Lezione III-IV martedì 9-11-2010

corso di genomica

laurea magistrale Biotecnologia Industriale

aula 6orario : Martedì ore 14.00 - 16.00

Giovedì ore 13.00 - 15.00

D. Frezza

uso dell’informazione

col sequenziamento c’è stata l’illusione di poter sapere veramente tutto dei genomi e dell’informazione genetica,ma è nata la genomica perchè si capiva che il problema era più complesso

polarismi scoperta con i sequenziamenti

procarioti ed eucarioti : variazione e conservazione

mettiamo insieme queste due evenienze formamlmente in opposizione.

abbiamo visto che esiste una polarità una discrepanza logica che appare spesso in naturala polarità è compatibile senza dover eliminare una delle due?come possiamo rendere compatibile una contrapposizione così forte?

la risposta la sapete già: è possibile

i meccanismi che rendono possibile abbiamo detto che giocano sulla variabile tempo

gestire il polarismosalviamo il polarismo utilizzando questa contraddizione,possono coesistere entrambe: variabilità e conservazione

il primo nei tempi lunghi, il secondo nel tempo breve

Abbiamo già detto: era implicita in Mendel la conservazione era implicita in Darwin la variabilità delle specie una nell’altra

quando è stata scoperta la mutagenesi si è aperta una nuova finestra per interpretare questi due fenomeni

la variabilità come mutazione

In the 1920s, Hermann Muller discovered that x-rays caused mutations in fruit flies. He went on to use x-rays to create Drosophila mutants that he used in his studies of genetics. He also discovered that x-rays not only mutate genes in fruit flies but also have effects on the genetic makeup of humans.[1] The first mutagens to be identified were carcinogens, or cancer-causing substances. Early physicians detected tumors in patients more than 2,000 years before the discovery of chromosomes and DNA. In 500 B.C., the Greek Hippocrates named crab-shaped tumors cancer, meaning crab.

1 Campbell, Neil A. and Jane B. Reece. Biology. 7th ed. San Francisco, CA: Pearson Education, Inc, 2005.

scoperta legata ad un evento tragico

chi scoprì il fenomeno legato alla variabilità genetica se ne accorse associando l’uso di sostanze tossiche belliche ad eventi di trasformazione genetica: le mutazioni

prima Muller con Drosofila e raggi X, poi UV e poi la chimica: mostarda azotata, azoiprite ed altre in seguito, scoperte dalla Charlotte Auerbach

mutagenesi chimica

The discovery of Mustard Gas by Charlotte Auerbach and Robson Science. 1947 Mar 7;105(2723):243-7.The Chemical Production of Mutations.Auerbach C, Robson JM, Carr JG.

Nature. 1946 Mar 9;157:302.Chemical production of mutations.AUERBACH C, ROBSON JM.

Perspectives on genetics: anecdotal, historical, and critical ... - Google Books ResultJames Franklin Crow, William F. Dove - 2000 - Medical - 723 pagesJune 1993 The Discovery of Mustard Gas Mutagenesis by Auerbach and Robson in ... had been obtained from experiments on chemical mutagenesis prior to 1940. ...books.google.it/books?isbn=029916604X...

bilanciato il polarismo

possono coesistere variabilità e conservazione

studio dei genomi tramite sequenziamento completo

slancio nella ricerca genomica e sviluppo di nuove tecniche

nuove applicazioni di tecniche già note per sveltire i metodi

i genomi a disposizione

procarioti compatti ma senza meiosi (aploidi)

eucarioti con nuove strutture per la diploidia

la complicazione a partire dagli eucarioti unicellulari

lieviti, funghi, (Saccharomyces, Neurospora)

strutture di base invariate già dai procarioti:

RNA, ribosomi, tRNA, polimerasi membrane,

le nuove evidenze:

la conoscenza negli eucarioti

strutture paraloghe nelle nuove funzioni

(omologie analogie)

ma le nuove strutture ancora non si conoscono

si parte dai geni, ma sono il 5%

TUTTO IL RESTO é nuovo e questa è GENOMICA

si sapeva che c’era il DNA ripetuto: trasposoni, regioni GC rich, mini e microsatelliti e poi?

