiscono una specificità chirale reciproca: L-enzima agisce solo su L-substrati, il D-enzima solo su D-substrati. [Milton et al. Science 1992, 256, 1445.]

mentacumino

Limonene

Forte odore di arance o limoni

Odore di trementina o acquaragia

La talidomide è un farmaco che fu venduto negli anni ‘50 e ‘60 come sedativo, anti-nausea e ipnotico, rivolto in particolar modo alle donne in gravidanza. Venne ritirato dal commercio alla fine del 1961.Prodotto in forma di racemo, fu ritirato dal commercio in seguito alla scoperta della teratogenicità (generazione di mostri) dovuta ad uno dei suoi enantiomeri, resa tristemente evidente dalla nascita di migliaia di bambini che presentavano amelia (assenza degli arti) o vari gradi di focomelia (riduzione delle ossa lunghe degli arti).

N

N

OO

O

O

H

(R)teratogeno

(S)sedativo

N

N

OO

O

HO

prova

prova

Luce polarizzata linearmente si ottiene facendo passare luce ordinaria attraverso un cristallo particolare (ad esempio un prisma di calcite, CaCO3) detto prisma di Nicol

Il materiale deve essere birifrangente

Il cristallo deve essere tagliato in modo tale da riflettere totalmente uno dei due raggi.

Luce polarizzata circolarmente può essere ottenuta sovrapponendo due raggi di luce polarizzati linearmente che hanno una differenza di fase pari a l/2.

Spettroscopie di assorbimento chirottiche

1) Se gli indici di rifrazione della luce polarizzata circolarmente destra e sinistra sono diversi (velocità di propagazione nel mezzo chirale diverse) si ha rotazione del piano di polarizzazione della luce polarizzata linearmente. Il fenomeno dipende dalla lunghezza d’onda. Registrando la rotazione ottica variando la lunghezza d’onda della radiazione si ha la spettroscopia ORD (Optical Rotatory Dispersion).

2) La differenza di assorbimento tra luce polarizzata circolarmente destra e sinistra definisce il dicroismo circolare del mezzo. Il fenomeno è nullo in assenza di assorbimento ed è massimo in corrispondenza dei massimi di assorbimento. Lo spettro di dicroismo circolare che si ottiene nella regione UV-Vis è altrimenti noto come ECD (Electronic Circular Dichroism).

3) Se la differenza di assorbimento avviene nell’IR si ottengono spettri di dicroismo circolare vibrazionale (VCD).

ORD

ECD/VCD

Equazione usata per combinare le curve

Dove ac=% di elica; bc=% di beta; d=% di random

Vedi dati reali

Spettroscopia di Fluorescenza