Metodi di ionizzazione -...

Metodi di ionizzazione

IL PROCESSO DI IONIZZAZIONEIL PROCESSO DI IONIZZAZIONE avviene solitamente avviene solitamente allall’’interno della sorgente dello interno della sorgente dello spettrometrospettrometro di massa e pudi massa e puòòessere realizzato mediante varie tecniche.essere realizzato mediante varie tecniche.

Dal Dal tipotipo di processo di ionizzazionedi processo di ionizzazione dipendono:dipendono:

•• il il numeronumero dei frammentidei frammenti

•• la la natura natura dei frammentidei frammenti

•• ll’’abbondanzaabbondanza dei frammentidei frammenti

Metodi di ionizzazione - classificazione

�� Sulla base dellSulla base dell ’’energia coinvoltaenergia coinvolta ::

Alcune tecniche di ionizzazione operano ad alta energia e Alcune tecniche di ionizzazione operano ad alta energia e portano ad una frammentazione spinta, altre operano a bassa portano ad una frammentazione spinta, altre operano a bassa energia producendo un numero inferiore di ioni:energia producendo un numero inferiore di ioni:

Tecniche Soft

informazione PM

Tecniche SoftTecniche Soft

informazione PMinformazione PM

Tecniche hard:

Estesa frammentazione

Tecniche hard:Tecniche hard:

Estesa frammentazioneEstesa frammentazione


• Ionizzazione elettronica (• Ionizzazione elettronica (EIEI -- Electron Electron IonisationIonisation))

-- TECNICHE “SOFT”TECNICHE “SOFT”

• Ionizzazione chimica (• Ionizzazione chimica (CICI -- ChemicalChemical IonisationIonisation))

-- TECNICHE “HARD”TECNICHE “HARD”

• Bombardamento con atomi veloci (• Bombardamento con atomi veloci (FABFAB -- Fast Fast AtomAtom BombardmentBombardment))

•• Ionizzazione laser assistita da matrice (Ionizzazione laser assistita da matrice (MALDIMALDI -- MatrixMatrix AssistedAssisted Laser Laser DesorptionDesorption IonisationIonisation))

• Ionizzazione per • Ionizzazione per elettronebulizzazioneelettronebulizzazione ((ESIESI -- ElectrosprayElectrospray IonisationIonisation))

Metodi di ionizzazione - classificazione

-- Molecole piccoleMolecole piccole

-- Termicamente stabiliTermicamente stabili

-- volatilivolatili

-- Molecole grandiMolecole grandi

-- Termicamente poco stabiliTermicamente poco stabili

-- non volatilinon volatili

Ionizzazione Ionizzazione per per

desorbimentodesorbimento


nebulizzazionenebulizzazione


vaporizzazionevaporizzazione

∆∆

Metodi di scelta per:Metodi di scelta per:

�� In base al metodo di volatilizzazione che precede l a In base al metodo di volatilizzazione che precede l a ionizzazione del campione:ionizzazione del campione:


• Ionizzazione elettronica (• Ionizzazione elettronica (EIEI -- Electron Electron IonisationIonisation))

• Bombardamento con atomi veloci (• Bombardamento con atomi veloci (FABFAB -- Fast Fast AtomAtom BombardmentBombardment))

• Ionizzazione laser assistita da matrice (• Ionizzazione laser assistita da matrice (MALDIMALDI -- MatrixMatrix AssistedAssistedLaser Laser DesorptionDesorption IonisationIonisation))

•• Ionizzazione chimica (Ionizzazione chimica (CICI -- ChemicalChemical IonisationIonisation))

• Ionizzazione per • Ionizzazione per elettronebulizzazioneelettronebulizzazione ((ESIESI -- ElectroSprayElectroSprayIonisationIonisation))

IONIZZAZIONE ELETTRONICA (EI)*

*Il termine impatto elettronico è poco usato*Il termine impatto elettronico è poco usato

Campioni solidi o liquidiCampioni solidi o liquidi volatilivolatili e e non non termolabilitermolabili possono possono essere introdotti nella camera di ionizzazione per essere introdotti nella camera di ionizzazione per ionizzazione elettronica attraverso:ionizzazione elettronica attraverso:

Introduzione direttaIntroduzione diretta Introduzione indiretta Introduzione indiretta (GC, HPLC)(GC, HPLC)

Sorgente a

IONIZZAZIONE ELETTRONICA

Sorgente a

IONIZZAZIONE ELETTRONICA

Nella sorgente le Nella sorgente le molecole neutre molecole neutre del campione (del campione (MM), in ), in fase fase gassosagassosa, interagiscono con un , interagiscono con un fascio di elettronifascio di elettroni

Ionizzazione elettronica (EI)

FilamentoFilamento

ee--

MM

MM

MM

un filamento incandescente (Renio o un filamento incandescente (Renio o TugstenoTugsteno) ed ) ed accelerato accelerato attraverso un potenziale regolabile dall’operatore. attraverso un potenziale regolabile dall’operatore. L’energia del fascio è normalmente fissata a L’energia del fascio è normalmente fissata a 70 70 eVeV..

generatogenerato dada

+70 +70 eVeV

Molecole neutre vaporizzateMolecole neutre vaporizzate

CC1010HH2222++. . CC1010HH2222

+ e+ e-- 2e2e--

MM+.+.

