~ Patologia molecolare ~

Prof. Lollini, Nanni e GrilliIl corso sar composto da due corsi integrati: Oncologia genetica (cause e meccanismi generali della malattie ereditarie) e Oncologia.Esame orale durante il quale possibile verbalizzare il voto derivato dalla media con immunologia.

Programma/Contenuti - Pier-Luigi Lollini

LE ALTERAZIONI DEL GENOMA COME CAUSA DI MALATTIATipi e cause di mutazione e loro effetti patogenetici.

BASI MOLECOLARI DI MALATTIE CROMOSOMICHESindrome di Di George (CATCH). Le sindromi di Prader-Willi e Angelman e i meccanismi dell'imprinting parentale. Metilazione del promotore.

BASI MOLECOLARI DI MALATTIE CROMOSOMICHESindrome dell'X fragile, Corea di Huntignton e meccanismo di espansione delle triplette.

BASI MOLECOLARI DI MALATTIE MENDELIANEAlterazioni di proteine del citoscheletro: la sferocitosi ereditaria. Il gene DMD, ruolo della distrofina e distrofie muscolari di Duchenne e di Becker. Alterazioni di proteine della matrice extracellulare: le malattie del collagene (osteogenesi imperfetta, sindromi di Ehlers-Danlos) e della fibrillina (sindrome di Marfan).Alterazioni di proteine recettoriali: la ipercolesterolemia familiare. Struttura del recettore delle LDL e le diverse classi di mutazioni. Alterazioni di enzimi lisosomiali: i meccanismi di "sorting" degli enzimi lisosomiali e le tesaurismosi. Alterazioni dei canali ionici: la fibrosi cistica. Ruolo della proteina CFTR nel trasporto del cloro. Alterazioni di proteine di membrana della cellula nervosa. Malattie prioniche: ipotesi di Prusiner. Forme ereditarie della malattia di Alzheimer: ruolo della proteina APP e delle preseniline.

MECCANISMI GENERALI DI CONTROLLO E CONSERVAZIONE DELL'INTEGRIT GENOMICAMeccanismi di riparazione del danno genotossico: NER, BER, ricombinazione omologa e "mismatch repair". Il "network" di rilevazione del danno genotossico: il ruolo dei geni ATM e p53.

SINDROMI NEOPLASTICHE EREDITARIE (ALTERAZIONI GENI GATEKEEPER)Alterazioni di geni "gatekeeper". Il retinoblastoma: ipotesi di Knudson. Il cancro del colon ereditario poliposico: ruolo della proteina APC nel controllo del ciclo cellulare e nella mitosi. La von Hippel Lindau e i meccanismi di rilevazione dell'ipossia.

SINDROMI NEOPLASTICHE EREDITARIE (ALTERAZIONI GENI CARETAKER)Xeroderma pigmentosum, atassia telangectasia, forme ereditarie di cancro mammario, Li-Fraumeni, cancro ereditario del colon non poliposico.

lezione del 3 marzo 2011Il genoma umano

In generale tutte le malattie sono il risultato di una combinazione tra ambiente e del nostro genoma e ogni malattia ha proporzioni variabili di cause derivanti dall'uno o dall'altro. Nelle malattie ereditarie minore il contributo ambientale mentre nei tumori abbiamo una predominanza della componente ambientale.

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Il genoma umano organizzato in due distinti, uno grande nei cromosomi e uno piccolo mitocondriale. Si possono avere malattie con mutazioni che colpiscono uno dei due genomi, anche se i maggiori sono quelli che colpiscono quelle nucleari. Il genoma nucleare composta da 3300 Mb mentre il mitocondriale 16,6 Kb. Il DNA che codifica per proteine il 3% del totale; il 90% fatto di zone non codificanti, quindi del DNA fatto di genie e sequenze relate mentre il 75% formato da DNA extragenico e non ha un ruolo nella codifica delle proteine. Buona parte del DNA

ripetuto e le ripetizioni sono fonti di errori. Le sequenze ripetute possono appaiarsi in maniera errata. Il DNA extragenico presenta il 40% ripetitivo e il 60% di copia singola o basso numero di copie.

Il 10% del 25% (2,5%) codifica per proteine; il resto sono sequenze associate ai geni che svolgono o un ruolo regolatorio (promotori per esempio) e poi ci sono delle sequenze non codificanti che per possono dare luogo a patologie ereditarie (introni); infine troviamo gli pseudogeni che nel corso dell'evoluzione si sono danneggiati. Anche questi ultimi possono dare luogo a patologia.

Livelli di complessit del genoma Chimico: basi, legami e complementariet; Informazionale: sequenza di un gene; le basi

sono delle lettere e non pi delle strutture chimiche.

Strutturale: con formazione dei nucleosomi e della cromatina. I cromosomi possono essere considerati come organuli cellulari

Subcellulare.

Il cromosoma mitocondriale circolare. Il cariotipo la colorazione dei cromosomi e la loro messa in ordine mentre il cariogramma un disegno del cariotipo. Avere i cromosomi tondi (mitocondriali) o lineari differente quando parliamo per esempio di duplicazione; per esempio il cromosoma tondo non ha fine ed inizio; uno lineare ha delle estremit e gli enzimi che duplicano il DNA, l'ultimo pezzo del DNA (telomero) non replicabile e quindi non ha sequenze codificanti e sono oggetto di erosione nella progressione delle mitosi. Nelle cellule normali si accorciano. Il problema invece per le cellule staminali e per le cellule tumorali. In questi casi c' un enzima chiamato telomerasi che riallunga i telomeri. I cromosomi inoltre hanno un centromero che serve per tirare un cromosoma da una parte e uno dall'altro per evitare che vi siano problemi nella segregazione.

L'inizio della trascrizione non corrisponde all'inizio della proteina ma ci pu essere una regione chiamata 5' non traslata che precede il primo esone. Il gene non finisce con un codone di stop perch possono esserci delle regioni 3' non traslate.I geni umani sono 25000 + 37 mitocondriali; presente 1 gene ogni 40-50 Kb, circa 3000

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geni/cromosoma e circa 130 geni/banda. Le dimensioni in media sono 10-15 Kb e gli esoni sono in numero variabile da 1 a 80 con dimensione media di 2,5 bp. L'mRNA ha una dimensione media di 2,5 Kb che non tutto non codificante ma la dimensione codificante 1,5-1,8 Kb.

Il genoma un'entit dinamica che si modifica con l'evoluzione. Ci per comporta anche la possibilit che si sviluppino delle patologie a carico del genoma stesso.Vi sono molte varianti fisiologiche nel genoma:

Alleli varianti di un gene che possono essere presente in un soggetto; Wild-type: singolo allele; Polimorfismo: 2 o pi alleli, ciascuno > 1% nella popolazione (es. HLA); Varianti rare: < 1% nella popolazione che non danno nessuna malattia di per s ma possono

esporci a differenti malattie.Un tempo si parlava di polimorfismo in funzione del fenotipo ma oggi si afferma u polimorfismo come una variante i sequenza del DNA. Possono trovarsi anche in regioni non codificanti quindi non implicano necessariamente differenze di fenotipo ma solo di genotipo. Gli studi dei polimorfismi sono (utilizzabili anche contemporaneamente):

RFLP: Restricted Fragment Lenght Polymorphism. Se usiamo questi polimorfismi dobbiamo sapere che il concetto di allele applicato ai polmorfismi acquista differenti significati. Sono enzimi batterici che tagliano il nostro DNA in posizioni particolari. Qui posso avere 2 alleli (o l'enzima ha tagliato o non ha tagliato con 10000 loci che sono poche);

VNTR: Variable Number of Tandem Repeats. Varianti di lungghezza dovute a numero variabile di sequenze ripetute. Comporta un elevato polimorfismo.

SNP: Single nucleotide Polymorphism. Oggi dominano la ricerca biomedica in quanto si studiano le differenti varianti nucleotidiche in relazione alla patologia. Comprende tutti i RFLP. Ha un'ordine di grandezza >106.

In definitiva tutte le malattie hanno un substrato genico. Un singolo gene causa di una malattia mendeliana, geni multipli danno malattie complesse, i polimorfismi danno luogo a suscettibilit a malattie non genetiche. La farmacogenetica studia la suscettibilit agli effetti dei farmaci in relazione alla genetica.Le patologie mendeliane sono nel 90% dei casi pediatriche,

questa relazione hanno dato risultati contraddittori. La caffeina catabolizzata dal citocromo P4501A2, codificato dal gene polimorfico CYP1A2; chi ha questo allele lento hanno un aumento quasi del doppio del rischio di infarto del miocardio mentre non notiamo alcun cambiamento in chi ha l'enzima rapido.

Patologia molecolare 4 marzo LolliniDal gene alla proteinaUna mutazione qualsiasi alterazione del DNAI principali tipi di mutazioni sono: Sostituzioni di basi Inserzioni Delezioni

Dimensioni Geniche (Puntiformi, parti di geni) Cromosomiche (Parti di cromosomi) Genomiche (Interi cromosomi)

Sequenze interessate possono essere: Singola sequenza Scambi tra 2 o pi sequenze indipendenti

Le cause di queste mutazioni possono essere: Spontanee, casuali; Indotte da mutageni, cancerogeni.

Nomenclatura delle mutazioni (non c' mai 0 ma si parte da 1) Sostituzione: c.G1444>A Delezione: 1524-1527del Inserzione: c.1277-1278insTATC

La variabilit dinamica del DNA la base delle patologie ma anche dell'evoluzione. Avremo due classi di mutazione:

che colpiscono le cellule della linea germinale che sar ereditata dalla progenie. O (raramente) d un vantaggio evolutivo che viene ereditato. L'evento pi frequente di queste mutazioni l'aborto spontaneo. In alcuni la mutazione dannosa ma non letale e dar origine alla patologia ereditaria.

che colpiscono le cellule somatiche. Il vantaggio evolutivo si presenta con il cancro, con proliferazione incontrollata di una linea differenziativa. Qualche mutazione ha quindi dato un vantaggio evolutivo ad una cellula che diventata cancerogena. In altri casi si pu avere la morte cellulare. Se la patologia si manifesta presto si pu avere una patologia congenita.

Il DNA polimerasi si pu sbagliare e la fedelt della polimerasi incompleta: Una persona adulta formata da 1014 cellule Occorrono 1016-1017 divisioni cellulari (includendo embriogenesi e ricambio cellulare) Genoma umano = 3x109 paia di basi Ogni replicazione del DNA richiede lincorporazione di 6x109 nuove basi 6x109x1016=6x1025 nuove basi nellintera vita Fedelt delle DNA polimerasi: 1 errore ogni 10 9 -10 11 basi incorporate Quindi ogni persona nella sua vita accumula pi di mille miliardi di mutazioni

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Quindi le mutazioni sono fenomeni spontanei che originano fin dalla replicazione cellulare.La replicazione cellulare comporta rischio di mutazione ed il numero di mutazioni maggiore dove si ha maggiore replicazione. Nelle malattie genetiche le mutazioni de novo sono pi frequentemente di origine maschile. Nelle mutazioni de novo nel retinoblastoma l'88% deriva dal padre (ci connesso anche all'et del padre al momento del concepimento) mentre solo il 12% dalla madre.Zigote Gamete ~30 divisioni cellulariZigote Gamete 30-900 divisioni a seconda dellet

Le mutazioni hanno quindi sia a mutageni esogeni (radiazioni ionizzanti, radiazioni eccitanti, farmaci, cancerogeni chimici che possono essere ridotti nell'ambiente) che endogeni che danno dentro di noi gi delle mutazioni (Elementi trasponibili, Differenziamento dei linfociti T e B (nel quali c' il riarrangiamento del TCR e del recettore delle Ig e quando le cose vanno storte arriva un gene che causa il cancro), Prodotti del metabolismo cellulare, Infiammazione (i fagociti producono intermedi reattivi dell'ossigeno che sono a loro volta mutageni)).

