Neosporosi

Aggiornamenti

sulle

prospettive di

controllo

Alda NataleIZS delle Venezie

Legnaro (PD)

Ciclo biologico

Oocisti

Sporocisti

Tachizoiti

Bradizoiti

Malattia clinica:

tachizoiti

Cane: escrezione a

partire da 1 settimana

post-infezione

Dose infettante: 127 oocisti vitali

(Gondim et al., 2004; McCann et al, 2007)

Specie

• Nespora caninum

• Neospora hughesi (cavallo)

Specie ospite: bovino, cane, ovi-caprini, camelidi,

cervi, rinoceronte, roditori. Lagomorfi, canguri,

pappagalli, polli…. (importanza epidemiologica?)

Ospiti definitivi: cane, lupo, dingo, coyote; volpe

rossa (sospetta).

Due tipi di trasmissione verticale

• Trasmissione transplacentare esogena (exogenous

transmission): la madre si infetta durante la gravidanza e

oltrepassa la placenta. Madre e feto si infettano in

contemporanea (Trees & Wiliams, 2005). Un solo aborto?

• Trasmissione transplacentare endogena (endogenous

transmission): la madre ha infezione latente, che si

riattiva in gravidanza, in genere nell’ultimo trimestre

(Williams et al., 2000). Non necessariamente la madre deve

essere infetta in modo congenito (McAllister et al., 2000,

Bjorkman et al, 2003). Più aborti?

Horcajo et al, 2016

Conseguenze a lungo termine di

infezione orizzontale

Molto variabili. Probabilmente dipendono da:

• Età degli animali

• Gravidanza in fase iniziale (senza trasmissione)

• Gravidi in fase avanzata (con trasmissione)

• Non gravidi

• Ceppo di Neospora

• Dose infettante

Infezione orizzontale

• Da oocisti in mangime, acqua, pascolo

• In gruppi selezionati “random”, l’incidenza della via orizzontale è mediamente bassa (4-5% secondo Bartels et al., 2007) rispetto alla trasmissione congenita (~45%)

• Vie di trasmissione non dimostrate: es. topi infetti che finiscono nell’alimento? (McAllister, 2016)

Neosporosi nel bovino

Unico segno nell’adulto è l’aborto (circa 6

settimane post-infezione; Gondim et al, 2004;

McCann et al, 2007)

Possono abortire a qualunque periodo dai 3

mesi a termine

La maggior parte degli aborti avviene attorno

al 5°-7° mese

Prevalenze per tipologia di allevamento

Maggiori (40% in più) in allevamenti da latte

rispetto a quelli da carne (Reichel et al, 2013).

Probabilmente dovuto a management piuttosto

che a maggior sensibilità. Es.:

- Somministrazione di alimento miscelato

- Maggiori quantità di acqua e alimento

- Allevamento intensivo vs estensivo

In caso di positività, le vacche da carne hanno

rischi di aborto comparabili.

16%(10–24)

49%(39–59)

63%(57–69)

76%(67–84%)

Dairy herds prevalence

(Bartels et al., 2006)

Beef herds prevalence

(Bartels et al., 2006)

41%(31–50)

46%(41– 51)

61%(50–72)

Prevalenze per razza

• Segnalati più aborti in Bos taurus taurus rispetto a Bos taurus indicus (zebù)

• Più sensibili Holstein rispetto a incroci Holstein-Zebù (Asmare et al., 2013).

• In Bubalus bubalis (bufalo indiano) c’è alta sieroprevalenza (Guarino et al., 2000; Gennari et al., 2005) e basso tasso di aborti (Reichel et al, 2015).

Maggiore sensibilità o minori indagini?

Endemia o epidemia?

• Endemia: elevata e costante % di aborti in allevamento (>5%)

• Epidemia: tempesta di aborti al 4°-7° mese di gravidanza, talvolta con mummificazione – fino a 20-30% di bovine gravide che abortiscono; la fonte di contaminazione è difficile da identificare a posteriori, ma ci sono evidenze epidemiologiche (es. più gruppi sullo stesso pascolo, o con stesso fonte di mangime/supplementi dietetici/acqua).