LL’’energia fornita dallenergia fornita dall’’interazione con gli elettroni con la interazione con gli elettroni con la molecola causa la ionizzazione (rimozione di 1 elettrone) ed molecola causa la ionizzazione (rimozione di 1 elettrone) ed una una frammentazioneframmentazione pipiùù o meno estesa delle molecole.o meno estesa delle molecole.

Ionizzazione elettronica (EI)

EsEs. Il . Il normalnormal decanodecano

Tale interazione determina Tale interazione determina l'espulsione di un elettronel'espulsione di un elettrone dalla dalla molecola. Il catione molecola. Il catione radicalicoradicalico MM++.. che si forma è detto che si forma è detto ione ione molecolaremolecolare..

ee-- + + M M MM+.+. + + 2e2e--

catione catione radicalicoradicalico

Ionizzazione-frammentazione

CC1010HH2222++..

MM+.+. m/zm/z 142142

CC99HH1919++

m/zm/z 127127

CC88HH1717++

m/zm/z 113113

-- CHCH33..

--ee--

-- CC22HH55..

CC1010HH2222

IonizzazioneIonizzazione

Frammentazione Frammentazione dello ione molecolaredello ione molecolare

Lo ione Lo ione MM+.+.,, dotato di alta energia, può dotato di alta energia, può FRAMMENTARSIFRAMMENTARSI e generare:e generare:

�� molecole molecole e/oe/o radicali radicali NEUTRINEUTRI (che lo strumento non rileva)(che lo strumento non rileva)

�� cationi e/o radicali cationi (cationi e/o radicali cationi (IONIIONI frammentoframmento))

Perdita di specie neutrePerdita di specie neutre

• Le particelle • Le particelle neutreneutre, come CH, come CH33.., C, C22HH55

.., sono allontanate , sono allontanate dalla pompa da vuoto; dalla pompa da vuoto;

m/z

Ionizzazione-frammentazione

m/z 113, 127, 142

• le particelle • le particelle carichecariche, come C, come C1010HH2222+.+., C, C99HH1919

++, C, C88HH1717++, ..... sono , ..... sono

accelerate e convogliate all’analizzatore. accelerate e convogliate all’analizzatore.

CC1010HH2222+.+.

CC88HH1717++

CC99HH1919++

Nello spettro appaiono in corrispondenza del loro rapporto Nello spettro appaiono in corrispondenza del loro rapporto massa/caricamassa/carica..

Sorgente a ionizzazione elettronica (EI)

oltre a ioni oltre a ioni monocarichimonocarichi si possono formare anche ioni con più cariche.si possono formare anche ioni con più cariche.

Elettrodi diElettrodi difocalizzazionefocalizzazione

degli ionidegli ioni

Ingresso del Ingresso del campionecampione

Fascio di elettroniFascio di elettroni

FilamentoFilamento

All’analizzatoreAll’analizzatore

e- + M M+. + 2e-

Sorgente a ionizzazione elettronica (EI)

�� E’ la modalità più classica, tuttora molto utilizzata.E’ la modalità più classica, tuttora molto utilizzata.

Caratteristiche (EI)

�� E’ una ionizzazione ‘hard’: si possono avere frammentazioniE’ una ionizzazione ‘hard’: si possono avere frammentazioni

estese che lasciano poco o nulla dello ione molecolareestese che lasciano poco o nulla dello ione molecolare..

�� Il campione deve essere in stato di Il campione deve essere in stato di vaporevapore..

�� Adatto per composti piccoli (< 800 Da),Adatto per composti piccoli (< 800 Da), volatilivolatili, , termicamentetermicamente

stabilistabili..

�� Interfaccia con GC (separazione di miscele di Interfaccia con GC (separazione di miscele di analitianaliti).).

IONIZZAZIONE CHIMICA (CI)

La CI consiste generalmente nel trasferimento di un La CI consiste generalmente nel trasferimento di un PROTONEPROTONEda da un gas reagente un gas reagente ((GGHH)), precedentemente ionizzato,, precedentemente ionizzato, allaallamolecola neutra M molecola neutra M da analizzare per formare uno ione da analizzare per formare uno ione molecolare molecolare protonatoprotonato [M+[M+HH]]++. .

GGHH++ + + MM MMHH++ + + GGIonizzazione chimica di MIonizzazione chimica di M

La particolarità è che nello spettro vedremo lo ione molecolare La particolarità è che nello spettro vedremo lo ione molecolare con un unità di massa in più con un unità di massa in più M + 1M + 1..

3,43,4--dimetossiacetofenone MW = 180dimetossiacetofenone MW = 180

IONIZZAZIONE CHIMICA (CI vs EI)

MHMH++ M + 1M + 1

MM+.+. m/z m/z 180180

m/z m/z 181181

IONIZZAZIONE CHIMICA (CI)

A questo scopo nA questo scopo nella camera di ionizzazione sono presenti:ella camera di ionizzazione sono presenti:

�� la molecola da analizzare (la molecola da analizzare (MM) allo stato gassoso) allo stato gassoso

�� un un gas reagentegas reagente ((GG) ) in concentrazioni relativamente elevate in concentrazioni relativamente elevate (1 a 100)(1 a 100)..

2. Io ione 2. Io ione radicalicoradicalico del gas reagente del gas reagente GG++.. reagisce con molecole reagisce con molecole G neutre e forma ioni G neutre e forma ioni GHGH++..