Molte mutazioni non hanno conseguenze a livello di proteina perch abbiamo visto che la parte che codifica per le proteine molto piccola e la maggior parte delle mutazioni cadono in zone non codificanti (97%). In generale questo attenua l'effetto di tutto il carico mutazionale. Poi dato che il codice genetico degenerato si possono manifestare delle mutazioni silenti.

Mutazioni in DNA codificanteSinonima (silente) = stesso aminoacido in quanto il DNA degenerato (pi triplette

corrispondono allo stesso AA);Nonsenso = codone stop. La gravit delle conseguenze dipendono dalla zona che viene troncata,

se alla fine o all'inizio della regione codificante.Di senso (missense)

conservativa = aminoacido funzionalmente simile, per esempio un amminoacido lipofilo transmembrana lipofilo che pu diventare un altro lipofilo senza grosse differenze funzionali.

non conservativa = aminoacido funzionalmente diverso, per esempio un amminoacido lipofilo transmembrana lipofilo che pu diventare un non lipofilo con grosse differenze funzionali. In molti casi questa alterazione pu essere patologica.

Alcune mutazioni di una zona non codificante possono alterare una proteina. Possono esserci alterazioni nel promotore o nell'enhancer del gene pu essere modificata la trascrizione delle alterazioni della trascrizione. Possono esserci delle mutazioni del sito di splicing e quindi lo splicing pu non essere corretto. Le zone di confine della zona di splicing sono dette SO (Splice Omor) e SA (splice Acceptor); pu verificarsi una ritenzione di introni (perch gli enzimi credono che l'introne sia un pezzo di esone) oppure emissione di esoni (si salta un esone e spesso la proteina non funziona). Altre volte all'interno dell'introne ci pu essere la formazione di un sito nuovo, definito sito criptico di di splicing.

Lo spettro mutazionale ci fa vedere tutte le possibili mutazioni. Nella beta globina abbiamo tre regioni rosse codificanti. La forma clinica pu essere causata da una di tutte le mutazioni indicate. Ogni barra rappresenta un allele patologico della beta globina. Ci sono differenti manifestazioni cliniche a seconda dell'allele mutato ereditato.

Inserzioni, delezioni, inversioni Dimensioni variabili da 1 base a parti di cromosoma (>1 Mb).

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Spesso si verificano in sequenze dove sono presenti ripetizioni. Le sequenze ripetute sono rischiose perch le ripetizioni possono dare luogo a perdita o acquisto di moduli di triplette.

Le sequenze ripetitive implicano il rischio di appaiamenti disallineati nel corso della replicazione del DNA e del crossing over.

Le short tandem repeats, le piccole ripetizioni, possono dare luogo anch'esse a mutazioni.Anche le ripetizioni invertite e l'accoppiamento di sequenze omologhe possono causare delle delezioni. Si possono appaiare delle sequenze che in realt non sono omologhe e le sequenze si appaiono in maniera rovesciata con conseguente inversione cromosomica. Si possono quindi formare degli appaiamenti errati anche con le sequenze in tandem mentre si ha la meiosi e si pu avere l'inserzione da una parte e l'omissione dall'altra.

Leffetto patogeno di piccole inserzioni e delezioni dipende dal mantenimento o meno del modulo di lettura

Perdita/acquisto di 1 o 2 basi altera il modulo di lettura e spesso causa la produzione di una proteina molto alterata o troncata;

Perdita/acquisto di triplette o multipli di tre (mutazione frameshift) basi comporta la perdita/acquisto di 1 o pochi aminoacidi e mantenimento della sequenza aminoacidica a valle; ci comporta la formazione di una proteina con parziale mantenimento della funzione (delezioni di 1,2,4 nucleotidi sono pi gravi di una delezione di 3 nucleotidi).

Nel nostro corredo di proteine ce ne sono alcune codificate in quantit abbondante, maggiore di quella necessaria per espletare la funzione. Ci dipende dalla funzione che deve espletare la molecola; per esempio gli enzimi sono maggiori quindi se viene a mancare un enzima spesso la sua attivit compiuta da una altro enzima. In alcuni casi si ha una delezione del 90% di un enzima ma non vi una espressione fenotipica, mentre la mancanza del 50% di proteine costitutive d gi luogo a patologie molto gravi. Nei sistemi biologici, soprattutto negli organismi superiori, il livello di funzione normale comprende un ampio margine di sicurezza. Quindi si assiste alla ridondanza del prodotto enzimatico.Vi possono essere delle patologie legate all'espansione delle triplette nucleotidiche; il segmento ripetuto n volte a causa di problemi enzimatici vi possono essere inserzioni e delezioni. Queste danno delle patologie da triplette ripetute. In tutte queste famiglie affette dalla patologia questa malattia inizia con una maggiore ripetizione delle triplette. All'inizio non vi un quadro patologico ma uno stato di pre-mutazione (le triplette aumentano ma non manifestano la malattia). I loro discendenti possono presentare un forte aumento del numero di ripetizioni e manifestazione della malattia. Nelle generazioni successive si pu avere ulteriore aumento del numero di ripetizioni e manifestazioni patologiche in et sempre pi precoce (anticipo). L'anticipazione la manifestazione man mano pi precoce nelle generazioni successive.Le quattro principali patologie da triplette ripetute sono la corea di Huntington, la sindrome dell'X fragile, l'atassia di Friedreich e la distrofia miotonica. In tutte queste la tripletta che si amplifica localizzata in parti differenti del gene. Nella corea di Huntington si espande CAG (glutammina) contenuta in un esone che aumenta la glutammina nella proteina che smette di funzionare.

Nelle altre tre patologie sono in sequenze non codificanti: CGG nell'UTR nella sindrome dell'X fragile, CTG nella distrofia

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miotonica; in questi casi viene alterata una parte non codificante che inficia anche la codifica del gene stesso.La corea di H. una correlazione genotipo-fenotipo in funzione al numero di ripetizioni presenti; maggiore il numero delle ripetizioni maggiore sar l'anticipazione della patologia.

Sindrome dellX fragile una ripetizione a carico del cromosoma X. I siti fragili sono regioni cromosomiche visibili al microscopio in cui il DNA non normalmente impaccato per la mitosi o si prematuramente despiralizzato e in quella zona di cromatina rarefatta causata da una rande ripetizione di nucleotidi in quella zona. Il gene si chiama FMR1 e si vede anche nel cariotipo. I siti fragili non sono necessariamente associati a rotture cromosomiche. In questa malattia la componente genetica particolarmente predominante da definire il quadro clinico del paziente che sar lo stesso in tutti i soggetti affetti quale sia l'etnia di appartenenza.

Sindromi da geni contigui - microdelezioniDelezioni (o duplicazioni) di tratti cromosomici che contengono geni multipli. Il quadro patologico pu essere dovuto ad uno solo dei geni coinvolti oppure agli effetti combinati di pi geni.La patologia legata alle ripetizioni, Low-Copy Repeats (LCR); Blocchi di 1-200 Kb duplicati con alta omologia (>95%) nel genoma. Origine filogenetica recente: assenti in specie evolutivamente vicine. Sono delle famiglie di 1,5 Mb e ci pu essere una delezione da 1,5 Mb o da 3 Mb.I disordini cromosomici in 22q11 possono presentare delle delezioni (VCFS/DGS) oppure delle duplicazioni. La prevalenza delle patologie genetiche sono definite con naffetti/totale nati.

Sindrome di DiGeorge / velocardiofacialeDelezione in 22q11~1/4000 nati = media frequenzaCasi sporadici (90%) e familiari (10%) autosomici dominantiEspressivit variabileAlterazioni facciali: Insufficienza velofaringea, palatoschisiIpoplasia/aplasia timica immunodeficienzaIpoplasia paratiroidi ipocalcemiaMalformazioni cardiache, soprattutto del tratto efferenteDisordini psichiatriciSono colpiti tutti questi organi perch sono colpiti i tessuti embrionali.Sinonimi / sovrapposizioni: Sindrome di Sphrintzen, Sindrome di Takao, CATCH22, CATCH (Cardiac Abnormality, T cell deficit, Clefting, Hypocalcemia)

Una nuova strategia per le sindromi umane da geni contiguiIndividuare regioni nel genoma del topo che conservano la sintenia (=la propriet dei geni di trovarsi sullo stesso cromosoma)Produrre topi con delezioni della regione sintetica Hanno quadro patologico corrispondente alla sindrome umana?

Partendo dai topi con delezione produrre transgenici per gruppi di geni umani o muriniche mappano nella delezione Il quadro patologico scompare?

Una volta individuati i geni candidati produrre topi con knockout (assenza) di singoli geni Hanno quadro patologico? Si nel topo c' una stessa sequenza genica e producendo un topo con quella delezione posso valutare se il topo porta quelle mutazioni somatiche. Nel topo quella mutazione somatica (assenza di timo) corrisponde alla mutazione di un singolo gene chiamato Tbx1.

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Ma nell'uomo? Geni candidati per la sindrome di DiGeorge/velocardiofaciale: TBX1

T-box1, fattore trascrizionale Mappa nella delezione 1.5 Mb Topi KO hanno fenotipo Altamente espresso negli archi faringei embrionali Non espresso nel cervello

CRKL Tirosina chinasi non recettoriale Compreso nella delezione di 3 Mb, esterno alla 1.5 Mb Topi KO (Knokout) hanno fenotipo Pu spiegare casi con delezioni distali alla 1.5 Mb

Geni modificatori (espressivit variabile), sono tutti quei geni che non causano direttamente il fenotipo ma definiscono la gravit del sintomo:

RALDH2 Sintesi acido retinoico VEGF Vascular endothelial growth factor che controlla la neoformazione di vasi.

