I Linfomi

Dott. Renato Franco

SC di Anatomia Patologica

Direttore prof. Gerardo Botti

Istituto dei Tumori Fondazione G. Pascale, Napoli

• 1mm<>2cm

•

linfonodi cervicali, ascellari, inguinali

più frequentemente palpabili nel bambino.

•

linfonodi preauricolari, epitrocleari

, sopraclaveari, poplitei, addominali, mediastinici

aumentati di volume sempre patologici.

• Stazioni linfonodali: Testa-collo:

PreauricolariRetronucaliSottomandibolariLaterocervicali

Torace:SovraclaveareAscellariMediastinici

Addome:Addomio-pelviciIliaciInguinali

Arti:EpitrocleariPoplitei

LinfonodoStruttura

Organizzati in gruppi C. linfoidiC. immunologicamente attiveC. stromali

Foto?

Foto?

LinfonodoParenchima: Corticale

Popolato da linfociti B entrati nel LND attraverso le VEA

Follicoli primari

Follicoli secondari con centro germinativo

Il contatto con cellule vergini adeguate induce alla proliferazione del linfocita nel centro germinativo, da cui cellule attivate e cellule della memoria.

I linfociti non adeguati lasciano il linfonodo verso il circolo ematico

Cellule accessorie:Macrofagi sinusaliTingible bodiesMacrofagi della zona marginaleCellule dendritiche nei CG

Foto?

Parenchima: Paracorticale

Popolato da linfociti T entrati nel LND

attraverso le VEA

Attivati proliferano determinando espansione

della paracorticale

Cellule accessorie: cellule interdigitate, tipo di APC

Linfonodo

Foto?

LinfonodoSinusoidi linfonodali

Seno sottocorticale

Seno corticale, difficile da visualizzare

Seno midollare

Foto?

Parenchima: Midollare

Vasi ematici di grandi dimensione

Cordoni midollari ricchi di cellule (plasmacellule e

macrofagi)

Ampi seni midollari

Linfonodo

Foto?

HomingDopo la maturazione inizialenegli organo immunitari, cellule B e T vergini, --> sangueperiferico--> LND e altriorgani secondariLe sedi B dipendenti includono:

Follicoli primari e secondariPresentazione antigenicaProliferazione e differenziazione

Cordon midollariRilascio

di

Ig

da

parte

delle

plasmacellule

Sedi T dipendenti sono le paracorticliLa separazione da cellule B e T non è assoluta

MECCANISMI PATOGENETICI DELLA LINFOADENOMEGALIA

INTRINSECO ESTRINSECO

Proliferazione dei linfociti o degli istiociti

normalmente presenti nel linfonodo

Infiltrazione di cellule estrinseche nel linfonodo

MECCANISMO PATOGENETICO INTRINSECO DELLA

LINFOADENOMEGALIA

•Proliferazione dei linfociti e/o istiociti

•ingorgo linfatico per aumentato flusso afferente e rallentamento del tempo di transito dei linfociti

•attivazione e proliferazione antigene-dipendente dei linfociti: espansione aree B e T cellulari

•iperplasia ed alterazione delle cellule istiocitarie

MECCANISMO PATOGENETICO ESTRINSECO DELLA

LINFOADENOMEGALIA

•polimorfonucleati

in corso di linfoadeniti

batteriche

•cellule leucemiche o di tumori solidi metastatizzati.

LINFOADENOMEGALIE

NeoplasticheNeoplastiche

Classificazione eziologica

ReattiveReattive -

infettive

-

autoimmunitarie- metaboliche-

tossico-medicamentose

- aspecifiche

LINFOADENOMEGALIEinquadramento eziologico

• mononucleosi

infettiva (EBV)• CMV• adenovirus• coxsachie• HHV-6• morbillo• rosolia• varicella• infezioni vie respiratorie• AIDS

Cause virali

Infettive

LINFOADENOMEGALIEinquadramento eziologico

• Staphilococcus

aureus• Streptococco b-emolitico gr.A• Haemophilus

influenzae

tipo B

• Micobatteri

T e NT•

Bartonella

henselae

(M. graffio di

gatto)• Corynebacterium

diphtherie

(difterite)

• Brucella melitensis• Treponema pallidum

(lue secondaria)

• Leptospira

interrogans

(leptospirosi)• Francisella

tularensis

(tularemia)