Il gas reagente Il gas reagente protonatoprotonato GHGH++ (acido di (acido di BrönstedBrönsted)) fungerà da fungerà da specie ionizzante attraverso una reazione di specie ionizzante attraverso una reazione di trasferimento di trasferimento di un protone un protone (reazione (reazione ioneione--molecola neutra) molecola neutra)

GHGH++ + + MM MHMH++ + G+ GIonizzazione chimica di Ionizzazione chimica di MM

GG++.. GHGH++

Ionizzazione del gas reagente GIonizzazione del gas reagente G

Ionizzazione chimica (CI)

1. Il gas reagente è soggetto a ionizzazione elettronica EI.1. Il gas reagente è soggetto a ionizzazione elettronica EI.

G G GG++..

Ionizzazione EI del gas reagente GIonizzazione EI del gas reagente G

CHCH44 + e+ e-- ----------> > CHCH44++.. + 2e+ 2e-- ------------> > CHCH33

++ + H+ H..

1. Ionizzazione del gas reagente

Lo ione molecolare del metano (Lo ione molecolare del metano (CHCH44++..)) generato per generato per ionizzazione ionizzazione

elettronicaelettronica pupuòò reagire con l'eccesso di metano neutro:reagire con l'eccesso di metano neutro:

CHCH44++.. + CH+ CH44 ----------> > CHCH55

++ + CH+ CH33..

CHCH44++.. + CH+ CH44 ----------> > CC22HH55

++ + H+ H22 + H+ H..

Il catione Il catione CHCH55++, un acido forte, pu, un acido forte, puòò quindi quindi protonareprotonare con una con una

reazione acidoreazione acido--base praticamente qualsiasi molecola organica (pibase praticamente qualsiasi molecola organica (piùùbasica del metano).basica del metano).

1.1.

2.2.

Es.Es. MetanoMetano

CC22HH55++ + CH+ CH44 ----------> > CC33HH55

++ + 2H+ 2H22

2. Trasferimento di un protone

CHCH55+ + + + MM MHMH++ + + CHCH44

Ionizzazione chimica di Ionizzazione chimica di MM

Il processo di trasferimento di un protone corrisponde ad una Il processo di trasferimento di un protone corrisponde ad una reazione, in fase gas, Acidoreazione, in fase gas, Acido--Base secondo Base secondo BrBrøønstednsted--LowreyLowrey

3.3.

3,43,4--dimetossiacetofenonedimetossiacetofenone

M + 1M + 1

??

Formazione di addotti (metano)

Oltre a reazioni di trasferimento protonico che portano alla Oltre a reazioni di trasferimento protonico che portano alla formazione di ioni formazione di ioni [M+H][M+H]++ si possono osservare altri si possono osservare altri ioni:ioni:

�� meno intensimeno intensi

�� A valori A valori m/zm/z superiori (nel caso del metano: superiori (nel caso del metano: 15, 29, 4115, 29, 41...Da.Da) a quelli ) a quelli dello ione dello ione [[M+HM+H]]++ quali..quali..

Tali ioni sono dovuti a formazione di Tali ioni sono dovuti a formazione di ADDOTTI ADDOTTI con la molecola Mcon la molecola M..

[M+[M+1515]]++ [M+[M+CHCH33]]++

[M+[M+2929]]++ [M+[M+CC22HH55]]++

[M+[M+4141]]+ + [M+[M+CC33HH55]]++

Formazione di addotti (metanolo)

MHMH++ M + 1M + 1

[M+C[M+C22HH55]]++ M + 29M + 29

CHCH55++ 48%48%

CC22HH55++ 41%41%

CC33HH55++ 6%6%

Gas reagente metano:Gas reagente metano:

CHCH55++ + + MM MMHH++ + + CHCH44

CC22HH55++ + + M M [M+[M+CC22HH55]]++ + + CC22HH44

Utili per identificare o confermare lo ione molecolareUtili per identificare o confermare lo ione molecolare..

Formazione di addotti (metanolo)

CI spectrum (by CI spectrum (by methanemethane) of ) of malonamidemalonamide of pentobarbital PM = 200).of pentobarbital PM = 200).

[M+C[M+C22HH55]]++

[M+C[M+C33HH55]]++

M + 29M + 29

M + 41M + 41

MHMH++

IsobutanoIsobutano::

Altri gas reagenti impiegati in CI sono:Altri gas reagenti impiegati in CI sono:isobutano, ammoniaca, isobutano, ammoniaca, acetonitrileacetonitrile e metanolo.e metanolo.

(CH(CH33))33CC+ + + + MM MHMH++ + + (CH(CH33))33C=CHC=CH22 M + 1M + 1

3.3.

- Altri gas reagenti

1.1.ii--CC44HH1010 + e+ e-- ----------> > ii--CC44HH1010

+.+. + 2e+ 2e--

ii--CC44HH1010+.+. + + ii--CC44HH1010 ------------>> ii--CC44HH99

++ + C+ C44HH9 9 +H+H222.2.

ii--CC44HH99++

AmmoniacaAmmoniaca::

- Altri gas reagenti

3.3.

1.1.NHNH33 + e+ e-- ----------> NH> NH33

+.+. + 2e+ 2e--

NHNH44+ + + + MM MHMH++ + + NHNH33 M + 1M + 1

Formazione di addotti : Formazione di addotti : [M+NH[M+NH44]]+ + [M+18][M+18]++

NHNH33+.+. + NH+ NH33 ------------> > NHNH44

++ + NH+ NH22..2.2.