Patologia molecolare 10 marzo 2011 LolliniMalattie ereditarie epigenetiche (atipiche)

L'esclusione allelica l'espressione di uno solo dei due alleli con regolazione del dosaggio genico.Il meccanismo indipendente dal genitore di origine nel caso dell'inattivazione dell'X (lyonizzazione), recettori per l'antigene TCR ed Ig ed infine con meccanismi ignoti (recettori olfattivi, IL 2 e 4) e queste non si studiano molto. Dipende invece dal genitore d'origine l'imprinting genomico. Normalmente due parti di cromosomi che contengono 4 geni (A,B,C,D) ed abbiamo il gene materno e paterno (Ap, Bp, Cp, Dp e Am, Bm, Cm, Dm); pu accadere che sia imprintato (quindi non espresso) in maniera casuale o il gene materno o quello paterno. Se non espresso l'allele materno si ha imprinting materno e viceversa. Questo meccanismo d la met della totalit dei geni e quindi necessita di regolazione. Questo spegnimento dell'allele non ha nulla a che vedere con il gene. Non la possiamo chiamare mutazione ma un fenomeno epigenetico in cui uno dei due alleli di un gene viene silenziato ed sempre quello dello stesso genitore di origine. Si passa da una generazione all'altra (da maschio a maschio e da femmina a femmina) perch nelle cellule germinali viene tutto imprintato e poi riscritto (nel maschio si cancella tutto l'imprinting, sia materno che paterno, e poi viene tutto riscritto in base al sesso dell'individuo).L'imprinting richiede un centro di imprinting del DNA ed attivit enzimatica di metilazione (metiltransferasi) del DNA. Si pensa che l'imprinting sia il maggiore ostacolo alla partenogenesi nei mammiferi e che costringe quindi tutta la riproduzione sia sessuata.Nel nostro genoma il fenomeno dell'imprinting non ubiquitario ma comune. Le maggiori patologie riguardano il cromosoma 11 e il cromosoma 15.

Imprinting e patologiaQuesto meccanismo serve per mantenere il dosaggio genico al 50%. questo ci espone a un pericolo perch abbiamo solo un allele ed uno dei meccnismi di patologia che vi sia una mutazione nell'allele espresso. Ma pu accadere anche il fatto opposto, ovvero che ci sia la perdita di imprinting (loss of imprinting) con espressione del doppio del dosaggio genico.Avvengono, nelle forme pi semplici, delle delezioni (nel caso di delezione dell'allele espresso).La disomia uniparentale (UPD) quando si verifica una delezione con imprinting sia materno che paterno; l'ipotesi di questa che vi sia una sequenza con una delezione e un tentativo di copiare quella delezione con il materiale genetico rimasto. Quindi la sequenza intatta ma vi sar un

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imprinting del gene ricostruito e a livello somatico sar completamente assente l'espressione della proteina.

Imprinting nei cromosomi 11 e 15Le patologie da imprinting del cromosoma 15 q11-13 sono la sindrome di Prader-Willi e Angelman. Prader-Willi: passa statura, obesit, ipogonadismo, mani e piedi piccoli e ritardo mentale.Angelman: bassa statura, ritardo mentale grave, convulsioni, postura atipica e facilit di riso.

Queste due patologie mappano sullo stesso punto sul quale sembrava che ci fosse un'alterazione che causava due patologie differenti. Avveniva ci a seconda dell'imprinting materno o paterno. La delezione del cromosoma materno dar origine alla sindrome di Angelman mentre la delezione del cromosoma paterno dar luogo a sindrome di Prader-Willi.

Prader Willi AngelmanDelezione 15q11-q13 70% paterna 70% maternaDisomia uniparentale 30% materna 3-5% paternaMutazione E6-AP (mutazioni epigenetiche ubiquitina-proteina ligasi)

No 2-4% solo casi famigliari

Mutazione del centro di imprinting 1-2% 7-9%Altre - 10-20%

Quindi una mutazione puntiforme mi d lo stesso quadro della delezione: quindi il gene della mutazione puntiforme il gene della patologia.

Alterazioni dell'imprinting in 11p15.5 - Beckwith-WiedemannSul cromosoma 11 nella zona 11p15.5 presente l'IGF2 (insulin grow factor 2); sul cromosoma 15 stato mappato al centro un centro di imprinting e ci sono una serie di sequenze con annesso UBE3A. La sindrome di Beckwith-Wiedemann presenta macrosomia, macroglossia, ipoglicemia e sviluppo di tumori muscoloscheletrici (rabdomiosarcomi). Vi sono differenti geni imprintati e i principali candidati sono IGF2 e H19. La perdita di imprinting (Lol) somatica o famigliare pu essere presente anche in altri tumori: Rabdomiosarcoma, tumore di Wilms (nefroblastoma) e carcinoma del colon. Il problema sta nell'iperproduzione del fattore di crescita IGF2 che pu dare origine alla malattia.

Le malattie mendelianeLe malattie mendeliane interessano la mutazione di un singolo gene.L'eredit mendeliana pu essere:

Autosomica Dominante Recessiva

Legata allX Dominante

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Recessiva

Il fenotipo (e non il genotipo) dominante o recessivo.Si parla per spesso (impropriamente) di dominante o recessivo anche in riferimento a geni od alleli. Se il fenotipo si esprime nell'eterozigote dominante mentre recessivo se non si esprime in questo. L'allele normale d luogo alla proteina funzionante mentre l'allele mutato pu dare luogo ad una proteina non funzionante o assenza di proteina.Il soggetto con i due alleli normali presenta un fenotipo normale (100% della proteina funzionante), il recessivo ha lo 0% della proteina funzionante mentre nell'eterozigote posso avere un quadro dominante o recessivo a secondo della quantit codificata dal gene mutato. Dato che viene codificato il 50% della proteina si deve vedere se questa quantit sufficiente (patologia autosomica recessiva) o no (dominante).

Il meccanismo che si applica a tutte le patologie recessive che il 50% delle proteine sufficiente in queste patologie e quindi si manifesta solo se manca totalmente l'enzima. Quindi i nostri enzimi sono codificati in quantit ridondante e le cellule ne contengono il doppio della quantit necessaria quasi tutte le enzimopatie sono recessive.

Le cose sono pi complesse per la dominanza (sapere bene questa parte perch pare che al prof interessi):

Dominante aploinsufficiente: il 50% di proteina funzionante non sufficiente a garantire il funzionamento della cellula (es patologie recettoriali o patologie proteiche strutturali, recettori);

Dominante negativo: la proteina funzionale un polimero e se una delle due proteine che codificano per questa proteina anomala, quando si uniscono pu accadere che non funzioni il tutto. Quindi dominante negativo nel senso che la proteina alterata (50%) mi va a inficiare anche la restante parte della proteina (es: proteina multimerica);

Dominante gain-of-function: ovvero guadagno di funzione. Un esempio gi incontrato quello delle Corea di Huntington con ripetizione poliglutamminica. Questo meccanismo di patogenesi proprio la gain of function in quanto la proteina (huntingtina) perde la sua funzione e ne acquisisce un'altra (ovvero la neurotossicit). Molti oncogeni seguono questa via.

Dominanza e recessivit non sono concetti assoluti, ma relativi al fenotipo esaminato; un esempio classico quello dell'anemia falciforme.

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Lespressione codominante: Il fenotipo eritrocitario dominante = espresso sia dalleterozigote che dallomozigote; Lanemia recessiva incompleta = espressione e gravit diverse nelleterozigote rispetto

allomozigote; La patologia recessiva = espressa solo dallomozigote.

Quindi il genotipo sempre lo stesso (non dominante o recessivo) ed alcuni fenotipi sono dominanti o recessivi.

Tumori ereditari retinoblastoma (RB) una patologia dominanteLinea germinale: RbLinea somatica: RbTumore: RbDue mutazioni: una ereditaria (primo hit), laltra solo nelle cellule tumorali (secondo hit). La malattia insorge quando il genotipo -/- e sono quindi le due mutazioni; i soggetti sono a rischio di contrarre il tumore ma deve avvenire anche la seconda mutazione. Fenotipo predisposizione al tumore dominante: espresso dalleterozigoteFenotipo tumore recessivo: espresso solo nelle cellule omozigoti Rb una forma di mosaicismo. Questo quadro si applica a quasi tutti i modelli ereditari con modello a doppio hit, uno somatico e uno genetico.

Penetranza la probabilit di espressione fenotipica con un dato genotipo. Pu essere:

Completa (100%): tutti i portatori del genotipo manifestano il fenotipo;

Incompleta (

Per esempio la neurofibromatosi di tipo I presenta differenti quadri clinici. L'espressivit variabile determinata dal fatto che tutti gli individui che hanno la stessa mutazione nel singolo gene avranno alleli differenti con annessi geni modificatori che possono quindi modificare il fenotipo. Questo il background genico. Il background genico ha un ruolo importantenel determinare il fenotipo . In realt le malattie mendeliane pure, dovute esclusivamente ad un solo gene, sono rare. I geni modificatori alterano la penetranza e l'espressivit.Nella poliposi adenomatosa (si creano dei polipi nell'instestino) vi sono dei geni che codificano per il numero dei polipi espressi dal fenotipo.

Patologia molecolare 11 marzo 2011Malattie autosomiche recessive

Solitamente casi isolati nel pedigree. I genitori di un affetto sono eterozigoti sani, il rischio di altri figli affetti 14. In genere la probabilit di malattia uguale in maschi e femmine.I genitori possono essere consanguinei o appartenere ad un gruppo (etnico, religioso, geografico) in cui si ha inbreeding. La forte consanguineit la troviamo in gruppi isolati (per motivi culturali o geografici) o in gruppi i cui matrimoni sono limitati (per motivazioni prettamente culturali).Inbreeding (inincrocio) comprende tutti i fenomeni di incroci tra consanguinei e i matrimoni tra non consanguinei in senso stretto ma tra soggetti che derivano dal medesimo gruppo etnico.Incroci tra consanguinei Inbreeding = incroci tra individui non imparentati, ma geneticamente correlati. Si verifica tipicamente in gruppi geneticamente isolati: minoranze etniche e religiose, abitanti di isole. Consanguineit ed inbreeding aumentano il rischio di malattie recessive.

Malattie autosomiche dominantiPenetranza incompleta ed espressivit variabile ci sono anche nelle malattie recessive. Circa la met delle malattie mendeliane sono autosomiche dominanti (~3000 patologie). Hanno frequenza globale elevata (~10-2). Variabilit di manifestazioni fenotipiche per ridotta penetranza, espressivit variabile, effetti pleiotropici (N.B.: non limitate a malattie dominanti).Pedigree tipico con ascendenti affetti in ogni generazione (). La presenza di trasmissione da padre a figlio differenzia autosomiche da X-linked. Rischio per figli di un affetto: 12 (segue la legge di Mendel).La mancanza di ascendenti e collaterali affetti suggerisce mutazioni de novo. Verosimilmente nei gameti di due coniugi, in uno dei due, si verificata una mutazione dominante che stata espressa dal primo figlio. Molte di queste malattie hanno una fitness limitata e i soggetti non si riproducono. La malattia non si estingue perch le mutazioni de novo sono spesso presenti nella popolazione. I fatti che favoriscono queste mutazioni de novo sono l'aumentare dell'et dei genitori (popolazioni

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occidentali)

Malattie legate allX (X-linked)La distinzione tra dominante e recessivo sfumata perch:

Il maschio ha un solo cromosoma X ( emizigote) Nella femmina molti geni di uno dei due X sono inattivati (spesso inattivata l'X con la

mutazione)La maggior parte delle malattie legate allX sono espresse solo dalle portatrici di due alleli mutati (recessive), in grado variabile a seconda dellinattivazione dellX nei vari tessuti.Una piccolo numero di malattie espresso dalle portatrici di un allele mutato ed uno normale (dominanti) e possono o non possono manifestare il quadro patologico per la lyonizzazione.La patologia molto pi frequente tra i maschi che tra le femmine.Non c trasmissione da padre affetto a figlio affetto e le madri portatrici obbligate trasmettono ai figli. Raramente si incontrano nei pedigree femmine affette omozigoti, ad esempio per incroci tra consanguinei. A livello embrionale si verificher l'inattivazione quando ci saranno gi un centinaio di cellule (per questa motivazione le donne sono

dei mosaici). Avremo cellule che esprimeranno preferenzialmente uno o l'altro corredo.La distrofia muscolare di Deuchenne e di Beker legato all'X. La distrofina sta sotto la membrana plasmatica e ogni fibra ha un modulo in cui sono riportate in bianco le molecole di distrofina. Notare che nella donna manifesto il mosaicismo (alcune fibre bianche e altre nere). I muscoli pi critici per la distrofia sono i muscoli respiratori. Alcune donne svilupperanno un'inattivazione dell'X con molte fibre funzionanti, altre donne esprimeranno anche a livello fenotipico la distrofia.Pedigree tipo autosomiche dominanti, ma non

c mai trasmissione da padre affetto a figlio maschio. In alcune malattie (ad es. incontinentia pigmenti tipo 2) non si trovano mai maschi affetti in quanto la malattia letale per il maschio e si ha un aborto spontaneo.

