L'organizzazione del laboratorio di biologia molecolare:

gli spazi, i percorsi, i controlli

dott.ssa Sara Masci

Quando si progetta un laboratorio di BM bisogna

rispettare dei criteri di sicurezza che tutelino

l'OPERATORE e che al tempo stesso garantiscano

l' EFFICIENZA DEI RISULTATI.

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La prima cosa da fare per ridurre il rischio di contaminazione (FP) èSUDDIVIDERE l'ambiente di lavoro in due blocchi separati: una zona di PRE-AMPLIFICAZIONE e una zona di POST-AMPLIFICAZIONE.

Le due zone possono essere mantenute distinte ad es. con aree diverse e dedicate, non comunicanti distribuite lungo un corridoio comune.

Le aree di lavoro:AREA PRE AREA POST

Area prep.ReagentiE mix diamplificaz.

Area diamplificaz.

Area postAmplificaz. E lettura

Area estrazioneAcidinucleici

Il lavoro va organizzato seguendo il sistema di flusso a senso unico dalla zona PRE alla

zona POST amplificazione.

CONTROLLO DELLE CONTAMINAZIONI

La sensibilità della PCR talvolta può essere un problema (amplifica la sequenza bersaglio generando trilioni di copie). Il saggio infatti èpericolosamente sensibile alla presenza nell'ambiente, sull'operatore o sugli strumenti di molecole di DNA provenienti da precedenti amplificazioni.

• Carry-over: l'apertura di una provetta contenente l'amplificato può dar luogo ad un aerosol che rende l'ambiente inutilizzabile per l'allestimento di una nuova reazione

• DNA esogeno: nel caso in cui vengano amplificate regioni del genoma umano anche l'operatore può essere fonte di contaminazione (cell. di desquamazione, capelli...)

Tipi di contaminazioni in “agguato”

• Cross-contaminazione: si verifica durante l'allestimento della reazione, un campione positivo ne contamina uno negativo generando quindi un falso positivo.

PRECAUZIONI GENERALI:Per minimizzare il rischio di falsi positivi

in seguito a contaminazione ènecessario prendere una serie di precauzioni:

1) GLI AMBIENTI

_ Tenere separate l'area di PRE-Amplificazione da quella di POST-amplificazione

_Utilizzare strumenti, materiali e reagenti distinti

_ I campioni di DNA o RNA devono essere preparati in un'area distinta da quella in cui vengono manipolati i reagenti e da quella in cui vengono analizzati gli amplificati.

2) REAGENTI: è buona norma aliquotare i reagenti utilizzati per la PCR ( tampone, primers, nucleotidi, enzima)

_ tutti i reagenti devono essere preparati, aliquotati e conservati in un'area in cui non ci sono prodotti amplificati.

3) PIPETTE: le normali pipette per puntali monouso usate comunemente in laboratorio sono fonte di contaminazione. Si possono formare infatti aerosol contenenti frammenti di DNA che possono essere trasportati in campioni negativi. Per eliminare questa cross-reazione è necessario l'uso di pipette con puntali contenenti un filtro (barriera tra campione e pipetta) o pipette ad espulsione positiva con puntali dotati di pistone .

N.B. E' ASSOLUTAMENTE INDISPENSABILE UTILIZZARE SET DI PIPETTE DISTINTI NELLE DIVERSE AREE.

4) TECNICA LABORATORISTICA

In tutte le varie fasi:

• Cambio frequente guanti

• Apertura attenta provette per minimizzare aerosol ( short spin)

• Aggiungere il campione come ultimo ingrediente della mix

• Chiudere la provetta dopo aver dispensato il campione e prima di passare al successivo

• Pulire le superfici di lavoro con prodotti detergenti specifici.

CONTROLLI

Come in tutte le tecniche laboratoristiche è necessario allestire sia un C+ che un C- per evidenziare eventuali falsi positivi.

• IL CONTROLLO POSITIVO

Non deve avere troppe copie bersaglio o costituirebbe una pericolosa fonte di contaminazione ( generando quantità enormi e non necessarie di sequenze di DNA)

CONTROLLIGeneralmente il controllo positivo è

costituito da un plasmide contenente la sequenza bersaglio e sono sufficienti 100-1000 molecole per ottenere un segnale positivo dopo l'amplificazione.

• IL CONTROLLO NEGATIVO

Nell'allestimento di ogni reazione ènecessario aggiungere uno o piùcontrolli negativi, interposti fra i campioni.

_Nell'allestimento del controllo negativo vanno messi tutti i componenti della miscela di PCR tranne il DNA bersaglio. Oltre questi, può essere aggiunto un campione sicuramente negativo.

_Per controllare la specificità, può essere utile includere anche controlli contenenti sequenze di DNA che non corrispondono alla sequenza da amplificare.

INATTIVAZIONE DEL DNA AMPLIFICATO

Può avvenire a due livelli: durante l'allestimento di una nuova reazione (inattivazione pre-PCR) o al termine della reazione, prima della fase di rivelazione dei prodotti amplificati (post-PCR)

• INATTIVAZIONE pre-PCR

Una di queste strategie è basata sui sistemi di restrizione-modificazione e di taglio-riparo delle cellule. Per poter distinguere il DNA bersaglio da quello derivante da precedenti PCR, nella miscela di reazione la deossitimidinatrifosfato (dTTP) viene sostituita con la deossiuridinatrifosfato (dUTP) che viene incorporata nel DNA amplificato.