Cause batteriche

Infettive

LINFOADENOMEGALIEinquadramento eziologico

• Histoplasma

capsulatum• Candida albicans• Sporothrix

schenckii

Cause micotiche

• Toxoplasma

gondii• Leishmania• Plasmodi malarici• Trypanosoma

brucei

Cause parassitarie

Infettive

Iperplasia linfoide

zone T e B dipendenti:toxoplasmosimononucleosi

infettivalinfoadeniti

dermatopaticheIperplasia follicolare e plasmocitosi

(cellule B):iperplasia follicolare artrite reumatoidelinfoadenite

lueticaAIDS stadio precoce

Iperplasia paracorticale (cellule T):adeniti

viraliadeniti

postvaccinicheadeniti

iatrogene (idantoina)

Iperplasia corticaleMZ

LZ

DZ

Espansione della paracorticale

LINFOADENOMEGALIEinquadramento eziologico

Neoplastiche

•M. di Hodgkin•Linfoma non Hodgkin•Leucemie acute•Metastasi da tumori solidi

Linfoma di Hodgkin

Meno comune di NHL ~ 10,000 casi per anno

Età di incidenza bimodale, con primo picco nella tardaadolescenza e secondo piccointorno ai 60 anni

Diversamente dai NHL la componente neoplastica èminima. La diagnosi si basasulla presenza della cellula diHodgkin e delle sue varianti

Classificazione dei linfomi di HodgkinRye Classification REAL/WHO Classification

Lymphocyte predominant-5% Lymphocyte predominance, nodular

Nodular sclerosis-70%

Mixed cellularity-20% Classical HL

Lymphocyte depleted-5% Lymphocyte rich classical HL

Nodular sclerosis

Mixed cellularity

Lymphocyte depletion

Unclassifiable classical HL

Linfoma di Hodgkin sottotipo istologico

Sclerosi nodulareL’istotipo più comuneMediastino, colloCapsula fibrotica con bandesepimentanti la neoplasiaVarainte lacunare dellacellula di Reed Sternberg

Cellularità mistaMalattia più avanzataPazienti anzianiPiù cellule R-S, eosinofili, plasmacelluleVarianti mononucleari di cellule di R-S

Deplezione linfocitariaRetroperitoneo, pazieti anzianiPerdita di linfocitiPiù aggressiva

Predominanza linfocitariaGeneralmente malattialimitata (collo di giovaniadulti)Cellule L&H o cellula“popcorn”

Studi ancillari

Pattern di diffusioneIl linfoma di Hodgkin si diffonde per

continuità

PrognosiTasso

di

cura

oltre

80%

PatobiologiaEziologia ancora ignotaCellula B alterata30% EBV è riscontrato nella cellulaRS

Linfoma di Hodgkin: un problema biologico

High-throughput tissue microarray analysis of G1-cyclin alterations in classical Hodgkin's lymphoma indicates overexpression of cyclin E1. Tzankov A, Zimpfer A, Lugli A, Krugmann J, Went P, Schraml P, Maurer R, Ascani S, Pileri S, Geley S, Dirnhofer S.J Pathol. 2003 Feb;199(2):201-7.

Microarrays tissutali: analisi di una popolazione eterogenea (Hodgkin’s)

Reed Sternberg cells

Linfomi

Non HodgkinNeoplasie linfoidi che interessanoprimariamente le sedi dell’ “homing”linfoide normale

LNDMILZAM.A.L.T.

40.000 casi/anno, 20000 morti/anno

Aspetti cliniciMassa senza doloreCompressione ed infiltrazione di organi viciniInterferenza con le funzioni normali, nel caso diinfiltrazione di altri organiSintomi sitemici

FebbreSudorazione notturnaPerdita di pero

Quadro leucemico se c’è infiltrazione midollare

Precedenti classificazioni

RapaportKielWF

R.E.A.L./W.H.O. Classification

REAL/WHO è una classificazione clinico-patologica complessaCell lineage: B v T v NK v Histiocytic

Stadio di maturazione della presuntacontroparte normale. Include caratteristiche immunologiche e molecolari e non solo morfologicheInclude anche leucemie linfoidi

LINFOMI B

•Leucemia/linfoma da precursori B- linfocitari Leucemia linfatica cronica a cellule B/linfoma a piccoli linfociti Leucemia prolinfocitica B Linfoma linfoplasmocitoide Linfoma a cellule mantellari Linfoma centrofollicolare: a piccole cellule, a grandi cellule, diffuso a piccole cellule Linfoma B della zona marginale: extranodale (MALT), a cellule monocitoidi, splenico (con o senza linfociti villosi) Leucemia a cellule capellute Mieloma multiplo Linfoma B diffuso a grandi cellule Linfoma B a grandi cellule primitivo del mediastino Linfoma di Burkitt Linfoma B ad alto grado simil-Burkitt