Patologia Generale Molecolare

Cause delle malattie: EtiologiaMeccanismi di malattia: Patogenesi

Principali tipi di proteine alterate nelle malattie mendeliane: Proteine strutturali, sia intra che extracellulari (collagene per esempio); Recettori (che trasducono segnali) e sistemi di trasporto; Enzimi e loro inibitori; Proteine che controllano la crescita cellulare (geni oncosoppressori ed oncogeni).

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Patologie da difetti di proteine strutturali

Sferocitosi ereditaria una anemia emolitica. I globuli rossi possono flettersi grazie a proteine: spectrina, anchinia che collega il citoscheletro all'actina). Queste proteine servono a garandire l'elasticit e la resistenza del

globulo rosso che incontra nel circolo. In questa malattia si manifesta microcitemia e sfereocitosi (perch i globuli diventano pi piccoli, meno deformabili e tondi) ed essendo meno deformabili vengono visti come vecchi dalla milza; per questo un'anemia emolitica. La distruzione avviene quando l'eritrocita deve attraversare la milza dove i globuli bianchi diventano molto grandi e pieni di globuli rossi. Prevalenza 1/5000; tutti geni autosomici.In questa malattia abbiamo una forte eterogeneit delle

proteine coinvolte: l'ereditariet quindi differente da un caso all'altro.Nell'Anchirina 1 viene a mancare la proteina e ci possono essere delle mutazioni frameshift e non senso in cui la proteina manca completamente; in questi caso abbiamo aploinsufficienza e ho la manifestazione patologica. Negli altri casi in cui ho la proteina funzionante la mancanza di un solo allele non sufficiente per darmi la patologia perch mi rimane il 70-75% della funzione e quindi la classifico come recessiva. In queste malattie devo analizzare il genoma perch se vado a valutare la presenza delle proteine, la mancata funzione di una proteina pu implicare il mancato funzionamento di altre proteine che dato che non funzionano vengono degradate. Quindi se vado a vedere le proteine potrei trovarmi senza una serie di proteine che invece sono correttamente codificate.La spettrina costituita da una sub-unit alfa e beta; in casi fisiologici si produce il doppio di subunit alfa rispetto beta; il deficit di alfa spettrina quindi recessiva mentre le beta sono dominanti (vedi tabella sopra).La spettrina forma una rete sotto la superficie della membrana. Le spettrine fanno parte della superfamiglia spettrina-distrofina-alfa-actinina con annessa la distrofina.

L'anemia data dalla sfereocitosi pu essere compensata da iperproduzione di EPO e il quadro non particolarmente grave. Presenta scarsa riserva funzionale, e possibili crisi aplastiche secondarie ad infezioni da parvovirus. La splenomegalia trattabile con splenectomia (ma aumento di rischio di infezioni). Anche il fegato pu ingrandirsi: se si ha epato-splenomegalia bisgona pensare all'attivit comune dei due organi e saranno responsabili i macrofgi (cellule di kupfer nel fegato).Possibile ittero da eccessiva produzione di bilirubina legata all'emolisi. La gravit dipende dalla mutazione presente all'interno delle famiglie in analisi ed simile tra

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membri della stessa famiglia.

Complesso distrofina-glicoproteine (DGC) Distrofie muscolari

Fungono da collegamento tra citoscheletro e matrice.Stabilizzazione della membrana durante i cicli contrazione- rilassamento. Una cellula che si contrae esercita sulla membrana uno stress e la membrana deve essere in grado di sopportare questa tensione. Uno qualsiasi di queste proteine pu dare luogo a distrofinopatie. La distrofina una molecola molto lunga e gli ovali sono una serie di domini codificati da alcuni geni. Possiamo quindi avere forme pi o meno gravi a seconda che le mutazioni interessino uno o pi di questi domini.Le distrofie muscolari sono causate da mutazioni in geni che codificano componenti del complesso distrofina-glicoproteine

Indebolimento del sarcolemma Rottura della membrana Morte della fibra muscolare Degenerazione muscolare progressiva, debolezza muscolare, insufficienza respiratoria e

cardiaca

Vi sono delle cellule periferiche muscolari che possono riparare un danno. Vi sono degli elementi mesenchimali non differenziati che possono differenziarsi in fibroblasto-adipocita-cellula muscolare. Quando ho un danno della cellula muscolare le cellule satelliti tentano di rigenerare ma il danno meccanico tale che le cellule satelliti non sno sufficientemente veloci. Anche le cellule mesenchimali iniziano ad intervenire e il danno progressivo si manifesta con l'uso del muscolo; inizialmente la deambulazione normale e poi regredisce. Letale l'espressione della distrofia sul diaframma e la morte avviene per problemi respiratori e cardiaci.Il gene che codifica per questa patologia molto grande: distrofina, 79 esoni su 2.5 Mb (trascritto: 14 Kb).Ereditariet legata allX

Maschi: affetti in modo grave Femmine: grado variabile a seconda dellinattivazione del X nei muscoli

Eterogeneit allelica (all'interno della patologia ci sono alleli patologici di gravit diversa, talmente differente che prima di conoscere la genetica molecolare erano indicate con due nomi differenti, Beker e Deuchenne):

Distrofia muscolare di Duchenne (DMD) Delezioni che impediscono sintesi proteica Quadro clinico grave, insorgenza precoce

Distrofia muscolare di Becker (BMD) Sintesi di proteina con funzionalit residua Quadro clinico meno grave di DMD, insorgenza pi tardiva e aspettativa di vita quasi

normale.

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Sindrome di MarfanPatologia autosomica dominanteIl gene coinvolto quello della fibrillina 1 (FBN1) (FBN2 aracnodattilia contratturale congenita) che codifica per le microfibrille, precede (probabilmente con funzione di guida) la tropoelastina nella formazione delle fibre elastiche.L'espressivit di questa patologia variabile. I tessuti elastici sono infatti presenti:

Legamenti del cristallino: ectopia lentis, con cristallino fuori posto

Cuore: prolasso valvola mitrale Aorta: dilatazione e rottura dellaorta Scheletro: alta statura, dita

affusolate, legamenti lassi ed iperestensibili, scoliosi.

Normalmente il Ca come quello nell'immagine A mentre nella mutazione di Marfan si assiste alle mutazioni dei domini che legano il Ca, illustrato in figura B.

Espressivit variabile presente una forte eterogeneit delle forme; tutte le volte che ci sono gravit patologiche cardiovascolari la morte precoce. L'espressivit molto differente tra gli individui analizzati.

18 marzo 2011, Prof. Lollini

Riguardo i difetti di proteine strutturali parliamo oggi dei difetti delle fibre collagene trattando alcune delle tante patologie ereditarie che lo riguardano. Dobbiamo tenere presente che per motivazioni storiche le alterazioni del collagene si distinguono in due gruppi: le alterazioni del collagene 1 vanno sotto il gruppo di osteogenesi imperfecta mentre le altre vanno sotto il nome di sindromi di Ehlers-Danlos.

Osteogenesis imperfecta (esempio di patologia dominante-negativo nelle mutazioni di senso)Ci serve per illustrare un problema sui meccanismi di dominanza. Le alterazioni di proteine strutturali sono prevalentemente dominanti perch le nostre cellule contengono una quantit minima di elementi strutturali quindi anche una alterazione del 50% delle proteine inficia di molto l'attivit strutturale in genere. Vi sono malattie dominanti per aploinsufficienza e altre patologie nelle quali abbiamo i dominanti negativi. Le patologie con dominanti negativi sono tutti quei casi nei quali una proteina polimerica codificata in maniera uguale da due alleli. Se un allele alterato finisce che

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tutto il polimero (dato dalla somma delle due proteine codificate dai due alleli) alterato e quindi non funziona bene. L'osteogenesi imperfetta un esempio di questa tipologia di alterazione.Il collagene un trimero formata da due subunit di collagene 1 (formato da due catene 1 e una catena di 2) ed una subunit di collagene 2. Il collagene 1 fondamentale per la formazione dell'osso. Non importa qual il gene alterato ma la mutazione pu determinare dei quadri rapidamente differenti e si pu avere dominanza negativa o aploisufficienza. una patologia autosomica dominante.Mutazioni in COL1A1 o COL1A2, catene 1 e 2 del collagene tipo I: [1]2 2.Le mutazioni nonsenso in COL1A1 causa Osteogenesis imperfecta tipo I che comporta una riduzione del 50% del collagene tipo I. Ci comporta ossa fragili, sordit ed il quadro patologico non grave. Le cose cambiano radicalmente se ho mutazioni di senso in COL1A1 o COL1A2. Queste mi danno l'osteogenesis imperfecta tipi II, III, IV. Dominante negativo - degradazione delle molecole di collagene contenenti catene anomale e non c' la proteina. Il 50% di riduzione del collagene con collagene funzionante tendente a 0 e il fenotipo decisamente pi grave. Fratture ossee alla nascita, in molti casi morte neonatale o sviluppo osseo e dentale deformi. Vi quindi una grande differenza tra un meccanismo di aploinsufficienza e di dominante negativo dettato dal fatto che la mutazione in alcuni casi (clinicamente meno gravi) porta un codone di stop mentre in altri casi con la mutazione pi lieve porta ad una forma clinica pi grave.

Sindromi di Ehlers-DanlosCome possibile vedere dall'immagine si ha iperestensibilit della cute.Ci dovuto al fatto che manca la riparazione del collagene che nei soggetti normali avviene in continuazione.Vi sono una decina di sindromi diverse:

Tipo I GravisAutosomica dominante,Gene COL5A, interessa il collagene V con cute iperestensibile, articolazioni ipermobili, cicatrizzazione cutanea alterata.

Tipo IV ArteriosoAutosomica dominante. Anche in questo caso pu essere una quadro clinico grave perch il gene COL3A1 che codifica per il collagene III che molto importante a livello cutaneo (la cute appare sottile e facilmente danneggiata) mentre ben pi gravi sono le rotture delle pareti arteriose ed intestinali.