Il gas G deve avere affinità protonica Il gas G deve avere affinità protonica MINOREMINORE di quella di M di quella di M altrimenti non è in grado di cedere il protone alla molecola Maltrimenti non è in grado di cedere il protone alla molecola M

GGHH++ + M M+ M MHH++ + G+ G

- Scelta del gas reagente

�� Affinità protonica (PA)Affinità protonica (PA)

201201NHNH44++NHNH33

193193ii--CC44HH99++ii--CC44HH1010

182182CHCH33OHOH22++CHCH33OHOH

169169HH33OO++HH22OO

126126CHCH55++CHCH44

PAAcido BrønstedGas reagente G

∆∆HH = PA (G) = PA (G) –– PA (M)PA (M)

L’energia trasferita dai vari ioni secondari (metano, isobutano L’energia trasferita dai vari ioni secondari (metano, isobutano e e ammoniaca) diminuisce nell’ordine :ammoniaca) diminuisce nell’ordine :

CHCH55++ ii--CC44HH99

++ NHNH44++>> >>

�� Energia trasferitaEnergia trasferita


Lo ione Lo ione NHNH44++ trasferisce meno energia allo ione trasferisce meno energia allo ione MHMH++ che di che di

conseguenza si conseguenza si frammenterà menoframmenterà meno..

- Scelta del gas reagente.

Figure 1. CI spectrum Figure 1. CI spectrum (by (by methanemethane))

MHMH+ + = 201= 201

MINORE FRAMMENTAZIONEMINORE FRAMMENTAZIONE

MalonamideMalonamide of pentobarbital of pentobarbital PM = 200PM = 200

CH5+ i-C4H9

+ NH4+> >

MHMH+ + = 201= 201

Figure 2. CI spectrum Figure 2. CI spectrum (by(by ammoniaammonia))

MetilbenzofenoneMetilbenzofenonePM = 196PM = 196

- Scelta del gas reagente. CH5+ i-C4H9

+ NH4+> >

Dall’esame degli spettri registrati con diversi reagenti si arriDall’esame degli spettri registrati con diversi reagenti si arriva alla va alla conclusione che, oltre all’informazione sul conclusione che, oltre all’informazione sul peso molecolarepeso molecolare, si , si possono anche ottenere informazioni sulla frammentazione, possono anche ottenere informazioni sulla frammentazione, mediante una oculata scelta del gas reagente.mediante una oculata scelta del gas reagente.


Caratteristiche (CI)

�� E’ una ionizzazione “E’ una ionizzazione “softsoft”. ”. Questa tecnica di ionizzazione Questa tecnica di ionizzazione genera uno ione molecolare MHgenera uno ione molecolare MH++ con un bassissimo eccesso di con un bassissimo eccesso di energia (< a 5 energia (< a 5 eVeV), e le reazioni di frammentazione sono quindi ), e le reazioni di frammentazione sono quindi poco importanti.poco importanti.

Ione molecolare sempre presente:

informazione PM

Ione molecolare sempre Ione molecolare sempre presente:presente:

informazione PMinformazione PM

Minore frammentazione:

scarse informazioni sulla struttura

Minore frammentazione:Minore frammentazione:

scarse informazioni sulla scarse informazioni sulla strutturastruttura

☹☹☺☺

EFEDRINAEFEDRINASpettro di Massa per Spettro di Massa per Ionizzazione ElettronicaIonizzazione Elettronica

MW= 165

MM++..

EI versus CI

EFEDRINAEFEDRINASpettro di Massa per Spettro di Massa per Ionizzazione ChimicaIonizzazione Chimica

EE’’ una tecnica di ionizzazione ad energia piuna tecnica di ionizzazione ad energia piùù bassa e consente di rilevare lo bassa e consente di rilevare lo ione molecolare.ione molecolare.

EI versus CI

MW= 165

[M+H]+[M+H]+

��Il campione deve essere in stato di Il campione deve essere in stato di vapore…vapore…

Caratteristiche (CI)

�� Interfaccia con sistemi Interfaccia con sistemi cromatograficicromatografici (HPLC).(HPLC).

�� Adatto per composti piccoli (< 800 Da),Adatto per composti piccoli (< 800 Da), volatilivolatili, , termicamentetermicamente stabilistabili..

E’ un processo attraverso il quale una molecola è sia E’ un processo attraverso il quale una molecola è sia evaporataevaporatada una superficie (substrato) che da una superficie (substrato) che ionizzata.ionizzata.

Ionizzazione per Desorbimento: FAB e MALDI

Il campione viene Il campione viene desorbitodesorbito e ionizzatoe ionizzato mediante un processo che sfrutta il mediante un processo che sfrutta il bombardamentobombardamento del substrato contenente il campione, con del substrato contenente il campione, con atomiatomi ad alta ad alta energia o energia o fotoni, o frammenti di fissione nucleare.fotoni, o frammenti di fissione nucleare.L’impatto deposita energia sul campione tramite la matrice e porL’impatto deposita energia sul campione tramite la matrice e porta al ta al trasferimento delle molecole in fase gassosa e alla ionizzazionetrasferimento delle molecole in fase gassosa e alla ionizzazione

�� La miscela (La miscela (analitaanalita--matricematrice) posta su una sonda opportuna, viene ) posta su una sonda opportuna, viene introdotta nella camera della sorgenteintrodotta nella camera della sorgente

�� Il campione è miscelato ad una Il campione è miscelato ad una MATRICE LIQUIDAMATRICE LIQUIDA(Glicerolo, (Glicerolo, TiogliceroloTioglicerolo, , NitrobenzilNitrobenzil alcol, alcol, dietilamminadietilammina).).