LINFOMI T

Leucemia/linfoma da precursori T- linfocitari Leucemia linfatica cronica a cellule T Leucemia prolinfocitica T Leucemia a grandi linfociti granulari: a linfociti T, o tipo NK Micosi fungoide/sindrome di Sezary Linfomi periferici a cellule T: cellule medie, misto (medie e grandi), grandi; cellule linfoepiteliodi; linfoma T associato a panniculite sottocutanea Linfoma epatosplenico a linfociti T g/d Linfoma T angioimmunoblastico Linfoma angiocentrico Linfoma T intestinale (associato o meno a enteropatia) Leucemia/linfoma a cellule T dell’adulto Linfoma anaplastico Ki+ a grandi cellule: a cellule T, null, tipo “non Hodgkin

WHO 2000.

Origine delle malattie linfoproliferative: la visione morfologica

REAL/WHO classification- ossaturaNeoplasie B cellulari

Precursori B cellulari- correlati a leucemieacuteLinfomi B cellulari periferici- la maggior partedei linfomi

Neoplasie T/NK cellulariPrecursori T cellulariLinfomi T/NK periferici

Linfoma di Hodgkin

Frequenza

NHL Composti da cellule che hanno perso la capacità dicompletare il progetto di differenziazione. Ricapitolano la biologia e l’immunofenotipo della cellulanormale da cui derivaAi diversi aspetti citologici ed immunofenotipidiriconoscibili nei diversi stadi di maturazione dellamaturazione della normale cellula linfoide corrispondonodiversi tipi di linfomaDue prinicipali tipi clinici

Linfomi IndolentiLinfomi Aggressivi

Linfomi IndolentiCaratterizzati da processi di apoptosi difettiviDeriavanti da stadi di maturazione cellulare, caratterizzati da lenta crescitaSpesso già diffusi alla diagnosiStoria naturale lunga, sopravvivenza mediana >5 anniRispondono generalmente a chemio e radio-terapiaGeneralemte ricadono, ma rispondono ad altre terapieAllo stato sono considerati incurabili, tranne che in casodi

Malattia localizzataTrapianto di midollo

Linfomi AggressiviCaratterizzati da processi difettivi di controllo del ciclo cellulareDerivanti da stadi d maturazione cellulare, caratterizzati da rapido accrescimento cellularePiù spesso localizzatiPiù spesso extranodaliBreve storia naturale; sopravvienza mediana </= 2 anniRichiede terapie aggressive per la remissioneCurabile in alcuni casi

Approssimativamente 30-40% tra gli adulti50-80% tra i bambini/adolescenti

IndolentiSLL/CLLLinfoma follicolare, Gradi 1/2Linfoma MALT-typeLinfoma nodale dellazona marginaleLinfoma splenico dellazona marginaleHairy cell leukemiaLinfomaLinfoplasmaciticoMielomaPlasmacitomaLinfoma cutaneo TLinfoma cutaneoCD30+

AggressiviLeucemia B prolinfociticaLinfoma diffuso a grandi cellule BLinfoma di BurkittLinfoma mantellareLinfoma anaplasticot/nullLinfomi T periferici

StadiazioneDefinisce l’estensione, determinando la scelta terapeuticaEsame clinico, esami strumentali e biopsia midollareSistema di staging di Ann ArborSintomi B - febbre, perdita di peso > 10% , sudorazonenotturna

Staging table

PrognosiInternational prognostic index

International Prognostic Index 1

Survival curves

Neoplasie dei precursori B cellulari

Linfoma/leucemia dei Precursori B cellulariDeriva da celule allo stadio linfoblastico didifferenziazione, antigene- independente dellacellula B (normalmente midollare) Leucemia con o senza coinvolgimento linfonodaleTrattate come leucemie acute

80% il tasso di cura tra I bambini20-30% il tasso di cura tra gli adulti, per la presenza di alterazioni citogentiche correlate con maggiore aggressività (es. CromosomaPhiladelfia)