Tipo VI OculareAbbiamo detto che tendenzialmente le patologie che riguardano le proteine strutturali sono dominanti, non tutte, ma solitamente molte lo sono. Anche quelle che abbiamo descritto finora lo sono. Quella di tipo sesto per non lo . infatti autosomica recessiva perch colpito un enzima.Gene PLOD codifica per l'enzima lisina idrossilasi (legami crociati tra fibre collagene) che stabilisce i legami crociati che stabilizza il collagene. Comporta fragilit oculare (distacco retina, rottura cornea) e cutanea.

Patologie Enzimatiche o enzimopatieSono migliaia proprio perch sono migliaia gli enzimi.I meccanismi generali che coinvolgono tutte queste patologie sono:

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Solitamente recessive perch deficit enzimatici del 50% non sono patogeni; ci accade perch gli enzimi sono sintetizzati solitamente molto (come quantit) e quindi la parte di enzima che viene sintetizzata negli eterozigoti lavora un po' di pi ma lavora. La mancanza dell'enzima non causa il danno ma la patogenesi non provocato dalla molecola proteica ma dalla sua mancata attivit quindi il danno sar dato dall'accumulo del substrato dell'enzima o deficit del prodotto enzimatico.I substrati/prodotti piccoli o diffusibili causano la malattia sistemica perch i substrati vanno in circolo e intossica tutto l'organismo. Se abbiamo delle macromolecole avremo delle malattie limitate ad un organo o distretto.Abbiamo perdita di attivit enzimatiche multiple e possono essere presenti mutazioni differenti che hanno una stessa manifestazione clinica. Abbiamo il massimo del distacco tra eziologia (sempre causata dalla mutazione di un gene che codifica per una proteina) e patogenesi (data da molecole non proteiche, ovvero substrati e prodotti enzimatici) che non troviamo nelle altre malattie.

GlicogenosiSono patologie caratterizzate da alterazioni di enzimi che partecipano al metabolismo del glucosio.Tutti gli enzimi scritti in grassetto portano al medesimo quadro patologico. Quindi avremo problemi di accumulo del substrato (glicogeno) e mancanza dei prodotti (energia).Vi sono forme differenti. Se guardiamo la colonna a destra vediamo che i tessuti colpiti sono sempre gli stessi. Quindi possiamo dividere in due blocchi: patogenesi epatica e muscolare.Ci avviene perch il glicogeno accumulato nel fegato e vi sar un accumulo di glicogeno nel fegato epatomegalia. Il glucosio usato dal fegato e la carenza avvertita dal muscolo forma muscolare.

Queste malattie sono autosomiche recessive.Vi sono quindi due cause di danno

principali: Danno cellulare da accumulo di glicogeno Mancanza di energia da carente glicolisi

Avremo quindi due forme: Forme epatiche Tipi I, III, VI, VIII con epatomegalia da accumulo di glicogeno nel fegato

(e in altri organi) e conseguentemente ipoglicemia da scarsit di glucosio anche se il problema principale e l'accumulo e l'ingombro del glicogeno.

Forme muscolari Tipi [II], V, VII presente una scarsa glicolisi nel muscolo mancanza di energia debolezza muscolare, crampi

Altre forme possono essere:

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Glicogenosi tipo II (di Pompe) Maltasi acida lisosomiale, accumulo di glicogeno nei lisosomi con danni prevalentemente cardiaci;

Tipo IV (di Anderson) Enzima ramificante, deposizione ubiquitaria di glicogeno anomalo, danni cerebrali, cardiaci, muscolari, epatici

Malattie da accumulo lisosomialeIl lisosoma importante nei meccanismi di catabolismo della cellula fino all'autofagia. Nel lisosoma avviene la degradazione di componenti in ambiente acido. Nel lisosoma arrivano delle componenti che devono essere smontate e ci sono degli enzimi litici che scompongono le macromolecole le cui sostanze vengono poi rilasciate nel citosol. Nelle patologie lisosomiali abbiamo un blocco delle macromolecole nel lisosoma e la cellula si riempie di lisosomi e la malattia progressiva. Si arriva ad un punto in cui questo ingombro blocca la funzione delle cellule mi d una organomegalia.Sono patologie recessive, autosomiche o legate allX.Il danno localizzato in organi o cellule ricchi di susbtrato o specializzati nella degradazione. Essenzialmente se colpito un enzima chiave in una reazione lisosomiale saranno danneggiati gli organi nei quali questa reazione una reazione chiave oppure pu essere colpito il fagocita, la cui funzione dipende dal lisosoma, quindi abbiamo epatosplenomegalia. Possiamo avere anche linfoadenopatia perch i fagociti sono anche l.

Malattia a cellule I (con inclusioni perch vi sono anomalie morfologiche)L'indirizzo per spedire una proteina al lisosoma il mannosio6P. Vi sono delle proteine fosforilate nel cis-golgi dal GlcNAc. La mancanza dellenzima GlcNAc fosfotransferasi comporta che e le idrolasi acide vengono secrete invece di essere indirizzate al lisosoma (non in tutti i tipi cellulari meccanismo alternativo?)Danni scheletrici, ritardo di crescita, ritardo mentale. Vita media 5-7 anni perch non funzionano i lisosomi.

SfingolipidosiIl grafico riporta tutti i processi che portano alla demolizione dei lipidi. I rettangoli rossi indicano dove sono localizzate le tre patologie che tratteremo.Vi un accumulo lisosomiale di sfingolipidi (ceramide + gruppo X). Possono quindi essere:

Sfingoglicolipidi X = zuccheri Cerebroside = Ceramide + Glc o

Gal

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Globoside = Cerebroside + zuccheri Ganglioside = Cerebroside + zuccheri + acido sialico Solfatide = Cerebroside + zuccheri + SO4

Sfingofosfolipidi X = fosfato + alcol aminato Sfingomielina = Ceramide + fosfato + colina

Sfingolipidi = ceramide + X ceramide = base azotata a catena lunga (sfingosina) + acido grasso (>20 C). Sono componenti fondamentali della cellula e sono presenti molto nelle cellule nervose (vedi cerebroside, perch nel cervello). Sono coinvolte nel turnover nei componenti di membrana.

Malattia di Tay-Sachs Gangliosidosi GM2Si ha un accumulo di GM2 in tutti i tessuti. L'esosaminidasi A converte GM2 in GM3. Se non funziona vi sono danni principalmente neuronali: cecit, convulsioni, spasmi muscolari, demenza.Vengono distinte tre patologie a seconda delle subunit non funzionanti (vedi nomi a fianco). Sono malattie recessive (quindi si verificano in omozigosi) ed particolarmente frequente negli ebrei. In questi gruppi possiamo trovare omozigoti recessivi classici ed hanno quindi due alleli null con insorgenza infantile. Vi sono altri soggetti che ereditano una mutazione ipomorfica che d una funzionalit ridotta, quindi con un allele null e uno con attivit enzimatica residua (eterozigoti compositi). In questo caso avremo insorgenza giovanile o adulta perch vi una funzione in parte ancora presente. La patogenesi principalmente a livello del SNC.

Malattia di GaucherAccumulo di glucocerebroside nei fagociti (queste cellule rigonfie vengono denominate cellule di Gaucher) e/o nel SNC, quindi due sistemi possono essere colpiti.La glucocerebrosidasi libera il glucosio dalla ceramide e vi pu essere un accumulo del glucocerebroside. I fagociti infarciti di lisosomi sono chiamati cellule di Gaucher che sono localizzati tipicamente nel fegato e nella milza. Essendoci due bersagli possiamo avere forme che si dividono come patogenesi. La differenza lo fa il tipo di mutazione e il tipo di attivit enzimatica residua.Nel Tipo I Cronica non cerebrale nella quale avremo una attivit enzimatica ridotta; vi sar epatosplenomegalia, linfadenopatia (perch infarciti di fagociti), erosione ossea nel midollo emopoietico (per accumulo di linfociti), fratture (non perch l'osso interessato direttamente ma perch i fagociti sono presenti anche nell'osso) dobbiamo fare attenzione perch questi sono tutti luoghi dove si trova una grande quantit di macrofagi.Nel Tipo II Acuta neuropatica abbiamo invece attivit enzimatica nulla; saranno presenti convulsioni, deterioramento mentale e anche epatosplenomegalia, ovviamente + grave che nella forma precedente.Sappiamo che la ceramide coinvolto in meccanismi apoptotici.

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Malattia di Niemann-Pick

Anch'essa una patologia da accumulo e i residui (sfingomielina) si localizzano nel sistema reticoloendoteliale e nel SNC. Abbiamo due forme (simile alla Gaucher):

Tipo A InfantileAttivit enzimatica assenteEpatosplenomegalia, alterazioni neurologiche, ritardo di sviluppo fisico e mentale. Morte entro i 3 anni di et. Una mutazione che porta la mancanza completa dell'enzima porta a morte precoce.

Tipo II VisceraleAttivit enzimatica residua e non presente il coinvolgimento neurologico. Organomegalia senza coinvolgimento del SNC. I pazienti raggiungono let adulta (differentemente dalla forma infantile).

Patologie da mucopolisaccaridi (o mucopolisaccaridosi) Sono delle malattie da accumulo lisosomiale di glicosaminoglicani (i GAG erano raggruppati sotto i mucopolisaccaridi da cui il, oggi si tende a privilegiare la forma di GAG). I GAG sono polisaccaridi lunghi, non ramificati, formati dalla ripetizione di un disaccaride. Vi

sono dei componenti strutturali importanti quali quelli in grassetto nella tabella a fianco.

Solo l'acido ialuronico rimane da solo mentre gli altri quattro sono le componenti dei proteoglicani; questi sono importanti nelle strutture portanti a livello della cute, derma, osso, ecc.

Vi una variet enorme di patologie a seconda del GAG e dell'enzima colpito. Il quinto stato cancellato e non seguiamo quindi questa classificazione.

Il quadro in queste patologie il Gargoinismo (da Gargoyle), faces grossolana, alterazione sviluppo strutturale. Tutte recessive tranne una leata allX. Vi etereogeneit allelica: Hurler/Scheie (come Deuchenne e Becker) sono due patologie determinate da mutazione diverse dello stesso gene. Il quadro clinico dato da faces grossolana, addome ingrossato, data da epatosplenomegalia, disostosi multiple: ispessimento molte ossa (anche le ossa piatte), ritardo mentale dovuto a problemi ossei, opacit corneale.

Malattie RecettorialiQuesta classe di patologie sono a carico di qualunque cosa sposti molecole e segnali all'interno della cellula. I recettori si dividono in due classi differenti:

Recettori che trasducono segnali: il ligando non importante perch scatena cascata segnali. In questo gruppo rientrano anche dei recettori che trasducono segnali di crescita cellulare, ovvero gli oncogni. Questi li tratteremo pi avanti nelle malattie neoplastiche

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ereditarie. A questa classe appartengono:

rodopsina: segnali luminosit e cecit oculare retinite pigmentosa

osteroidi;

RET MET: fattori di crescita, coinvolte in patologie neoplastiche, componenti strutturali;

Recettori trasporto: il ligando importante perch deve essere trasportato da un posto all'altro:

CFTR Fibrosi cistica;

Emoglobina Talassemie anemia falciforme

Recettore delle LDL Ipercolesterolemia familare

Fibrosi cistica (mucoviscidosi)La fibrosi cistica (FC), o mucoviscidosi, o malattia fibrocistica del pancreas, una malattia genetica autosomica recessiva, si manifesta pienamente soltanto negli omozigoti e con nessuna sintomatologia clinica negli eterozigoti. Mutazione sul cromosoma 7q31.2.