Nell'allestimento di una nuova reazione viene aggiunto l'enzima N-glicosilasi (UNG) che prima dei cicli di amplificazione catalizza la rottura del legame fosfodiesterico dell'uracile dal deossiribosio nel DNA contaminante( eventualmente presente) lasciando intatto il DNA nativo contenente dTTP.

• Il DNA risultante, privo degli uracili, èsuscettibile all'idrolisi in soluzione alcalina (Tampone) e alle alte t°.

Altri metodi di inattivazione pre-PCR

• Irradiazione della miscela di reazione con

raggi UV a bassa lunghezza d'onda (tra

254 e 300 nm per 20 min.)

• Digestione con DNAsi I o con enzimi di

restrizione che taglino all'interno del

frammento contaminante

Tuttavia tali sistemi hanno dei limiti:

• Non efficaci per quantità superiori a 10³

molecole

• La miscela di reazione non deve

contenere né la DNA polimerasi né il

campione.

INATTIVAZIONE POST-PCR• Inattivazione tramite modificazione

fotochimica del DNA dopo l'amplificazione:

la presenza nel filamento stampo di una base alterata, per via fotochimica, blocca l'estensione della Taq polimerasi. Alla miscela possono essere aggiunti reagenti in grado di rimanere stabili durante la PCR e poi, una volta foto-attivati, di formare degli “adducts” che impediscono al DNA di fare da stampo.

BIBLIOGRAFIA

1. Marin MG, ed. Diagnostica di laboratorio. Tecniche di

amplificazione genica: dal laboratorio alla pratica clinica.

Milano: Sorbona publ., 1999.

2. Verna R. La diagnostica di laboratorio con i metodi della

biologia molecolare. Padova: Piccin Editore, 1998.

3. DNA Learning Center Academy (sito internet).

4. Labinformatica (sito internet)

5. Istruzione operativa del laboratorio di biologia molecolare

dell' ospedale di Teramo.

GRAZIE PER L'ATTENZIONE!

Leggi e norme ISO applicabili ai laboratori di biologia molecolareRecepimento dec. Com. 2000/608/CE concernente le note orientative

per la valutazione del rischio di cui all.to III della Direttiva

90/219/CEE sull’impiego confinato di microrganismi geneticamente

modificati. - Decreto 25/09/2001

Integrazione Allegato II parte B Decreto lgs 206/2001 concernente

l’impiego confinato di microrganismi geneticamente modificati.-

Gazzetta Ufficiale 20/04/2006

Attuazione delle direttive 2004/9/CE e 2004/10/CE concernenti

l’ispezione e la verifica della buona pratica di laboratorio (BPL). -

Decreto Legislativo n.50 del 2/03/2007

Sistemi di Gestione per la Qualita’- Fondamenti e Terminologia UNI EN ISO 9000

Sistemi di Gestione per la Qualita’- Requisiti UNI EN ISO 9001

Sistemi di Gestione per la Qualita’-Linee guida per il miglioramento delle prestazioni UNI EN ISO 9004

Linee guida per gli audit dei sistemi di gestione per la qualita’ e/o di gestione ambientale UNI EN ISO 19011

Gestione per la Qualita’- Indicatori e quadri di Gestione per la Qualita’. Linee guida generali. - UNI 11097

Sistemi di Gestione per la Qualita’- Linee guida per la soddisfazione del cliente e per la misurazione degli indicatori del processo. - UNI 11098

Sistemi biologici per la prova della sterilizzazione e dei processi di sterilizzazione. Sistemi particolari per sterilizzatrici a calore umido. - UNI EN 866-3

Biotecnologie. Guida per la valutazione della purezza, dell’attivitàbiologica e della stabilità dei prodotti a base di microrganismi. -UNI EN 12689

• Biotecnologie. Laboratori di ricerca, sviluppo e analisi. Livelli di contenimento di laboratori microbiologici, aree di rischio, situazioni e requisiti fisici di sicurezza. - UNI EN 12128

• Requisiti generali per la competenza dei laboratori di prova e taratura UNI CEI EN ISO/IEC 17025

• Biotecnologie. Laboratori di ricerca, sviluppo e analisi. Linee guida per le operazione dei laboratori di biotecnologie. - UNI EN 12741

• Biotecnologie. Laboratori di ricerca, sviluppo e analisi. Linee guida per il trattamento, l’inattivazione ed il controllo dei rifiuti. - UNI EN 12740

• Biotecnologie. Attrezzature. Guida sulle procedure per il campionamento e l’inoculazione. - UNI EN 13092

• Biotecnologie. Criteri di prestazione per le prestazioni di sicurezza microbiologica. - UNI EN 12469

• Biotecnologie. Criteri di prestazione per gli elementi filtranti e per i filtri. - UNI EN 13091

• Biotecnologie. Attrezzature. Linee guida nelle procedure di prova per la tenuta. - UNI EN 12298

• Biotecnologie. Criteri di prestazione per recipienti. Dispositivi di protezione alla pressione. - UNI EN 13311-2