Linfomi

B perifericiDerivano dai diversi stadi di maturazione e differenziazione antigene- dependente

della cellula B

Neoplasie

Periferiche

B-cellulariSLL/CLL- cellula B vergineLeucemia prolinfocitica- una variante clinica più aggressiva dellaprecedenteLinfoma linfoplasmacitico- cellula della risposta immune primariaLinfoma della zona mantellare- cellule della zona mantellare intorno aifollicoliLinfoma foliclare-cellule del follicoloLinfoma della zona marginale extranodale- cellule del MALTLinfoma della zona mantellare nodale- zona mantellare nel linfonodoLinfoma della zona mantellare nodale- zona mantellare nella milzaLeucemia a cellule capellute- cellula pre-plasmacellulalLinfoma diffuso a grandi cellule-cellule post-germinaleiLinfoma di BurkittMieloma- plasmacellule midollariPlasmacitoma- plasmacellule extramidollari

Linfoma FollicolareClinica

Tra I più frequenti linfomi>40 anni (età mediana 59 anni)Generalmente diffuso alladiagnosiRisponde alla terapiaRicade frequentementeOAS a 5 anni=72%Possibile trasformazione in tipi più aggressivi (DLBCL)G3 ha una prognosi sovrapponibilea quella dei DLBCL

Patogenesi: t(14;18)(q32, q21)

Overespressione dellaproteina antiapoptoticaanti-apoptotic protein Bcl2

Linfoma follicolareDiagnosi

Pattern follicolarePiccole e grandi cellule, clivate e nonPositive:Monoclonal light chain, CD19, CD10, bcl6, Bcl2

Negativi: CD5, CyclinD1/Bcl1

PCR e FISH per t(14;18)

Table X: Indolent B cell lymphomas

Follicular Lymphoma (Grade I)

Marginal zone Lymphoma

Small lymphocytic lymphoma/CLL

Frequency (% all lymphomas

22% 8 7

Age of onset median

59 61 65

Stage at Presentation

Stage III/IV Disseminated

Stage I Stage IV

Response to Therapy

Good to most treatments, but incurable short of transplant

Frequently curable

Similar to Follicular lymphoma

5 yr survival 72% 74% 51%

Predominant site presentation

Nodal Extranodal Marrow/nodal

Pattern of nodal Infiltration

Follicular Diffuse Diffuse

Benign cell Equivalent

Germinal center small cleaved cell

Marginal zone Lymphocyte

Virgin B cell

Dominant cell type

Small cleaved cell in most cases, but can be large cell

Mix of small lymphocytes, plasma cells

Small lymphocytes with round nucleus

Immunopheno -type

Positive: CD19 CD10, Bcl2+ Negative: CD5-

Positive: CD19, Bcl2 Negative: CD10, CD5

Positive: CD19, CD5 CD23 Negative: CD10

Molecular Pathogenesis

t(14;18) Bcl2/JH

t(11;18), Trisomy 3

Trisomy 12

Linfoma

Diffuso

a grandi

cellule BClinica

30% NHLEtà mediana 64 anniFrequentemente localizzataRapida crescita della massa neoplastica40% curabile con terapie aggressive/ trapianto delle

cellule staminali

PatogenesiDiverse anomalie citogenetiche, ma nessuna specifica

Diffuse Large B cell lymphoma

DiagnosiPatern diffusoGrandi cellule, con nucleo ovale o inciso, cromatina dispersa e 1-3 nucleoliImmunofenotipo dlela cellula B

Linfoma di BurkittClinica

3% dei linfomiEtà mediana 31 anniIdentificato in Africa daThomas Burkitt

Associato a EBV Localizzazione allammandibola

N paesi occidentali sipresenta nella regioneileocecal~70-80% dei bambini sono curabili così come il40% degli adulti

Patogenesi:t(8;14), con overespressionedell’oncogene myc, un regolatoredel ciclo cellulare

Origine delle malattie linfoproliferative: il correlato molecolare

Nature 403, 503 - 511 (03 February 2000); doi:10.1038/35000501

Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profilingASH A. ALIZADEH*†, MICHAEL B. EISEN†‡, R. ERIC DAVIS CHI MA , IZIDORE S. LOSSOS¶, ANDREAS ROSENWALD, JENNIFER C. BOLDRICK*, HAJEER SABET, TRUC TRAN, XIN YU , JOHN I. POWELL#, LIMING YANG#, GERALD E. MARTI§, TROY MOORE , JAMES HUDSON JR , LISHENG LU**, DAVID B. LEWIS**, ROBERT TIBSHIRANI††, GAVIN SHERLOCK‡, WING C. CHAN, TIMOTHY C. GREINER , ENNIS D. WEISENBURGER , JAMES O. ARMITAGE‡‡, ROGER WARNKE¶¶, RONALD LEVY, WYNDHAM WILSON, MICHAEL R. GREVER, JOHN C. BYRD, DAVID BOTSTEIN‡, PATRICK O. BROWN*,18 & LOUIS M. STAUDT