Ionizzazione per bombardamento di ioni con atomi ve loci -FAB - Fast Atom Bombardment

Soluzione dell’analita in glicerinaSonda

(atomi neutri pesanti (atomi neutri pesanti come come xenonxenon, , argon argon con con un energia cinetica di 8un energia cinetica di 8--10 10

keVkeV ).).

�� viene viene bombardatabombardata da un fascio di da un fascio di atomi neutri atomi neutri che si muovono che si muovono ad ad alta velocitàalta velocità

�� L’impatto degli atomi contro la miscela crea fenomeno di superfL’impatto degli atomi contro la miscela crea fenomeno di superficie icie cioè cioè gli atomi impattano sulle superficigli atomi impattano sulle superfici e proiettano via molecole di e proiettano via molecole di analitaanalita. .

Ionizzazione per bombardamento di ioni con atomi ve loci (FAB)

Visione pittorica del bombardamento con atomi veloci sulla superVisione pittorica del bombardamento con atomi veloci sulla superficie della ficie della soluzione (dispersione) di glicerina con produzione di soluzione (dispersione) di glicerina con produzione di ioni positiviioni positivi e e negativi negativi delldell’’analitaanalita come pure di specie neutre (N) e ioni di glicerina (G)come pure di specie neutre (N) e ioni di glicerina (G)

In particolare, si verifica un elevato In particolare, si verifica un elevato innalzamento della temperaturainnalzamento della temperatura, , per un breve periodo, troppo breve per causare la rottura dei leper un breve periodo, troppo breve per causare la rottura dei legami gami chimici, ma sufficientemente alto da permettere la ionizzazione chimici, ma sufficientemente alto da permettere la ionizzazione per per protonazioneprotonazione dei composti da analizzare.dei composti da analizzare.

Ionizzazione per bombardamento di ioni con atomi ve loci (FAB)

�� In questo tipo di ionizzazione il vantaggio rispetto alle preceIn questo tipo di ionizzazione il vantaggio rispetto alle precedenti è denti è costituito dal fatto che il campione costituito dal fatto che il campione nonnon deve essere trasformato in deve essere trasformato in gas o vaporegas o vapore..

L’introduzione di questa tecnica nei primi anni ‘80 ha rivoluzioL’introduzione di questa tecnica nei primi anni ‘80 ha rivoluzionato la nato la spettrometriaspettrometria di massa, aprendola alla biologia e alla medicina. di massa, aprendola alla biologia e alla medicina.

�� Ionizzazione ‘soft’.Ionizzazione ‘soft’. Con questa tecnica in genere si Con questa tecnica in genere si evitano evitano ulteriori frammentazioniulteriori frammentazioni della molecola in esame, problema della molecola in esame, problema presente sia nella ionizzazione chimica che elettronica.presente sia nella ionizzazione chimica che elettronica.

�� QuantitQuantitàà minima circa 20 minima circa 20 picomolipicomoli

�� Questa tecnica può essere quindi applicata anche a Questa tecnica può essere quindi applicata anche a molecole molecole grandi poco volatiligrandi poco volatili: : peptidipeptidi, piccole proteine, altri , piccole proteine, altri biopolimeribiopolimeri (fino a (fino a ≈≈ 5000).5000).

Ionizzazione per bombardamento di ioni con atomi vel oci (FAB)

MALDI - Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation

La tecnica MALDI è stata introdotta da La tecnica MALDI è stata introdotta da KarasKaras e e HillkampHillkamp nel 1988 per la nel 1988 per la ionizzazione di ionizzazione di peptidipeptidi e di proteinee di proteine. Successivamente questa tecnica è Successivamente questa tecnica è stata in grado di analizzare altri tipi di stata in grado di analizzare altri tipi di biomolecolebiomolecole come come oligosaccaridi oligosaccaridi glicolipidiglicolipidi, , nucleotidinucleotidi e polimeri sintetici. e polimeri sintetici.

�� Il campione è cristallizzato con Il campione è cristallizzato con MATRICI CRISTALLINEMATRICI CRISTALLINE capaci di capaci di assorbire la assorbire la radiazione UVradiazione UV del laser, (del laser, (Es.Es. nicotinicnicotinic acid or acid or dihydroxybenzoicdihydroxybenzoicacid)acid). .

- Matrice cristallina (anzichè liquida).- Fascio di fotoni (anziché di atomi).

- Ioni prodotti sono spesso solo a singola carica

--The final molar ratio The final molar ratio samplesample//matrixmatrix isisaboutabout or or aroundaround 1/5000.1/5000.

�� Un impulso di raggio laser colpisce la Un impulso di raggio laser colpisce la MATRICE CRISTALLINAMATRICE CRISTALLINA . Il laser . Il laser che emette radiazione UV, ha funzione di aiutare a introdurre enche emette radiazione UV, ha funzione di aiutare a introdurre energia nel ergia nel sistema molecolare per promuovere la ionizzazione impedendo sistema molecolare per promuovere la ionizzazione impedendo contemporaneamente una degradazione termica del contemporaneamente una degradazione termica del campionecampione ..


Molecole di campioneMolecole di campione

matricematrice

Ioni positiviIoni positivi

Ioni negativiIoni negativi


�� La quantità di campione richiesta è molto piccola (La quantità di campione richiesta è molto piccola (1 to 10 pmol/ul).).