Polmoni e pancreas sono invasi da muco: pi frequente nelle popolazioni occidentali, 1 su 2500 nati, negli asiatici e sudafricani 10000 volte minore. la malattia genetica pi frequente nei caucasici. La frequenza dei bambini che nascano con patologia pari alla probabilit che due genitori con un allele mutato si incontrino. Di fatto dobbiamo fare solo una radice quadrata di 1/2500, ovvero 1/50 di tutti i soggetti hanno un allele mutato. In genetica la frequenza cos alta di un allele mutato pu essere per imbreeding, oppure perch siamo membri di una comunit chiusa ma non il caso della razza caucasica. La spiegazione che questa malattia legata alleterozigosi, ovvero ad un vantaggio derivato dall'eterozigosi. un caso simile allanemia mediterranea, data dalla malaria e dalle zanzare, infatti il fenotipo eterozigote resistente alla malaria. Nel caso della fibrosi cistica si pensato che potesse essere una cosa simile: lipotesi che questa mutazione porti resistenza al colera, che in origine una patologia a carico di ioni. In Europa c una mutazione (F508) che segue tutta l'evoluzione indoeuropea dalla mesopotamia all'Europa che ha accompagnato tutta la civilizzazione dell'uomo.

Clinica

Nei pazienti con fibrosi cistica, le ghiandole esocrine e i polmoni presentano un eccesso di secrezione mucosa di gravit differente in relazione agli organi colpiti: i peggiori sono pancreas esocrino (non endocrino) e il polmone. Il polmone ha anche ruolo di difesa e con un eccesso di secrezione il muco non riesce a uscire dal polmone e i microrganismi patogeni e non patogeni (opportunisti) riescono a proliferare dando luogo ad infezioni ricorrenti (polmonite da opportunisti). Anche laccumulo di particolato (polveri) causa di alcuni problemi: nel BALT (tessuto linfoide associato ai bronchi) porta infiammazione cronica, infezione cronica danno tissutale, nella componente epiteliale e mesenchimale del polmone, che lorganismo tenta di riparare portando cicatrici accumulo di connettivo ed epitelio fibrosi il 90% dei pazienti muore per insufficienza respiratoria. Il secondo organo bersaglio il pancreas esocrino la cui fibrosi pu

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portare ad un cattivo assorbimento, molto pi grave nei bambini che negli adulti, che si manifesta denutrimento. La sopravvivenza era di 10 anni nel dopoguerra, adesso arriva a 30 anni; ci permette a questi soggetti di riprodursi e rende difficile il ruolo del counseling. Il gene implicato CFTR (cistic fibrosis trasmembrana regulator), 7q31.2, clonato nel 1990, codifica una componente di 1480 aa del canale del Cl regolato da cAMP. Regola trasporto Cl e Na negli epiteli. Il problema quello di avere un secreto pi viscoso del normale (il danno quindi idromeccanico). Mutazioni nel 3% della popolazione caucasica. Vi una elevata eterogeneit allelica anche se nel 70% dei casi presente la F508, con delezione di una fenilalanina (1500 mutazioni diverse nel restante 30% di casi). F508: proteina con folding alterato, ritenuta nel reticolo, potenzialmente funzionale (se ci fosse una stampella molecolare che raddrizzi la proteina potremmo trovare il farmaco protein therapy). Alcune mutazioni (es. A455E, mutazione minoritaria ipomorfica) comportano un livello funzionale di CFTR ridotto del 95%, ma sono associate a patologie lievi (prospettiva per terapia genica) quindi abbiamo una riserva funzionale molto ampia e deve essere completamente perso il 100% della proteina. Possiamo rinunciare al 95% della proteina e avere forme cliniche minori.

Trattamento della fibrosi cistica

Nei casi di insufficienza pancreatica si possono somministrare enzimi pancreatici ai pasti. Nei casi di problemi di assorbimento degli alimenti invece possibile aumentare le calorie. Per le manifestazioni polmonari (il problema pi grave) possiamo utilizzare le vaccinazioni, profilassi e terapia antibiotica, Fisioterapia (terapia espettorante), Farmaci broncodilatatori (per aumentare gli scambi), Corticosteroidi orali (quando l'infiammazione cronica imponente). Nei casi pi gravi si pu optare trapianto di polmone che l'unica terapia risolutiva ma non applicabile in tutti i casi. La terapia genica ha come obiettivo in futuro la protein theraphy.

Patologia molecolare 24 marzo e 25 marzo 2011

Oncologia Prof.ssa Nanni Patrizia

Programma d'esameIntroduzione, definizioni, classificazioni

Dimensioni del problema cancro Tumori benigni e tumori maligni

Il tumore come malattia genica Oncogni e geni oncosoppressori gatekeeper e caretaker Meccanismi di attivazione di oncogni o inattivazione di geni oncosoppressori - Effetti di

attivazioni/inattivazioni Implicazioni terapeutiche di oncogni e geni oncosoppressori Predisposizione genetica

Il fenotipo tumorale Crescita Differenziamento Morte cellulare Instabilit genomica Caratteristiche morfologiche e metaboliche,

Storia naturale Monoclonalit Eterogeneit Lesioni preneoplastiche Progressione

Rapporti tumore-ospite Angiogenesi Il processo metastatico

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Sindromi paraneoplastiche Immunologia dei tumori

I termini tumore e neoplasia indicano una massa/tumefazione/popolazione cellulare che si accresce in modo non coordinato con il resto dell'organismo. Tumore e neoplasia sono impiegati sia per i k benigni che maligni, sia peri i tumori solidi che fanno massa sia per le leucemie (una volta chiamati liquidi). Il termine cancro impiegato per le forme maligne.Il cancro non di origine recente perch vi sono segni di masse tumorali anche nei dinosauri e sono presenti in tutte le classi di vertebrati ed invertebrati.Ogni anno si ammalano di cancro nel mondo 12 milioni di persone l'anno (6.660.000 maschi e 6.038.000 femmine) e la mortalit elevata (4.225.662 maschi e 3.345.839 femmine).I tumori pi frequenti colpiscono il polmone, il seno, il colon-retto, stomaco e prostata. I tuori hanno incidenza differente. Inoltre il rapporto incidenza/mortalit non lo stesso.La prima causa di decesso nei paesi sviluppati sono le malattie vascolari (45%) e poi al secondo posto c' il cancro (21%) mentre nei paesi in via di sviluppo abbiamo le malattie infettive (43%) seguite dalle malattie cardiovascolari (25%) e poi i tumori (9,5%). Ogni anno sono 600000 i morti in Italia da tumore. I maschi hanno il 50% del rischio di ammalarsi di tumore nel corso della propria vita, e 1 su 2,6 nelle femmine. In totale 1 persona su 5 muore di tumore.In Italia circa 160.000 morti totali ogni anno per cancro.Anche la mortalit negli anni variata per ogni organo. Nei maschi quello al polmone aumentato di recente (anche se il picco passato) a causa del fumo mentre quello allo stomaco diminuito grazie alla migliore conservazione dei cibi grazie al frigorifero. Nelle femmine il primo tumore quello al polmone ed in crescita.Per ridurre l'incidenza o la mortalit del tumore si pu fare prevenzione, ricerca, screening e ricercare nuovi farmaci. In Italia ci sono 80000 morti all'anno per il fumo.

Morti per il fumoNel mondo circa 6 milioni di morti per il fumo (neoplasie, m. cardiovascolari, m. respiratorie, altro) ogni anno. Circa 850.000 morti per neoplasie dovute al fumo, ogni anno = 2.329/giornoIn Italia 80.000 morti per fumo /anno = 220 morti al giorno. 27.000/80.000 morti di tumore tra i 35-69 anni = 74 al giorno, con una perdita media (tra questi pazienti) di 22 anni di attesa di vitaMet dei fumatori regolari sono uccisi dal tabacco. Un quarto dei fumatori moriranno prematuramente tra i 35 e i 69 anni. Fortemente aumentato il rischio di cancro rispetto ai non fumatori. Smettere di fumare serve a ridurre laumento del rischio

PREVENZIONE PRIMARIA: Esposizioni sul lavoro Agenti biologici Stile di vita

Fumo Alcol Alimentazione

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Esposizione al sole

CHEMIOPREVENZIONE Endogeni

Proliferazione cellulare Ormoni Fattori di crescita

Nel caso del fumo si pu prevenire riducendo l'esposizione (anche in alcune malattie professionali cos). Met dei fumatori regolari sono uccisi dal tabaccoUn quarto dei fumatori moriranno prematuramente tra i 35 e i 69 anni ed fortemente aumentato il rischio di cancro rispetto ai non fumatori. Smettere di fumare serve a ridurre laumento del rischio Un altro metodo di prevenzione la vaccinazione (es. Papovavirus nelle dodicenni contro il tumore del collo dell'utero). Pi del 15% di tutti i tumori umani sono causati (direttamente od indirettamente) da agenti biologici come virus e batteri. possibile prevenire questi tumori mediante vaccini che proteggono dallinfezione. Sono gi disponibili vaccini per prevenire:

tumore del fegato (virus dellepatite B, HBV) tumore del collo dellutero (virus papilloma, HPV).

EFFICACIA DEL VACCINO CONTRO HPV:Prevenzione dellinfezione: 96.9%Prevenzione dellinfezione cronica: 100%Prevenzione della formazione di cellule anomale nel collo dellutero: 93%-96%Prevenzione del carcinoma della cervice uterina: 100%

Interventi per ridurre lincidenza:Prevenzione

individuazione di fattori che favoriscono insorgenza e sviluppo tumorale. Eliminazione/riduzione

individuazione di persone a rischio di sviluppare tumoreEsposizione

predisposizione genetica Interventi per ridurre la mortalit: Prevenzione con l'individuazione di fattori che favoriscono insorgenza e sviluppo tumorale. Eliminazione/riduzione dell'agente.

Interventi per ridurre la mortalit: Diagnosi precoce Terapie

Terapie del tumore primario Terapie delle metastasi Terapie di supporto

Chirurgia Radioterapia Chemioterapia Limitazione di tossicit Riduzione della tossicit delle terapie Individuazione di pazienti responsivi alle terapie

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Individuazione di pazienti a rischio di sviluppare metastasi

TERAPIA MIRATA (TARGETED THERAPY) necessario studiare le differenze molecolari tra cellule normali e tumorali ed individuare le molecole da cui dipende la sopravvivenza delle cellule tumorali. Inoltre importante stabilire quali molecole tumorali possono essere bersaglio di strategie terapeutiche.Disegnare e produrre nuovi farmaci che colpiscono le cellule tumorali che esprimono il bersaglio.Iperplasia fisiologica e iperplasia patologica sono due termini differenti da tumore:Iperplasia fisiologica = aumento della proliferazione quando necessario un aumento della funzione o la compensazione di una sua diminuzione.Iperplasia patologica = aumento della proliferazione come risposta reattiva ad insulti persistenti di vario tipo.Liperplasia sia fisiologica che patologica un aumento numerico che permane entro limiti controllati. E un aumento reversibile e non progressivo.