N.B.: insilati non protetti(!)

Danni economici annui

Somma di 10 paesi (Reichel et al., 2013): $ 1-2,4 miliardi(di cui 2/3, cioè 800.000.000, nell’industria del latte)

Stati Uniti (Reichel et al, 2013)

• $ 546.000.000 allevamenti da latte

• $ 111.000.000 allevamenti da carne

California (Dubey, 1999): $ 35.000.000

Australia (Ellis, 1997): A$ 100.000.000

Argentina (Moore et al, 2013): $ 50.000.000

Svizzera (Hasler et al, 2006): € 9.700.000

Nuova Zelanda (Reichel & Ellis): NZ$ 28.400.000

Situazione attuale

• No vaccino

• No terapia per animali infetti

• L’isolamento non garantisce protezione: l’infezione può arrivare con l’acqua e alimento

• Note positive: non è una zoonosi; non ci sono limiti al commercio di animali positivi

• Importanza economica solo per i danni riproduttivi

Produzioni

• Diminuita produzione di latte in seguito ad

aborti;

• Studi contradditori sulla produzione di latte, ma

si tende a escludere un effetto diretto sulla

lattazione

• Anche sulla produzione di carne nulla di

dimostrato (sospettati ridotti indici di

conversione, poi smentiti)

Interfaccia materno-fetale: possibili danni causati dalla

risposta immunitaria di tipo 1 sono modulati da un

incremento del rilascio di citochine da parte di T-helper

di tipo 2.

La bovina diventa meno capace di combattere

l’infezione da N.caninum durante la gravidanza ed

aumentano le possibilità di un passaggio del protozoo al

feto

Neosporosi e gravidanza

Risposta immunitaria

Valutati molti parametri della risposta immunitaria, sia al fine di produrre un vaccino efficace, sia per capire la patogenesi dell’aborto.

Fattori coinvolti:

- Risposta Th1→Th2, Th17, Treg

- Serpina14 (↓) e P4 (↑) [Se aumenta eccessivamente nel 2°trimestre: aborto – effetti dati dall’infezione?] (Serrano-Pérez et al., 2016)

- IFN-g (↓), IL-17(↓)-, IL-4 (↑), IL-10 (↑), TGF-b (↑)

(Peckam et al., 2014; Almeria et al., 2016; Serrano-Pérez et al., 2016)

Destino del feto:

• morire in utero

• riassorbito

• mummificato

• autolisi

• nascere morto

• nascere vivo con segni clinici

• nascere normale ma infetto cronico

Segni clinici nel vitello (< 2 mesi):

• neurologici (flessione o iperestensione degli

arti, atassia,

< riflesso patellare)

• debolezza

• sottopeso

• esoftalmo

• idrocefalo (raro)

Patogenesi dell’aborto

Primo trimestre: morte del feto (?) o nessun

effetto (no trasmissione)

Secondo trimestre: in genere aborto

Terzo trimestre: nascita di un vitello vivo ed infetto

cronico

0

1

2

3

4

5

6

n°

ab

ort

i

3 4 5 6 7 > 9

mesi

età aborti Neospora

Infezioni sperimentali

• Primo trimestre di gravidanza (7 vacche): anche alti dosaggi (70.000 oocisti) non hanno dato infezione;

• Tra i 120 e i 130 gg (9 vacche): 6 vitelli non infetti, 2 aborti e 1 nato morto;

• Fine del secondo trimestre – inizio del terzo (7 vacche): 6 vitelli con infezione congenita anche con bassa DI (127 oocisti), ma clinicamente sani.

Finestra di suscettibilità

Diagnosi nel bovino adulto

Sierologia: Ab nel siero e nel latte

• ELISA (avidity)

• IFAT

La diagnosi sul feto è

indice di infezione

materna

Screening sierologico

Lo screening sierologico mediante ELISA ha più

valore se eseguito su 10 vacche che hanno

abortito di recente + 10 vacche di controllo.