Biologia Molecolare. Il profilo di espressione genica identifica sottotipi prognostici di linfoma diffuso a grandi

cellule

Linfoma di BurkittDiagnosi

L’equivalente benigno è la piccola cellula non clivatareplicante del centrogerminalePattern diffusoAlto indice mitotico; Enorme numero di macrofagi(aspetto a cielo stellato) Citologia: nucleorotondeggianteImmunophenotype:

Positive: CD20, CD10Negative: CD5

Linfoma mantellareClinica

6% dei linfomiEtà mediana 63 anniGeneralmente disseminatoalla diagnosiScarsa risposta allaterpiaOAS 27% a 5 anni

Patogenesit(11;14)overespressione diciclina d1, regolatore del ciclo cellulare

Linfoma

della

zona

mantellareDiagnosi

Controparte benignazona mantellareCellula rotondeggiantePattern diffusoImmunofenotipope:

Positivi: CD20, CD5, Ciclina d1and Bcl2Negativi CD10, CD23

The proliferation gene expression signature is a quantitative integrator of oncogenic events that predicts survival in mantle cell lymphomaA. Rosenwald, et. al. CANCER CELL : 2003. 3:185-197

Una selezione di 20 geni costituisce una “Proliferation Signature” di valore prognostico nei linfomi mantellari

Linfoma dei precursori T cellulari

ClinicaadolescentiSi presenta come una leucemia o con massamediastinica +/- coinvolgimento midollarecurabile: ~70%

diagnosiContropartebenigna cellule T vergini del timoPattern diffusoCitologia blasticacon nucleoovalareMarkers T

Linfoma

dei

precursori

T cellulari

Linfomi TPrevalentementeleucemici/disseminati

Leucemia dei prolinfociti TLeucemia a grandi cellule granulariLeucemia a cellule NKLeucemia/linfoma a cellule T dell’adulto

Prevalentemente nodaliLinfoma T angioimmunoblasticoLinfoma T periferico, non specificatoLinfoma T/Null anaplastico

Prevalentementeextranodale

Micosi fungoideSindrome di SezaryLinfoma cutaneo CD30+Linfoma T panniculiticoLinfoma NK/T, nasale e nasal-typeLinfoma intestinale TLinfoma T epatosplenico

Aspetti chiave dei linfomi TClinica

20% di tutti I linfomiSpesso extranodaliLa maggior parte a scarsaprognosi

Patogenesi:Anaplastic large cell lymphoma- t(2;5): gene ALK1 Linfom T epatosplenicoIsocromosoma 7

DiagnosiAnaplastic large cell lymphoma --> OAS 77% 5 year survival Micosis fungoide, indolente

ImmunofenotipoVariabile espressione deimarkers T cellulari

Studi ancillariStudi immunologici

CitofluorimetriaImmunoistochimica

Metodiche di biologia molecolarePCRFISH

Strategia

I linfomi

riproducono

l’immunobiologia

della

controparte

normaleTale riproduzione

può

essere

aberrante

L’espressione

normal o aberrante

può

essere

usata

per :Determinare lineage, B versus T versus NKDetectare la clonalitàIdentificare la malignità in caso di perdita o aberranteespressione di determinati antigeniIdentificare il sottotipo di linfoma

Antigeni di superficieLa risposta immunitaria richiede il contributo dinumerosi fattori che si trovano sulla mambrnaplasmatica delle cellule immunocompetentiSono classificati in B associati, T associati, associatiall’attivazione e recettori di chemochineL’espressione è variabile in rapporto alla sequenza dimaturazione linfoideCatalogati in CD - clusters of differentiation – seguitoda un numero

B cell antigen expression

T cell antigen expression

Tecniche immunologiche

Flow cytometryImmunoistochimica

IMMUNOISTOCHIMICA

Lymphoma Surface immuno-globulin

CD5 CD10 CD20 CD23 CD43 CD103 Cyclin D1

Chronic lymphocytic leukaemia or small lymphocytic lymphoma

+ + – + + + – +/–

Hairy–cell leukaemia + – – + – + ++ +/–

Follicular lymphoma + – + + +/– – – –

Mantle–cell lymphoma + + – + – + – +

Diffuse large B–cell lymphoma

+/– – +/– + NA +/– NA –

Burkitt's lymphoma + – + + – – NA –

MALT lymphoma + – – + +/– +/– – – ++, More than 95% positive; +, More than 90% positive; +/–, 10–90% positive; –, less than 10% positive; NA, not applicable; MALT, mucosa-associated lymphoid tissue.