Definizioni di neoplasiaCrescita di tessuto relativamente autonoma e alterata in modo ereditabile.Si intende per neoplasia una crescita tissutale relativamente autonoma e progressiva.I tumori maligni sono invasivi e possono dare metastasi; i tumori benigni no. Alcuni tumori benigni non evolvono mai a maligno.I tumori benigni non metastatizzano ma possono causare la compressione di vasi, organi, produzione maggiore di sostanze (adenoma ipofisario).Crescita di tessuto come risultato di una alterata omeostasi, dovuta ad alterazioni ereditabili dalle cellule nel

controllo della proliferazione controllo della morte cellulare controllo del differenziamento

I tumori possono originarsi in tutti i tessuti da cellule che mantengono una capacit proliferativa.Sono un gruppo di malattie che condividono caratteristiche fondamentali.

Tumori benigniSono localizzati e non infiltrano il tessuto normale.Producono danni rilevanti solo per compressione od ostruzione di strutture anatomiche importanti o, quando hanno capacit secernente, a causa della grande quantit di sostanza prodotta (ad es. insulinoma, tumore pancreas che pu dare gravi crisi ipoglicemiche)

Tumori maligniSono invasivi, cio infiltrano i tessuti normali circostanti e possono metastatizzare in organi/tessuti distanti dal punto dorigine.Presentano anche caratteristiche proprie delle cellule di origine e dellambiente dinsorgenza.

La differenza tra tumori benigni e maligni molto importante per la prognosi e la terapia.La valutazione che si basa su di una correlazione storica (probabilit) tra determinate caratteristiche istologiche e citologiche e levoluzione del tumore.Alcuni tipi di lesioni possono evolvere, altri mai.

NomenclaturaLe neoplasie benigne spesso, ma non sempre, vengono indicate con un prefisso che identifica il tessuto o la cellula dorigine e dal suffisso oma (ad esempio adenoma, epitelioma, condroma). Esiste qualche eccezione per alcuni maligni es: melanoma. I teratomi originano da pi foglietti

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germinali e quindi contengono tipi cellulari diversi. Si formano principalmente nelle gonadi.

Le neoplasie maligne sono indicate con il suffisso -oma + l'origine del tessuto tumorale;Se da cellule nervose: retinoblastoma, neuroblastomaSe da astrociti: glioblastoma- carcinoma se di origine epiteliale es. adenocarcinoma- sarcoma se di origine mesenchimale es. fibrosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma osteosarcoma, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma,- blastoma per neoplasie di possibile origine embrionale es. retinoblastoma. Se dal tessuto emopoietico

leucemie per neoplasie che originano nel midollo osseo linfomi per neoplasie che originano nei linfonodi e milza

I tumori vengono classificati anche in base allaspetto macroscopico, (polipo papilloma).In base alle caratteristiche dello stroma pi o meno scarso o alla produzione di mucina vi sono sottoclassificazioni: midollare, scirroso, mucinoso.Vi sono tantissimi i sottotipi descritti.

Grading e Staging dei tumoriRicerca di quantificazione dellaggressivit dei singoli tumori.Grading: sistema basato sul differenziamento, indice mitotico e altre caratteristiche cito-istologiche di lontananza dalle cellule normali di riferimento.Staging: dimensioni della neoplasia primaria, coinvolgimento dei linfonodi e diffusione metastaticaImplicazioni prognostiche e predittive della risposta alle terapie, valutazione dei risultati di terapie

Frequenza dei vari tipi di neoplasie maligne:I carcinomi rappresentano la grandissima parte delle neoplasie:circa 85-90%I sarcomi sono poco frequenti: circa 1-2%Le leucemie circa il 3%I linfomi circa il 4%Altri (melanomi, tumori cellule del sistema nervoso,) circa il 5%.

IL TUMORE COME MALATTIA GENICAI tumori sono il risultato di alterazioni nella struttura o nellespressione di determinati geni.Le alterazioni colpiscono le cellule somatiche.Se colpiscono una cellula germinale si possono ereditare alterazioni che predispongono al cancro.

Funzioni dei geni che possono essere alteratiI geni che vengono alterati sono coinvolti nei fenomeni di: Regolazione della crescita cellulare

Proliferazione cellulare Morte cellulare Differenziamento

Controllo della stabilit del genoma Corretta duplicazione del genoma Riparazione del DNA

Eventi esogeni o endogeni possono provocare alterazioni strutturali o di espressione in questi geni.

In un organismo pluricellulare le cellule devono: collaborare con altre cellule

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interagire col microambiente avere un comportamento coordinato sottoposto a controllo sociale.

Vi un fluire di informazioni da microambiente alla cellula e viceversa nella quale fondamentale la trasduzione del segnale. Le informazioni, cio i segnali, sono ricevuti da parte di strutture indicate come recettori. La cellula risponde modificando attivit come proliferazione, morte, movimento, produzione specializzata etc. Tutto il macchinario indicato come trasduzione del segnale o signalling. Esso controlla sviluppo embrionale e, nelladulto, turnover ed omeostasiDeve essere un sistema affidabile e preciso, quindi molto complesso e finemente regolato.La cellula riceve segnali positivi o negativi per quanto riguarda:

Proliferazione Morte cellulare Differenziamento

Sono fenomeni strettamente interconnessi e finemente controllati, dipendenti da controllo della integrit del genoma.Quando unalterazione di struttura o di funzione interessa uno o pi geni coinvolti in questi processi regolati si pu avere insorgenza e crescita tumorale.Le alterazioni strutturali o dellespressione possono colpire due tipi di geni:

geni la cui aumentata e non regolata attivit favorisce la crescita tumorale Oncogni

geni la cui mancata attivit favorisce la crescita tumorale Geni Oncosoppressori

OncogniRegolano positivamente la crescita cellulare e possono essere:

Fattori di crescita; Trasduzione del segnale; Recettore di fattore di crescita; Fattore trascrizionale; Regolatore positivo del ciclo cellulare; Inibitori di apoptosi.

Geni oncosoppressoriSi dividono in geni che regolano negativamente la crescita cellulare (geni Gate keeper) e in geni che controllano la stabilit del genoma (geni care taker). Questi possono essere:

Fattore di inibizione Recettore di inibitore Inibitore di trasduttore del segnale Regolatore negativo di fattore trascrizionale Regolatore negativo del ciclo cellulare Regolatore positivo di apoptosi Corretta duplicazione del genoma Riparazione del DNA

I geni alterati nei tumoriOncogni: Sono geni che accelerano la moltiplicazione delle cellule. Nei tumori sono attivati in modo sregolato.Geni oncosoppressori: Sono geni che frenano la moltiplicazione delle cellule. Nei tumori sono disattivati.

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I topi da laboratorio nei quali si iniettano gli oncogeni devono essere immunodepressi e topi nudi (perch hanno un'atrofia timica che impedisce lo

Questa immagine () piace molto alla prof: descrive tutti i livelli ai quali possibile che ci sia una alterazione nella trasduzione del segnale mitogenico nei quali possono essere implicate alterazioni dei fattori di crescita, del recettore del fattore di crescita, dei trasduttori del segnale o dei fattori trascrizionali (bisogna sapere i bottoncini intermedi che veicolano il messaggio

Funzioni di OncogniGeni la cui accresciuta e non regolata attivit favorisce la crescita tumorale

Principali oncogni Fattori di crescita (GF) sis catena B di PDGF (Platelet derived growth factor)int-2 FGF-basico (Fibroblast growth factor)wnt fattore di crescita WNT, prec INT-1

Recettori di fattori di crescita di membrana (tirosin chinasi)erbB1 EGF-R (Epidermal growth factor-Receptor)erbB2 neu, HER-2, tirosin chinasi di membranafms CSF-1R (Colony stimulating factor-1-Receptor)kit SCF-R (Stem cell factor-Receptor)met HGF-R (Hepatocyte growth factor-Receptor)ret recettore di GDNF (Glial derived neurotrophic factor)trk-A recettore di NGF (Nerve growth factor)recettori nuclearierbA recettore ormoni tiroidei

Funzioni di OncogniTrasduttori del segnalesrc tirosin chinasi abl tirosin chinasiras GTP-asi (proteina G)Fattori trascrizionalimycjunfosRegolatori positivi del ciclo cellulareCCND ciclina DCCDK4 chinasi ciclina-dipendente 4

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Inibitori di apoptosibcl-2

Oncogni/Protooncogni e tumoriLa scoperta degli oncogni (fine anni 70-inizio anni 80) nata da 2 osservazioni:

in retrovirus oncogeni sequenze geniche responsabili della trasformazione neoplastica erano omologhe a sequenze del normale genoma cellulare

sequenze geniche di tumori trasformavano in senso neoplastico cellule normaliGli oncogni virali (v-onc) = analoghi alterati di geni cellulari (c-onc) sono rimasti inseriti nel genoma virale in seguito ad una infezione. Nel genoma i geni cellulari che, se alterati nella struttura o nella espressione (attivati), diventano oncogni venivano chiamati protooncogni. Comunemente si usa il termine oncogni anche per i protooncogni non attivati, normalmente regolati.

Meccanismi di attivazione di OncogniMeccanismi che determinano alterazioni nella struttura o espressione di oncogni tali che favoriscono crescita tumorale:

Mutazione puntiforme: porta a un prodotto alterato (livelli aumentati, molecola pi attiva, molecola meno inibita). es. RAS: carcinomi (H-RAS, K-RAS), alcune leucemie (N-RAS)

Amplificazione: porta a un prodotto normale ma iperespresso N-MYC Neuroblastoma, microcitoma polmonare ERB-B1 Glioblastoma multiforme ERB-B2 Carcinoma della mammella, ovaio MET Carcinoma gastrico, colon Ciclina D Carcinoma mammella

Traslocazione: pu avere due conseguenze: porta a un prodotto normale, ma iperespresso: es. MYC Linfoma di Burkitt t(8;14) porta a una proteina chimerica (pi attiva) es. ABL Leucemia mieloide cronica

t(9;22) cromosoma Philadelphia BCR-ABL proteina chimerica; Mutagenesi inserzionale: Retrovirus trasformanti lenti, ad es. MMTV provoca

carcinoma mammario topo perch promotore virale attiva oncogni; si verificata qualche rara volta nell'uomo a seguito della somministrazione della terapia genica.

Meccanismi Epigenetici: es. perdita di imprinting (LOI) di IGF-II porta a iperespressione nel rabdomiosarcoma.

Come effetti degli oncogni attivati si manifesta nei fattori di crescita con aumento dei livelli del fattore di crescita e Diminuita dipendenza della cellula da apporto esterno di fattore di crescita. Autocrinia per esempio sis: catena B di PDGF, Iperespresso nellastrocitoma Autocrinia.Si ha un aumento dei livelli e maggiore suscettibilit della cellula a livelli di fattori di crescita fisiologici ma al contempo ndipendenza dal ligando.Nei seguenti si manifesta un prodotto pi duraturo:

erbB1 EGF-R Iperespresso (amplificato) carcinoma mammario. Deleto dominio extracellulare nel glioblastoma: indipendente dal ligando;

erbB2 tirosina chinasi di membrana, iperespresso (amplificato) nel carcinoma mammario; kit, SCF-R Mutazione puntiforme e piccole delezioni. Iperespresso nei sarcomi

gastrointestinali, e nella leucemia mieloide.