�� MALDI è utilizzato per determinare il peso molecolare di MALDI è utilizzato per determinare il peso molecolare di peptidipeptidi, , proteine, proteine, oligonucleotidioligonucleotidi, ed altri composti di origine biologica o sintetica , ed altri composti di origine biologica o sintetica (polimeri sintetici).(polimeri sintetici).

-- MALDI tollera l’impiego di sali e tamponi. Anche se è meglio riMALDI tollera l’impiego di sali e tamponi. Anche se è meglio rimuoverli per muoverli per ottenere migliori performance.ottenere migliori performance.

Caratteristiche MALDI

Ionizzazione elettrospray (ESI)

L’ESI è una tecnica di ionizzazione “soft” che consente di analiL’ESI è una tecnica di ionizzazione “soft” che consente di analizzare zzare molecole grandi, non volatili generando ioni molecolari [molecole grandi, non volatili generando ioni molecolari [M+HM+H]]++

direttamente da una direttamente da una SOLUZIONESOLUZIONE del campione. del campione.

Il campione è sciolto in un solvente opportuno in presenza di Il campione è sciolto in un solvente opportuno in presenza di piccole quantità di un acido.piccole quantità di un acido.

ControelettrodoCAPILLARE


FLUSSO DI GAS

FLUSSO DI GAS

Capillare dell’eletrospray

Capillare Capillare dell’dell’ eletrosprayeletrospray

La soluzione (<La soluzione (<1010--33 M) dell’M) dell’analitaanalita, , passando attraverso un passando attraverso un capillarecapillare di acciaio inossidabile, di acciaio inossidabile, vieneviene NEBULIZZATA NEBULIZZATA ..

Nebulizzazione



Si forma un aerosol di Si forma un aerosol di piccole gocciolinepiccole goccioline di solvente contenenti di solvente contenenti il campioneil campione. La ionizzazione di solito è spontanea, ma può essere indotta con l’aggiunta di reagenti adatti.

Solvente/campione



In particolareIn particolare, poiché l’estremità del capillare si trova ad un , poiché l’estremità del capillare si trova ad un POTENZIALE ELEVATOPOTENZIALE ELEVATO (3(3--6 6 kVkV)) la nebulizzazione porta alla la nebulizzazione porta alla formazione di formazione di goccioline cariche goccioline cariche che contengono l’che contengono l’analitaanalitaIONIZZATOIONIZZATO..

Nebulizzazione

Meccanismo di formazione delle goccioline caricheMeccanismo di formazione delle goccioline caricheSe il potenziale del capillare è Se il potenziale del capillare è positivopositivo, gli , gli IONI POSITIVIIONI POSITIVI della della soluzione elettrolitica si allontanano dal capillare e si accumusoluzione elettrolitica si allontanano dal capillare e si accumuleranno leranno sulla superficie del liquido che si trova sulla punta del capillsulla superficie del liquido che si trova sulla punta del capillare. Gli are. Gli IONI NEGATIVIIONI NEGATIVI saranno invece trattenuti all’interno del capillare.saranno invece trattenuti all’interno del capillare.

Nebulizzazione: formazione delle goccioline cariche

Quando la Quando la repulsionerepulsione degli ioni positivi presenti sulla superficie, degli ioni positivi presenti sulla superficie, assieme alla assieme alla forzaforza esercitata su di essi dal esercitata su di essi dal campo elettricocampo elettrico, vincono , vincono la tensione superficiale del liquido si ha l’espansione del liqula tensione superficiale del liquido si ha l’espansione del liquido ido (che si muove seguendo il campo) in un cono ((che si muove seguendo il campo) in un cono (conocono didi TaylorTaylor), ),


La punta del cono di La punta del cono di TaylorTaylor, essendo la parte meno stabile, si , essendo la parte meno stabile, si allunga a formare un getto sottile si scinde in singole goccioliallunga a formare un getto sottile si scinde in singole goccioline ne cariche (spray) . cariche (spray) .


Le Le goccioline cariche positivamentegoccioline cariche positivamente, vengono attratte da un , vengono attratte da un controelettrodocontroelettrodo, che può essere costituito grossolanamente da un , che può essere costituito grossolanamente da un capillare capillare mantenuto sotto vuotomantenuto sotto vuoto ee a un potenziale negativoa un potenziale negativo; in tal ; in tal modo e con l’aiuto di un modo e con l’aiuto di un flusso di gas ausiliario inerte (Nflusso di gas ausiliario inerte (N22) ) riscaldatoriscaldato, coassiale rispetto alla direzione del flusso di soluzione, il , coassiale rispetto alla direzione del flusso di soluzione, il sovente sovente evaporaevapora



FLUSSO DI GAS

FLUSSO DI GAS

Evaporazione del solvente (evaporazione ionica)

Man mano che il solvente contenuto nelle goccioline Man mano che il solvente contenuto nelle goccioline EVAPORAEVAPORA , , queste siqueste si rimpiccioliscono (il raggio si riduce), mentre rimpiccioliscono (il raggio si riduce), mentre aumenta la aumenta la densità di carica. densità di carica.

Evaporazione del solvente

In questo modo la forza di In questo modo la forza di repulsione elettrostaticarepulsione elettrostatica coulombianacoulombiana, , aumentata a causa della aumentata a causa della forteforte densitàdensità elettrica. elettrica.