Valutare sia la % di positivi, sia l’intensità di

reazione.

La procedura è valida anche per altri agenti

abortigeni (Leptospira, Febbre Q, ecc.)

Kit ELISA commercialiSono in commercio una decina di kit ELISA, tutti

con prestazioni piuttosto buone (Alvarez-Garcia et al., 2013). Ag: solo tachizoiti (!!) Kit sperimentale con bradizoiti (Aguado-Martinez et al., 2008)

Unico cELISA: VMRD

Altri tutti iELISA, alcuni multispecie, altri solo per bovino. Attenzione alla diagnosi su specie diverse!

Possibili cross-reattività con B. besnoiti e Sarcocystis spp.

Diagnosi

• Avidity test: indice di infezione cronica

• Quando c’è un elevato tasso di aborti la diagnosi è spesso più chiara, mentre se si esaminano aborti “random” può essere difficile arrivare a diagnosi conclusiva (McAllister, 2016).

Cosa si intende per “tasso elevato”? In USA: razze lattifere >5% per vacche e >3.3% per manze; razze da carne >0,5% per vacche e >0,7% per manze (Anon, 2007). Oppure 5% per razze da latte e 2% per razze da carne (Randostis et al, 1994).

IFAT

E’ l’unico test che può dare un titolo. Dalla

bibliografia (McAllister, 2016):

- Cut-off: 1:25

- Titolo ≥1:400 e <1:1600 positivo ma non

conferma l’aborto da Neopora;

- Titolo ≥1:1600 e >1:6400: probabile aborto da

Neospora

- Titolo ≥1:6400: molto probabile.

N.B.: Manze anche titoli bassi

Diagnosi sul latte

Valutata anche sui nostri

bovini

Elevata corrispondenza fra

siero e latte

Nel latte di massa la soglia

sembra essere attorno al

15-20%

Le bovine sieropositive hanno in media

probabilità 3,5 volte maggiori di abortire

rispetto alle sieronegative (Reichel et al,

2013)

Es. tasso di aborti medio 2-3%; le positive

hanno un tasso di aborti del 7-10,5%

La maggior parte dei vitelli infetti cronici

nasce da bovine sieropositive.

Ma….

Bovine sieropositive e aborto

Questo è vero soprattutto per l’infezione endogena.

In caso di esposizione a infezione orizzontale, invece:

- Vacche sieronegative sono a rischio di aborto

- Vacche sieropositive sono resistenti all’infezione orizzontale (Williams et al, 2003).

Bovine sieropositive e aborto

Bovini sieropositivi e aborto

Il rischio di aborto più alto per una bovina positiva è al primo parto. Se non c’è aborto al primo parto, in seguito la probabilità cala drasticamente, se c’è aborto resta alta (Thurmond & Hietala, 1997).

Raramente da bovine sieropositive possono nascere vitelli perfettamente sani e vitelli infetti possono nascere da madri sieronegative.

Ci sono mandrie con alti livelli di sieroconversione senza elevati tassi di aborti (Dijkstra et al., 2002).

Utilità della sorveglianza sierologica per capirne di più!

Ricerca indiretta

50,8%

41,5%

29,8%

18,7%

10,2%

2,8%0,0%

0,0%

10,0%

20,0%

30,0%

40,0%

50,0%

60,0%

BVD NEOSPORA C. IBR FEBBRE Q. CHLAMYDOPHILA LEPTOSPIRA BRUCELLA

(Piano aborti Regione Veneto)

Verticale, orizzontale

Le due modalità di infezione si alimentano.

Se ci fosse solo la trasmissione la trasmissione

verticale l’infezione si autoestinguerebbe.

Orizzontale: può essere sporadica (es. pascolo) o

clusterizzata (es. da acqua o da mangime

contaminato).