Il fenotipo delle malattie linfoproliferative: classificazione diagnostica con significato terapeutico

Tecniche molecolariClonalitàRiarrangiamenti cromosomici

Tessuto linfoideSangue periférico

TdT TdT TdTmu

B progenitrice

Pre-pre-B Pre-B B immatura B matura B attivata Plasmacel.

IgH riarrangiato

IgL riarrangiato

Midolloosseo

Mantello Centro germinativo

TCR gamma riarrangiato

Céllula linfoide proecursore

Pro- timocito

Timocito immaturo

Timocito comúne

Timocito maturo

T maturoTdT TdTCD3

TdTCD3

TdTCD3

TdTCD3

TdTCD3

TCR delta riarrangiato TCR delta deleto

TCR beta riarrangiatoTCR alfa riarrangiato

Midolloosseo

Timo(corticale)

Timo (midollare)

Sangue periférico

Tessuto linfoide

LinfocitoTH

LinfocitoTS

Clonalità

dei processi linfoproliferativi

Tutte le neoplasia sono proliferazioni clonaliTutte le cellule B e T presentano riarrangiamento genico del recettore antigenico

CH CH

COO¯COO¯

COO¯COO¯

+H3

N +H3

N

+H3

N +H3

N

-S-S-

-S-S-

-S-S- -S-S-CL C L

VL V L

C LCL

Vα

Cβ

Vβ

Cα

Ig TCR

Recettore antigenicoCellule B: Immunoglobulina

Cellule T: Recettore della Cellula T (TCR)

• 2 catene leggere: kappa o lambda• 2 catene pesanti:μ

(IgM) δ

(IgD) γ

(IgG) α

(IgA) ε

(IgE)

• Regioni

variabili

(V) e

constanti

(C) CH CH

COO¯COO¯

COO¯COO¯

+H3

N +H3

N

+H3

N +H3

N

-S-S-

-S-S-

-S-S- -S-S-CL C L

VL V L

C LCL

• Proteina

di

membrana• Eterodímeri:

• Catene

α/β

(95 %)• Catene

γ/δ

(5 %)

• Regioni

variabili

(V) e

constanti

(C) • Si associa

alla

molecola CD3

Vα

Cβ

Vβ

Cα

TCR CD3

γ δ ε

Organizzazione genomica dei geni delle Ig e TCROrganizzazione genomica dei geni delle Ig e TCR

IgH14q32

VH1 VH2 .... VHn DH1-15 JH1-6 Cμ

Cδ

Cγ3 Cγ1 Cε1 Cα1 Cγ2 Cγ4 Cε

Cα2

VK1 VK2 .... VKn JK1-5 CKIgκ

2p11Vλ1 Vλ2 .... Vλn J C1 J C2 J C3 J C4 J C5 J C6

Igλ22q11

Vα1 Vα2 ...Vαn Vδ1 Vδ2 ...Vδn Dδ

Jδ

Cδ

Jαn CαTCR α/δ14q11

Vβ1 Vβ2 ....Vβn Dβ

1 Jβ1 C β1 Dβ

2 Jβ2 Cβ2TCR β7q34

V1 V2 ..... V8 VA V9 V10 VB V11 V12 Jγ1 C γ1 Jγ2 C γ2

1 2 3 1 2

TCR γ7p15

Riarrangiamento di TCRγ

: primersRegión Secuencia

TCR V2 5’ CTTCCTGCAGATGACTCCTACAACTCCAAGGTTG 3’

TCR V3 5’ CTTCCTGCAGATGACGTCTCCACCGCAAGGGATG 3’

TCR V4 5’ TCCCCTGCAGATGACTCCTACACCTCCAGCGTTG 3’

TCR V5 5’ TTCCTGCAGATGACGTCTCCAACTCAAAGGATG 3’

TCR V8 5’ CTTCCTCGAGATGACTCCTACAACTCCAGGGTTG 3’

TCR V9 5’ GGNACTGCAGGAAAGGAATCTGGCATTCCG 3’

TCR V10 5’ CTCTGCAGAATCCGCAGCTCGACGCAGCA 3’

TCR V11 5’ CACTGCAGGCTCAAGATTGCTCAGGTGGG 3’

TCR V12 5’ ACTCTGCAGCCTCTTGGGCACTGCTCTAAA 3’