Meccanismo di attivazione di RASPossiamo avere un prodotto pi duraturo nei trasduttori del segnale: per esempio RAS GTP-asi (proteina G) ancorata al versante citoplasmatico della membrana presente come mutazione 10-

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20% dei tumori ed difficile la sua inattivazione. Ras segue la via delle MAP chinasi. Il legame al recettore tirosin chinasico provoca dimerizzazione del recettore, autofosforilazione, legame a proteine adattatrici come GRB2 e SOS, attivazione della proteina RAS p21ras, proteina ad attivit GTPasica ancorata alla membrana. Nella sua forma inattiva RAS lega il guanosin-difosfato (GDP). Dopo essere stata attivata la proteina rilascia il GDP per legare il GTP.Lattivazione di RAS contrastata da proteine con attivit GAP (GTPase activating protein) che promuovendo lidrolisi del GTP riconduce RAS allo stato inattivo, legato al GDP.RAS attivata lega la proteina RAF che lega e fosforila MEK (una MAP chinasi); ERK (altra MAP chinasi) che trasloca al nucleo dove fosforila JUN e FOS che attivano la trascrizione. Con RAS mutato la proteina rimane permanentemente in uno stato attivato, in quanto non in grado di idrolizzare il GTP. H-RAS mutazione puntiforme nei codoni 12 o 13 sono siti ad alta mutabilit chiamati anche hot spots.

Effetti degli oncogeni attivatiAbl: tirosin chinasi (ancorata al versante citoplasmatico della membrana, nucleo, citoplasma). Traslocazione reciproca (9;22) ABL dal cromosoma 9 al 22 si fonde con BCR formando gene chimerico. Determina una attivit tirosin chinasica maggiore. associata alla leucemia mieloide cronica 95% dei casi ha traslocazione (9;22), nel 90% dei casi di LMC si evidenzia il cromosoma 22 pi corto= cromosoma Philadelphia. Proteina di fusione p210bcr/abl. Unaltra proteina di fusione (p185) traslocazione (9;22) con un punto di rottura BCR diverso. 20-25% della leucemia linfoblastica acuta e nel 2.5% di leucemia mieloide acuta. La traslocazione 9-22 comporta un accorciamento del 22 perch si tratta di una traslocazione reciproca.Inoltre Abl normale quando ha localizzazione nucleare induce apoptosi; BCR/ABL resta sequestrata nel citoplasma quindi non induce apoptosi. Se la funzione quella di fattore trascrizionale abbiamo un altro effetto degli oncogni attivati. Possiamo avere un aumento dei livelli o un prodotto pi duraturo o attivo. Un esempio il gene myc (traslocazione 8-14) che viene traslocato in vicinanza delle catene pesanti delle Ig (enancher) e viene prodotto in grandi quantit. Quindi la traslocazione di myc t(8;14) (q24;q32) anche t(8;22) o t(2;8) nel causa il linfoma di Burkitt [cell B]. Il gene MYC dal cromosoma 8 trasloca vicino al gene che codifica la porzione costante delle catene pesanti (CH) delle Ig sul cromosoma 14 risentendo delleffetto attivante di suoi elementi enhancer. Lespressione costitutiva di MYC altera il sistema di controllo della trascrizione basato su dimeri MAX/MYC attivanti o MAD/MAX repressivi. Si manifesta amplificazione N-MYC nel neuroblastoma.Riassumendo possiamo parlare di:

acquisto di funzione (gain of function); prodotto iperespresso che pu essere dato da amplificazione, traslocazione senza formazione

di proteina di fusione o meccanismi epigenetici; prodotto alterato iperfunzionante o per mutazione puntiforme o per traslocazione con

formazione di proteina di fusione; effetto dominante.

Le implicazioni terapeutiche di questi meccanismi che si pu ridurre la funzione acquisita attraverso anticorpi, inibitori specifici e strategie antisenso.

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Patologia molecolare 31 marzo 2011 Prof.ssa Patrizia Nanni

GENI ONCOSOPPRESSORISono geni la cui mancata attivit allinterno della cellula favorisce la crescita tumorale.Lalterazione nella struttura o nell'espressione di questi geni (inattivazione) se a carico di entrambi gli alleli determina perdita di funzione e fenotipo tumorale.

Prime identificazioni di geni oncosoppressoriA volte si presentavano delle cellule che presentavano ibridi tumorali se erano stimolati gli oncogeni ma altre volte il fenotipo normale comportava la presenza di oncosoppressori. Spesso quindi gli ibridi tra cellule tumorali e cellule normali spesso mostravano fenotipo normale; in determinati tumori erano evidenziabili delezioni cromosomiche costanti e quindi in queste delezioni c'erano geni che controllavano in modo negativo la proliferazione (oncosoppressori). L'insieme di questi dati sperimentali hanno portato a scoprire gli oncosoppressori. Sono quindi necessari 2 eventi inattivanti, uno per ciascun allele.

Oncosoppressori Gatekeeper e CaretakerGli oncosoppressori si dividono due categorie (Gatekeeper o Caretaker) (secondo la prof non c' questa suddivisione ma da sapere). Quindi in base alla prevalenza della funzione avremo:

Gatekeeper: Funzione di regolazione negativa della proliferazione e positiva dellapoptosi. Vengono inattivati se sono inattivati entrambi gli alleli. In questo caso si ha perdita di funzione ovvero un vantaggio selettivo nella crescita poich viene perso un oncosoppressore. caratterizzato da relativa tessuto specificit Possiamo avere differenti tipi di inibitori e geni oncosoppressori possono avere una di queste funzioni: Fattore di inibizione Recettore di inibitore Inibitore di trasduttore del segnale Regolatore negativo di fattore di trascrizione Regolatore negativo del ciclo cellulare Regolatore positivo di apoptosiQuesti geni sono geni di controllo della stabilit del genoma e ogni cellula deve passare un genoma non alterato.

Vi sono due funzioni di base degli oncosoppressori Caretaker: Funzione di controllo dellintegrit del genoma - Corretta duplicazione del genoma Riparazione del DNA)

Linattivazione di entrambi gli alleli determina instabilit genomica e conseguente maggiore frequenza di alterazioni (100-1000 volte pi frequenti) anche a carico di oncogni o altri geni oncosoppressori. In questo caso c' un'assenza di un diretto vantaggio selettivo nella crescita.L'inattivazione di questo tipo di geni rende pi probabile l'alterazione di altri geni e pertanto di per s comporta l'assenza di un diretto vantaggio selettivo nella crescita. Si pu quindi parlare di due tipi di funzioni pi che due tipi di geni. Secondo alcuni, i veri geni oncosoppressori sono quelli dotati di entrambe le funzioni, come ad es. APC.

I principali geni oncosoppressori RB: Funzione prevalentemente Gatekeeper Controllo trascrizione dei geni di fase S in

mitosi (G1S) ed coinvolto direttamente nel ciclo cellulare con un controllo negativo sullo stesso.

APC: Funzioni Gatekeeper + Caretaker quindi da un lato ha un ruolo di soppressione della trasduzione del segnale e dall'altro stabilit cromosomica.

PTEN : Funzione prevalente Gatekeeper, Regolazione della segnalazione via

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fosfatidilinositidi VHL : Funz prev Gatekeeper, Degradazione di HIF-alfa p53 (TP53) detto anche guardiano del genoma e viene attivato quando ci sono dei danni

al DNA. Funzione prevalentemente Caretaker. un fattore di trascrizione che sorveglia l'integrit del genoma. un sensore di danni al DNA, induce blocco del ciclo e apoptosi.

BRCA-1 : Funzione prevalente Caretaker, sorveglia l'integrit del genoma (stabilit cromosomi riparazione DNA);

BRCA-2 : Funzione prevalente Caretaker, sorveglia l'integrit del genoma (stabilit cromosomi, riparazione DNA);

NER (sistema) Funzione prevalente Caretaker. Sorveglia l'integrit del genoma (riparazione DNA per escissione dei nucleotidi);

MSH2 : Funzione prevalente Caretaker. Sorveglia l'integrit del genoma (riparazione DNA da errato appaiamento);

MLH1 :Funzione prevalente Caretaker. Sorveglia l'integrit del genoma (riparazione DNA da errato appaiamento);

ATM : Funzione prevalente Caretaker. Sorveglia l'integrit del genoma, attiva sistemi riparazione (controlla lunghezza telomeri), attiva p53 (con meccanismo post traduzionale aggiunge un gruppo fosfato al residuo Ser15 di p53) e rallenta ciclo mitotico in fase G2.

Quindi se volessimo fare una proporzione tra oncogeni, oncosoppressori e una macchina:Acceleratore : oncogeni = freno : oncosoppressori gatekeaper

Meccanismi di inattivazione di geni oncosoppressoriIl meccanismo per l'inattivazione la perdita del prodotto o formazione di prodotto inattivo (troncato) che pu essere dovuto a:

Delezioni (perdita gene, perdita intero cromosoma); Mutazioni (non senso, di senso, frameshift); Alterazioni epigenetiche (es metilazione - ipermetilazione del promotore di MLH1

impedisce il mismatch repair del promotore PTEN, fosfatasi che contrasta PI3K degradandone il prodotto portando ad un aumento del segnale di PI3K).

Prodotti virali che possono inattivare gli oncosoppressori.Quindi deve essere a carico di entrambi gli alleli.Per esempio RB (Funz prev Gatekeeper) inattivato in retinoblastoma, osteosarcoma, ca polmonare, mammella, prostata, vescica, qiuindi in vari tipi di tumore. presente una delezione/mutazione non senso anche forma ereditaria (retinoblastoma). C' questa associazione perch c' una forma ereditaria di inattivazione di RB. Per questi geni oncosoppressori si eredita l'alterazione in uno dei due alleli (si eredita quindi la probabilit) e quindi aumenta la probabilt di ereditare la mutazione. Ovviamente dipende da quale cellula (se della linea germinale o somatica) viene colpita. ovviamente peggio la germinale perch la caratteristica viene ereditata da tutte le cellule.In G1 la RB ipofosforilata si lega a fattori di trascrizione E2F/DP Il complesso RB-E2F/DP si lega a promotori e reprime la trascrizione di geni di replicazione del DNA cellulare La proteina RB viene iperfosforilata dalle chinasi ciclina-dipendenti di fase G1 e si dissocia dal complesso E2F/DP questultimo pu espletare la sua funzione transattivante.Le varie p... inserite nell'immagine sono degli oncosoppressori e le cicline sono oncogeni perch non sono controllate dagli oncosoppressori. Se RB viene fosforilato E2F libero di dare la trascrizione e di portare avanti il ciclo.L'inattivazione pu essere data anche da prodotti di geni virali (E1A, E7 e SV40) sequestra RB e lascia E2F libero di continuare la m