Verticale (endogena): efficienza

Efficienza: % di vitelli nati congenitamente infetti

Da 40% (Schares et al., 1999; Moré et al., 2009) a 95% (Paré et

al., 1996; Schares et al., 1998; Davidson et al., 1999; Hall et al.,

2005)

8 studi che hanno valutato almeno 100 figli di

bovine sieropositive: tra 41% e 86%. C’era

anche evidenza di trasmissioni esogene (stime

deviate in eccesso).

Correzione: stima del 45% (da un totale di 62%) (Bartels et al, 2007).

Diagnosi nel feto abortito/vitello

nato morto a termine

• sierologia da fluidi

corporei (IFA 1:25)

• ricerca lesioni nel

cervello, cuore, fegato

• dimostrazione

parassita: PCR,

immuno-istochimica

• da abbinare alla

sierologia della madre

PCR

• PCR RFLP che comprende e differenzia: Neospora, Toxoplasma, Cryptosporium, (Besnoitia), ecc.

• Diagnosi su singolo feto può essere falsamente negativa a causa di autolisi, putrefazione o mummificazione (espulsione del feto a distanza dalla morte).

• La mummificazione può essere indicativa

Ricerca diretta

68,7%

31,3%

22,5%

7,4%5,6%

4,4% 2,8%

0,0%

10,0%

20,0%

30,0%

40,0%

50,0%

60,0%

70,0%

NEGATIVI POSITIVI NEOSPORA CANINUM BATTERI BVD VIRUS CHLAMYDOPHILA COXIELLA BURNETII

(Dati piano aborti Regione Veneto)

Prevalenza per neosporosi in relazione all'età e allo stato

gravidico

0

5

10

15

20

25

30

35

40

12 12-18 18-24 24-30 30-36 36-42 42-48 48-54 54-60 60-76 >76

mesi

%

vuote

gravide

Screening sierologico aziendale

• Quando prelevare i campioni?

• Se vogliamo la massima probabilità di trovare i

positivi, dobbiamo esaminare le bovine gravide

durante l’ultimo trimestre di gravidanza

• Significato predittivo: i soggetti con titoli

sierologici alti all’inizio di un focolaio poi

abortivano

Conoscere lo stato sierologico di tutte le bovine

Eliminazione bovine sieropositive? (Cut-off ELISA???)

Non è strettamente necessario l’allontanamento

della bovina dalla stalla

Eliminare il contributo che la bovina apporta al

mantenimento dell’infezione:

Controllo

1. Vendita delle vitelle nate da bovine

sieropositive

2. Fecondazione bovine positive con toro da

carne (le manze ibride sembrano essere

meno suscettibili all’aborto – Lopez-

Gatius et al, 2005)

3. Tenere solo manze negative,

indipendentemente dalle madri

4. embryo-transfer (Baillargeon et al, 2001)

Diagnosi nel vitello disvitale/sano

ma sospetto infetto cronico

• sierologia pre-colostrale

• sierologia dopo 150-180 giorni

(sperimentalmente gli Ab materni

declinano dal 128 giorno)

• da abbinare alla sierologia della madre

e “altri parenti”

Sieronegativi infetti?

• Sono segnalati, seppur raramente (Sager et al., 2001;

McInnes et al., 2006; Guido et al., 2016), individui sieronegativi e positivi alla PCR. Veneto: 5% aborti PCR-positivi

• Limite per la possibilità di eradicazione e per il controllo degli animali introdotti: consigliato doppio test, pre- e post- introduzione.

• Ag dei kit ELISA? (Guido et al., 2016)

• Immunotolleranza? (Sager et al., 2001, McInnes et al., 2006; Anderson et al., 2000)

Controllo

• Protezione degli insilati e delle razioni (in assenza di questo, ogni altra misura di controllo non avrà effetto duraturo)

• Controllo delle acque (abbeveratoi sopraelevati)

• Infezione al pascolo non può essere controllata, ma è più rara

• Eradicazione: non è raccomandata come obiettivo

• Vie di trasmissione non dimostrate: es. topi infetti che finiscono nell’alimento? (McAllister, 2016)

Controllo

“Do nothing” option (Reichel & Ellis, 2006):

Consigliata se la sieroprevalenza aziendale è

inferiore a 18-21%.