Jγ 1.3, 2.2 5’ AAGTGTTGTTCCACTGCCAAA 3’

Jγ 1.1, 2.1 5’ AGTTACTATGAGC(T/C)TAGTCCC 3’

Jγ 1.2 5’ TGTAATGATAAGCTTTGTTCC 3’

Mix I: V2, 8 + V3 + V4 + V9Mix II: V5 + V10 + V11 + V12Mix III: Jγ1 - Jγ2

PCR 1: Mix I + III : Tm 59ºCPCR 2: Mix II + III : Tm 55ºC170-200 pb

V1 V2 ..... V8 VA V9 V10 VB V11 V12 Jγ1 C γ1 Jγ2 C γ2

1 2 3 1 2

Mix I, Mix II Mix III5’ 3’ 3’ 5’

Organizzazione e riarrangiameno dei geni IgHOrganizzazione e riarrangiameno dei geni IgHVH1 VH2 .... VHn DH1-15 JH1-6 Cμ

Cδ

Cγ3 Cγ1 Cε1 Cα1 Cγ2 Cγ4 Cε

Cα2

VH1 VH2 .... VHn DJ Cμ

Cδ

Cγ3 Cγ1 Cε1 Cα1 Cγ2 Cγ4 Cε

Cα2

VDJVDJ Cμ

Cδ

Cγ3 Cγ1 Cε1 Cα1 Cγ2 Cγ4 Cε

Cα2

1o riarrangiamento

2º riarrangiamento

VH DH JHDH

N N

Cμ

Struttura della regione variabile del gene IgH

Fr1 Fr2CDRI CDRII CDRIIIFr3 Fr4

VH DH JH

N N

•Zone

ipervariabili:

Regioni

Determinanti

la

Complementarietà

(CDR)•Zone

più

consevate:

Framework

(Fr)

•Inserzioni

“N”•Regioni

di

unione

(J)

Fr1 Fr2 Fr3

Primers per detectare il riarrangiamento monoclonale di IgH

CDRII: 230-300 pbCDRIII: 70-150 pb

CDRIII Fr4

VH N DH N JH CH

CDRII

5’ 3’

5’ 3’

3’ 5’

3’ 5’

Regione Sequenza

CDRII (Fr2) 5’ TGG(A/G)TCCG(C/A)CAG(G/C)C(T/C)(T/C)CNGG 3’

CDRIII (Fr3) 5’ ACACGGC(C/T)(G/C)TGTATTACTGT 3’

JH 5’ TGAGGAGACGGTGACC 3’

PCR

Riarrangiamento di IgH

Pattern di clonalità:

Riarrangiamentopoliclonale

Riarrangiamentomonoclonale

Riarrangiamentooligoclonale

LYMPHOMA-

SPECIFIC GENETIC ALTERATIONS (GATEKEEPER GENE).

LYMPHOMA GEN TRANSLOC. FUNCTION

Follicular Bcl2 IgH Apoptosis Inhibitor

Mantle Cyclin D1 IgH Promotes G1/Stransition.

DLBCL Bcl6 IgH GC Formation

Lp Im Pax5 IgH Homeobox

MALT API2 11;18 Apoptosis reg

MALT Bcl10 IgH Apoptosis inhibitor

Burkitt c-myc Ig genes Transcription factor

La diagnosi morfologica

Linfoma di Burkitt Linfoma follicolare

L’immunoistochimica acquisisce un nuovo ruolo

Espressione di bcl-2 in un linfonodo

normale

Espressione di bcl- 2 in un linfoma

follicolare

Follicular lymphoma

Bcl2

CyclinD1

Mantle cell lymphoma

1976

t(8;14)nei

Burkitt

La morfologia guida l’indagine citogenetica e molecolare

Cloning of C-Myc

1982 1987

Cloning of bcl-2

FISH: Applicazioni in oncologia

Targetterapeutico

Valoreprognostico

Diagnosi

FISH

FISH in ematopatologiaDiagnosi

Valoreprognostico

ApplicazioniTerapeutiche??