i meccanismi dell’evoluzione elementare

i processi evolutivi sono lontani da essere compresi nella complessità

alcuni sono evidenti dalle analisi genomiche più semplici

come abbiamo detto i confronti “evolutivi” ci aiutano

i confronti ci parlano del rapporto tra funzione e strutture

i geni divergono e si duplicano

Geni ortologhi e geni paraloghi

Geni ortologhi: geni simili riscontrabili in organismi correlati traloro. Il fenomeno della speciazione porta alla divergenza dei genie quindi delle proteine che essi codificano.es. la -globina di uomo e di topo hanno iniziato a divergere circa80 milioni di anni fa, quando avvenne la divisione che dette vita ai primati e ai roditori. I due geni sono da considerarsi ortologhi.

Geni paraloghi: geni originati dalla duplicazione di un unico gene nello stesso organismo.es. -globina e -globina umana hanno iniziato a divergere inseguito alla duplicazione di un gene globinico ancestrale. I due geni sono da considerarsi paraloghi.

variabilità per divergenza

Gene ancestrale

duplicazione genica

Gene A

Gene B

speciazione

ortologhi

paraloghi

Gene A1 Gene A2

Gene B1

Specie 1

ortologhi Gene B2

Specie 2

alla scoperta del genoma:

allontanandosi dai geni

alla ricerca delle funzioni: analogia con il periodo precedente alla scoperta del codice genetico

interpretazioni: studi attraverso i confronti su modelli

i modelli sono validi perchè è esistita l’evoluzione

conclusione: il genoma è dinamico a breve e lungo termine

come ha fatto ad attrezzarsi per poter evolvere?

(geni < del 5% del genoma)

come mai si usano organismi modello: ribadiamolo

è possibile perchè ci sono:

- i geni ortologhi (stessa origine nell’ancestrale e divergenza nelle specie successive), hanno la stessa funzione nelle specie diverse- i geni paraloghi derivano da duplicazioni e possono mantenere funzioni simili (DNA binding, kinasi ecc.)

(l’evoluzione rimane la premessa inevitabile)

l’unica spiegazione sembra

autocelebrativa, tautologica

il genoma non poteva esistere senza interazione (per definizione)

se la vita è nata nel mondo ad RNA e poi è venuto il DNA ed ha cominciato ad interagire con proteine diventandone dipendente, ma anche il responsabile, l’informazione genetica non poteva non essere dinamica.

come sarebbe il genoma non interattivo?

da dove parte l’interattività del genoma

non c’è funzione che non preveda interazione con altre strutture ed enzimi, l’informazione passa attraverso interazioni

- potrebbe risultare passivo quando deve essere replicato/duplicato; la struttura rende possibile ogni altra funzione che già conosciamo o che è ancora da individuare

- sembra passivo ma non lo è nemmeno per la sintesi dell’mRNA, manda segnali e ne riceve continuamente

cambia strutturalmente : per il differenziamento: epigenetica

meiosi: gameti: zigote: embrione: adulto

interazione del genoma nelle varie fasi

sotto il nome della regolazione

la struttura (anatomia)

informazioni per le funzioni

anche solo per la trascrizione la cromatina si altera

la trasformazione inizia molto prima della trascrizione

trascrizione = una delle funzioni finali

non c’è soluzione di continuitàl’interazione non è saltuaria

tutto il ciclo vitale di ogni organismo prevede interazione dinamica

ad ogni passaggio il DNA-cromatina subisce trasformazione, alterazioni

dallo zigote alle mitosi al differenziamento, ogni fase prevede quella successiva,il genoma riceve messaggi continuamente per sapere se fermarsi, procedere e cambiare funzioni

ovvio ma fondamentale

l’interazione genoma “ ambiente “ è continuo

gli stimoli devono permettere la reattività

ci deve essere esecuzione del programma

ci deve essere flessibilità

il programma può andare avanti se c’è “feedback” positivo

bidirezionalità della trasformazione funzionale

genoma (cromatina)

ambiente: nucleo, citoplasma, extracellulare.....ecc.