Controllo infezioni intercorrenti: IBR, BVD,

Paratbc, Leptospirosi…

Controllo micotossicosi

Embryo-transfer: permette di mantenere in stalla

bovine sieropositive di alto pregio (Baillargeon et al.,

2001; Landmann et al., 2002; Campero et al., 2003)

Programmi di controllo

Olanda (Dijkstra et al., 2005): aborti e BTM -riduzione da 38,2% a 24,4% in 3 anni

Spagna (Ortega-Mora et al., 2010): linee guida, formazione, controllo movimentazioni e altre patologie – da 16,2% a 8,5% in 7 anni in Galizia

Portogallo (Niza Ribeiro et al., 2011) come Spagna

Belgio (Cantaloube, 2010): supporto alla diagnosi di aborto

Svizzera (Hasler et al., 2006): notificabile dal 2001

UK-EIRE (Guido et al, 2016)

Israele (Guido et al, 2016)

Cani: che fare?

• Escrezione: di solito dura <2 settimane; i cuccioli eliminano più oocisti degli adulti (Gondim et al., 2005)

• Trovati 7 escretori su 24000 esaminati (Schares et al., 2005)

• Sieropositivi: probabilmente non sono più escretori

• Sieronegativi: potrebbero essere suscettibili

• Ricerca diretta: scarsa probaiblità di successo

• Esame microscopico deve essere confermato da PCR (Hammondia heydorni)

Quindi?

Cani

McAllister (2016) NON suggerisce un divieto assoluto di accesso dei cani, ma:

- Evitare ingestione placente

- Proteggere l’accesso dei cani all’alimento dei bovini (le feci eventualmente infette non devono arrivare a contaminarlo)

- Attenzione a parti e cucciolate: sono le fasi in cui è più probabile l’escrezione;

- Controllare i propri cani e pretendere lo stesso dai vicini

- Attenzione ai cani vaganti: richiedere intervento ASL

- Limitare il numero di cani

Terapia

Al momento nessun farmaco disponibile di

comprovata utilità

• Sulfadiazina (Lindsay & Dubey, 1989 e 1990)

• Monensin (Vanleeuwen et al., 2010, 2011)

• Indagini sperimentali con toltrazuril e ponazuril su

vitelli infettati con tachizoiti… (Kritzner et al., 2002)

Residui?

• Clindamicina e sulfonamide nel cane (casi clinici) (Reichel et al., 1998, 2007)

Vaccini

Vaccino inattivato (USA): non

efficace, non più prodotto

Bovilis NeoGuard-Intervet

Si diceva che riducesse (50%) i

casi di aborto, ma senza

prevenire la trasmissione

verticale

Vaccini

• Esiste un vaccino attenuato per T. gondii (Nuova Zelanda) che funziona per Toxoplasma negli ovini (Buxton & Innes, 1995)

• Tentato un vaccino sperimentale su questo modello (Williams et al., 2007; Rojo-Montejo et al., 2013; Weber

et al., 2013) con buoni risultati, ma non commercializzato – 10 anni di attesa (problemi di stabilità - innocuità)? Stabilità si risolve con produzione su richiesta

• Auspicabile un vaccino efficace per il cane (Nishikawa et al., 2000)

Vaccini

Efficacia del vaccino: protezione prima della

gravidanza su animali negativi

Eviterebbe la trasmissione transplacentare

esogena e l’infezione orizzontale.

Nessuna dimostrazione sulla prevenzione della

trasmisisone endogena in seguito a riattivazione (Reichel et al., 2015)

Contact: Alda Natale (anatale@izsvenezie.it)Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle VenezieLegnaro (PD) - Italy