FISH

Traslocazioni: linfomi e leucemieLeucemie:

Linfomi:

BCR/ABL [t(9;22) M-BCR] BCR/ABL [t(9;22) m-BCRBCR/ABL [t(9;22) µ-BCR]AML1/ETO [t(8;21)]

PML/RAR [t(15;17)] CBFß/MYH11 [inv(16)] MLL/AF4 [t(4;11)] E2A/PBX1 [t(1;19)] TEL/AML1 [t(12;21)]DEK-CAN [t(6;9)]

ALK/NPM [t(2;5)] BCL2/IgH

[t(14;18) MBR] BCL2/IgH

[t(14;18) mcr] BCL1/IgH

[t(11;14) MTC] API2/MLT [t(11;18)]

FISH: leucemie

Traslocazioni• t (9;22) o bcr/abl nelle LMC (leucemie mieloidi croniche)• t (15;17) o PML/RARA nelle LE (leucemie acute)• t (12;21) o TEL/AML1 nelle LA (leucemie acute B)

Trisomie e monosomie•trisomia cr.8 : nelle leucemie mielocitiche acute•trisomia cr.12: nella leucemia linfocitica acuta•monosomia cr.7: nei disordini mieloproliferativi

Delezioni-20q nei disordini mieloproliferativi-5q nelle leucemie mieloidi

acute

FISH: linfomi

Traslocazioni

• t (14,18) linfoma follicolare

• t (11; 14) linfoma mantellare

•

t (11; 18)(q31;q31) & t(14;18)(q21;q31) linfoma marginale

extranodale tipo MALT

• t che coinvolgono il gene bcl6

• t(2;5) linfoma anaplastico

•T(8;14) linfoma di Burkitt

Differenziazione linfoide B

Tessuto linfoideSangue periferico

TdT TdT TdTmu

Cellula B progenitrice

Cellula Pre-pre-B

Cellula Pre-B

Cellula B immatura

Cellula B matura

Cellula B attivata

Plasma- cellula

HLA-DRCD34

HLA-DRCD34CD19CD22CD10

HLA-DRCD34CD19CD22CD10CD20CD79a

HLA-DRCD19CD22CD20CD21CD5SIgMCD79a

HLA-DRCD19CD22CD20CD21SIgM,DCD79a

HLA-DRCD19CD22CD20SIgM,G, ACD79a

HLA-DRCD38CD79a

IgH riarrangiato

IgL riarrangiato

Midolloosseo

Mantello Centro germinativo

Linfoma mantellare

T(11;14)

Linfoma follicolareT(14;18)DLBCLT(bcl6)

traslocazioni

Cromosomi normali

traslocazione

FISH

Diagnosi

• Dubbia diagnosi anatomopatologicaFenotipo ambiguo

IHC non convincente

• Follow-up

dei pazienti con diagnosi “molecolare”

certa

Caso 1

CD23 bcl2

Diagnosi:Linfoma follicolare

FISH t(14;18)

t (14;18)

Cro

18q21 (BCL2 SpectrumOrange*)

Cro

14q32 (IGH SpectrumGreen*)

* Sonde Vysis: LSI IGH SpectrumGreen

/ LSI BCL2 SpectrumOrange

Linfoma follicolare (LF): PCR

t(14;18) FISH t(14;18) PCR

Caso 1Cnt+

# # #

•Splenomegalia: CM 25X16X9

•MO: infiltrazione neoplastica

•Splenectomia diagnostica e terapeutica

Caso 2

Ciclina D1 CD5

Diagnosi:Linfoma Mantellare

FISH t(11;14)

t (11;14)(q13;q32,3)

Cro

11q13 (CCND1 SpectrumOrange*)

* Sonde Vysis: LSI IgH

SpectrumGreen

/ LSI CCND1 SpectrumOrange

Cro

14q32,3 (IgH

SpectrumGreen*)

Linfoma mantellare :PCR

Foto t(11;14) FISH

Foto t(11;14) PCR

Ctr+

Caso 2

FISH Prognosi

•Linfomi

t(11;18) associata a bcl10 nucleare MALT lymphoma

t(14;18) (q21,q31) MALT Lymphoma

17p del, 13q del, 11q del e trisomia 12 in SLL/LLC

T(11;18)(q21,q21)frequente in casi di MALTomi gastrici

localmente avanzati

Frequente associazione con BCl10 nucleare

Frequente associazione con MALTomi

H. pylori negativi

Non responder all’eradicazone di H. pylori

Liu

H, et

al. Blood

2001; 98:1182-1187

Ye

H, et

al, Blood

2003; 101:2547-2550

SLL/LLC

17p del (p53): pz con ridotti intervalli liberi da trattamento

13 q del (RB? E LAMP1): pz con aumentati intervalli liberi da

trattamento

11 q del (ATM): pazienti con avanzato stato di malattia

Dohner

H, N Engl

J Med

2000; 343:1910-6.

11q del

11q green17p orange

13 q orange(q14.3) e aqua (q34)12 cep green