Ad un certo valore del raggio della gocciolina, quando la Ad un certo valore del raggio della gocciolina, quando la repulsione repulsione superasupera l’effetto di coesione esercitato dalla l’effetto di coesione esercitato dalla tensione tensione superficialesuperficiale della goccia (della goccia (limite di limite di Rayleigh*Rayleigh*)), si osserva , si osserva ““L’ESPLOSIONEL’ESPLOSIONE”” delle goccioline con formazione di piccolissime delle goccioline con formazione di piccolissime goccioline cariche.goccioline cariche.

Evaporazione del solvente

*Il*Il limite di limite di RayleighRayleigh (il punto in cui la forza di repulsione di Coulomb delle carich(il punto in cui la forza di repulsione di Coulomb delle cariche sulla e sulla superficie è uguale alla tensione superficiale della soluzione).superficie è uguale alla tensione superficiale della soluzione).

Formazione di ioni

??

La formazione di ioni La formazione di ioni monomono e e multicaricamulticarica dalle goccioline è un dalle goccioline è un fenomeno che ha luogo in più stadi attraverso fenomeno che ha luogo in più stadi attraverso meccanismimeccanismi tuttora tuttora oggetto di discussione:oggetto di discussione:

�� Meccanismo del residuo caricoMeccanismo del residuo carico , , (CRM), (CRM), chargedcharged residue modelresidue model, , DoleDole..Le Le gocciegoccie vanno incontro ad una vanno incontro ad una serie di scissioniserie di scissioni che portano alla che portano alla fine alla produzione di piccole fine alla produzione di piccole gocciegoccie con una o più cariche che con una o più cariche che trasportano trasportano una sola molecolauna sola molecola di di analitaanalita: : ioni ioni monocaricamonocarica oomulticaricamulticarica

Evaporazione del solvente e meccanismi di formazion e di ioni

�� Meccanismo di Meccanismo di evaporazione ionicaevaporazione ionica (IME) (IME) ionion evaporationevaporation model,model, IribarneIribarneand and ThomsonThomson).).Singole molecoleSingole molecole cariche vengono espulse direttamente dalla goccia cariche vengono espulse direttamente dalla goccia

per ridurre la densità di carica sulla superficie. per ridurre la densità di carica sulla superficie.

Evaporazione del solvente e meccanismi di formazion e di ioni

Gli ioni generati vengono poi indirizzati da un gradiente di camGli ioni generati vengono poi indirizzati da un gradiente di campo po verso l’analizzatoreverso l’analizzatore

�� E’ un metodo di ionizzazione soft per cui si osserva uno ione E’ un metodo di ionizzazione soft per cui si osserva uno ione molecolare integro. Si può formare:molecolare integro. Si può formare:-- uno ione a uno ione a carica singolacarica singola (M+H)(M+H)++

Es.Es. PPentapeptideentapeptide leucineleucine enkephalinenkephalin ((CC2828HH3737NN55OO77) ) PM = PM = 555.2692 Da555.2692 Da

Caratteristiche (ESI)

Lo spettro EI non è utile, in quanto il lattosio ha una bassa teLo spettro EI non è utile, in quanto il lattosio ha una bassa tensione di vapore ed è nsione di vapore ed è termicamente labile: lo spettro non presenta alcun picco carattetermicamente labile: lo spettro non presenta alcun picco caratteristico. Lo spettro ristico. Lo spettro ESI mostra un debole picco dello ione molecolare a ESI mostra un debole picco dello ione molecolare a m/z m/z 342342 e un picco caratteristico e un picco caratteristico [M + 23][M + 23]++,, il picco ione molecolare più sodio. Poiché gli ioni sodio sono il picco ione molecolare più sodio. Poiché gli ioni sodio sono ubiquitariubiquitari in in soluzione acquosa, questi addotti con il sodio sono molto comunisoluzione acquosa, questi addotti con il sodio sono molto comuni..


-- Si possono formare addotti con il sodio Si possono formare addotti con il sodio ((M+NaM+Na))++


-- Spesso vengono prodotti Spesso vengono prodotti ioni ioni multicaricamulticarica (z > 1) (z > 1) ((multiplymultiply chargedchargedionsions) ) ((M+nHM+nH))n+n+. L’ESI infatti può dislocare sulle molecole un . L’ESI infatti può dislocare sulle molecole un numero di cariche (protoni) anche elevato.numero di cariche (protoni) anche elevato.Siccome ogni misura di MS è una misura del rapporto Siccome ogni misura di MS è una misura del rapporto m/m/zz ne consegue ne consegue che all'aumentare di che all'aumentare di zz, il rapporto , il rapporto m/zm/z diminuiscediminuisce e quindi possono e quindi possono essere analizzate anche sostanze con una essere analizzate anche sostanze con una elevatissima massa elevatissima massa molecolare.molecolare.Ad esempio, se una molecola di massa relativa M = Ad esempio, se una molecola di massa relativa M = 99909990 DaltonDalton dà dà uno ione con uno ione con 1010 cariche positive, tale segnale avrà la composizione cariche positive, tale segnale avrà la composizione (M+(M+1010H)H)1010++ e quindi il picco corrispondente apparirà a:e quindi il picco corrispondente apparirà a:

= = 10001000m/zm/z ==(M+10)(M+10)

10 10

(9990+10)(9990+10)

10 10

== ==1000010000

10 10

Ciò consente di analizzare anche molecole con Ciò consente di analizzare anche molecole con ELEVATO PESO ELEVATO PESO MOLECOLARE MOLECOLARE (ad esempio le proteine)(ad esempio le proteine) impiegando analizzatori che impiegando analizzatori che hanno un hanno un rangerange ridotto (limite superiore di PM 1200 Da), ad esempio i ridotto (limite superiore di PM 1200 Da), ad esempio i quadrupoliquadrupoli..