quando il genoma si attiva è perchè c’è l’ambiente giusto per far partire determinate funzioni

come si inserisce la variabilità

le differenze esistono, si sono accumulate,

ad ogni meiosi si rimescolano

ogni organismo che nasce ha un genoma “ricombinante”

cosa comporta questa diversificazione

microvariabilitài polimorfismi :genetica quantitativa

interattoma (non solo tra proteine)

turn-over (rapidità-lentezza)

effetti a cascata (attivazioni tramite trasformazioni post-traduzionali: fosforilazioni, metilazioni, glicosilazioni ecc.)

modulazione dovuta ad effetti dei polimorfismi(osservati col confronto tra fenotipi/genotipi)

trasduzione del segnale tipica dell’interazione intra-extra cellulare e citoplasmatica - nucleare

dal nucleo al genoma e viceversa (ciclo continuo)

andata e ritornol’informazione arriva all’informatore e riparte(difficile separare i ruoli nel ciclo continuo)

è un artificio porre un inizio e scegliere lo zigote come start-point, si potrebbero prendere i gameti o le gonadi o l’individuo adulto

la trasduzione del segnale mette in comunicazione le varie parti della cellula e quindi dell’organismo

ogni punto di un ciclo può essere scelto come inizio o fine

adesso prendiamo il genoma come nostro riferimento

come possiamo approcciare il genoma in maniera globale

la post genomica (di già?)dopo il sequenziamento dei genomi interi

ancora una volta si scopre di non sapere

è l’inizio del salto verso la genomica regolativa / o dello studio del genoma non tradotto

è riduttivo credere che si conosca il genoma conoscendo solo la porzione codificante

conseguenza: una parte del trascrittoma non è noto ignorando una bella parte delle funzioni del genoma

post genomica non significa che la genomica sia superata,va capito che non basta conoscere le sequenze genomiche

approcci globali e olistici

nuove metodologie

trascrittoma

proteoma - interattoma

ma il restante 95%?

95% ? wide genome screening

screening con tecniche diverse

studio nuovo

cosa si può analizzare

in che maniera

genomica obbligatoriamente porta al confronto tra i vari possibili organismi modello o intraspecie

centralità del modello umano oppure riferimento al modello umano (ricchezza di polimorfismi)

ricerca di modelli per trovare semplificazioni e generalizzazioni

cosa si vuole vedere ?

strutture e variabilità

micro-arrays per ibridazione

resequencing shot-gun parziali o globali

SNPs e VNR

ogni 500 bp del genoma

i vari approcci

i diversi modelli permettono di produrre i nuovi approcci e le diverse tecniche

dalle domande generali a quelle più specifiche o ai meccanismi sottostanti

allargare l’interattoma anche alla interazione col genoma

pensare in maniera globale

cercare di essere onnicomprensivi (presuntuoso ma necessario)

il problema globale

rischio di genericità tutto o niente

lo studio con le libraies è stato l’inizio

i metodi globali: osservazioni col grand’angolo

necessità di non perdere anche i particolari

guardare dal satellite ma con una risoluzione altissima

osservazione diretta e indiretta

in quasi tutte le scienze si passa alla oservazione indiretta

il DNA o le proteine non le vediamo, abbiamo prove indirette

ci fidiamo delle osservazioni indirette ed il metodo passa attraverso l’uso dei controlli ossia della contraffabilità del risultato

convergenza delle osservazioni e riprove

l’uso di organismi modello come riprova della universalità

osservazioni riproposte anche su organismi di specie diverse

difficoltà di riscontrare patologie in organismi molto diversi

possibilità di osservare fenotipi simili in organismi anche molto diversi

generalità di un fenomeno

troppi esempi

a riprova dell’universalità dei promotori eucariotici e procariotici : tutti i costrutti inducibili o costitutivi transfettati

cosa possiamo fare per capire il genoma nell’era post-genomica

mantenere la capacità di analisi nelle interazioni/variazioni

nel contesto e fuori contesto

in vitro veritas

fenotipi mutanti e polimorfismi

dove si guarda

cercando le funzioni genomiche

creazione di esche per trovare con cosa interagiscono

riprova in vivo con l’organismo transgenico per avere una conferma

approccio simmetrico

da un fenotipo ricerca del fenomeno da riprodurre in vitro

verificare se lo stesso costrutto interagisce con le stesse proteine

tentativi non sempre di successo con two hybrid systemsle tecniche hanno delle approssimazioni

esca e oggetto interagente