Quando la massa molecolare relativa (RMM) è Quando la massa molecolare relativa (RMM) è incognita, incognita, lala si può calcolare si può calcolare da due semplici formule (o meglio il calcolatore la deduce da seda due semplici formule (o meglio il calcolatore la deduce da semplici mplici formule) date da:formule) date da:

m/zm/z mm11 e e m/zm/z mm22 sono due picchi adiacenti dove m1<m2sono due picchi adiacenti dove m1<m2

nn22= = numero delle carichenumero delle cariche dello ione a dello ione a m/zm/z mm22

H = la massa di un protoneH = la massa di un protone

M = la massa molecolare relativa (RMM) M = la massa molecolare relativa (RMM) dell'incognito. dell'incognito.

Dal momento che i picchi dell'insieme sperimentale formano una sDal momento che i picchi dell'insieme sperimentale formano una serie in cui ciascun erie in cui ciascun termine differisce dal vicino per una carica, risulta facile pertermine differisce dal vicino per una carica, risulta facile per il il sistema di sistema di elaborazione dati:elaborazione dati:-- identificare la carica associata a ciascun piccoidentificare la carica associata a ciascun picco-- calcolare la massa molecolare da ciascun picco usando calcolare la massa molecolare da ciascun picco usando M=nM=n(m(m--H)H)-- mediare i valori di massa molecolare. mediare i valori di massa molecolare. Un opportuno programma di trasformazione presenta poi i dati in Un opportuno programma di trasformazione presenta poi i dati in uno spettro di uno spettro di massa ricostruito.massa ricostruito.

ESI: calcolo della massa degli ioni multicarica

Esempio 1:Esempio 1: Spettro ESI di ioni positivi della mioglobina equina (peso molecolare medio 16950,5)

Insieme di picchi ciascuno corrispondente alla molecola intatta, ma con diverse con diverse carichecariche (protoni) a partire da z=24 con m/z 707 fino a z=12 con m/z 1413.


Esempio 1:Esempio 1: Deconvoluzione dello spettro ESI multicarica dellamioglobina. (peso molecolare 16950,5)

Spettro ESI ricostruitoSpettro ESI ricostruito


protein hen egg white lysozyme MW = 14304.9 Daproteinprotein henhen eggegg whitewhite lysozymelysozyme MW = 14304.9 DaMW = 14304.9 DaEsempio 2:Esempio 2:


Deconvoluzione protein hen egg white lysozyme MW = 14304.9 DaDeconvoluzioneDeconvoluzione proteinprotein henhen eggegg whitewhite lysozymelysozyme MW = 14304.9 DaMW = 14304.9 DaEsempio 2:Esempio 2:

Spettro ESI ricostruitoSpettro ESI ricostruito


La ionizzazione di un La ionizzazione di un peptidepeptide ha generato una popolazione di ha generato una popolazione di peptidipeptidicarichi e non carichi. carichi e non carichi. (In positive (In positive ionion mode the mode the analyteanalyte isis sprayedsprayed at at lowlow pHpH toto encourageencouragepositive positive ionion formationformation.. In negative In negative ionion the the analysisanalysis isis normallynormally carriedcarried out out wellwell aboveabove a a moleculesmolecules isoelectricisoelectric pointpoint toto deprotonatedeprotonate the the moleculemolecule).).

Il numero di cariche positive che una molecola può supportare diIl numero di cariche positive che una molecola può supportare dipende pende dal dal numero di centri basicinumero di centri basici presenti sulla molecola.presenti sulla molecola.

Caratteristiche (ESI) ioni multicarica

Lo spettro contiene ioni a carica singola (Lo spettro contiene ioni a carica singola (m/zm/z 379.2) e a doppia carica (379.2) e a doppia carica (m/zm/z 190.1)190.1)

m/zm/z 379.2379.2

m/zm/z 190.1190.1

Caratteristiche (ESI) ioni multicarica

zz è la carica dello ione = 2è la carica dello ione = 2

[[M+HM+H]]++

[M+2H][M+2H]++++ zz = 2= 2

�� ESI è un processo a pressione atmosferica. Ciò rende l’ESI un ESI è un processo a pressione atmosferica. Ciò rende l’ESI un metodo più semplice che può essere accoppiato molto bene con metodo più semplice che può essere accoppiato molto bene con interfacce di tipo HPLCinterfacce di tipo HPLC


�� E’ il metodo di scelta per l’analisi di molecole E’ il metodo di scelta per l’analisi di molecole termolabilitermolabili. Può . Può essere utilizzato per essere utilizzato per biopolimeribiopolimeri di piccole e grandi dimensioni di piccole e grandi dimensioni ((peptidespeptides, , proteinsproteins, , carbohydratescarbohydrates, and DNA , and DNA fragmentsfragments), and ), and lipidslipids. .

�� Il campione deve essere solubile e stabile in soluzione, deve Il campione deve essere solubile e stabile in soluzione, deve essere polare e relativamente pulito (essere polare e relativamente pulito (freefree of of nonvolatilenonvolatile buffersbuffers, , detergentsdetergents, , saltssalts, etc.). , etc.).

Metodi di ionizzazione -...

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