Informe de Biotecnologia Alfa Amilasa

8/12/2019 Informe de Biotecnologia Alfa Amilasa

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CTEDRA : BIOTECNOLOGA

CATEDRTICA : Mg Sc. Ing. Norma Gamarra Mendoza

INTEGRANTES : BAQUERIZO CHUQUILLANQUI, Guilliana

CHOQUE MENDOZA, Sheyla Laura

CORILLA HUAMN, Gaby

HUANQUIS ALBINAGORTA, Lourdes

LLACUA CHVEZ, Fabiola

PALOMINO CESAR, William Ezer

2014

EXTRACCIN Y ACCINCATALTICA DE LAS

AMILASAS

Facultad de Ingeniera en Industrias Alimentarias

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL

PER


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BIOTECNOLOG

EXTR CCIN Y CCIN C T LTIC DE L S MIL S S

2.1. ALMIDNProbablemente no existe otro compuesto orgnico tan ampliamente distribuido

en los vegetales como el almidn. Es el producto de asimilacin ms importante

de la fotosntesis y constituye la principal sustancia de reserva delos vegetales.

Qumicamente el almidn o fcula es un polisacrido homogneo que est

formado por una mezcla de dos polisacridos estructuralmente diferentes:

amilosa y amilopectina.

AmilosaEs una molcula lineal compuesta por 250 a 300 unidades de -

D-glucopiranosa enlazadas por uniones 1-4.- La

AmilopectinaEs ramificada, constituida por 1.000 a 3.000 unidades de glucosaconectadas por uniones 1-4 y 1-6 en los puntos de ramificacin.

El almidn se encuentra en abundancia en:- Gramneas

(cereales): trigo (Triticum sativum); arroz (Oryza sativa); maz

(Zea mays;); avena (Avena sativa); centeno (Secale cereale);

cebada (Hordeumvulgare).- Leguminosas (legumbres): porotos

(Phaseolusvulgaris); arvejas (Pisumsativum); lentejas (Lens

sculenta), etc.- Solanceas: papas (Solanumtuberosum).Industrialmente se le obtiene por va hmeda a

partir de ellos.

2.1.1. Caracterstica y propiedadesSe presenta como polvo blanco fino, inspido,constituido por granos

caractersticos microscpicamente para cada especie.Para su

caracterizacin se toma en cuenta: tamao (aprox. 2-150 u),


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forma,hilio o ncleo, estratificaciones; granos simples o compuestos y

aspectos a laluz polarizada.El almidn es insoluble en agua fra; en agua

caliente se hincha formandoengrudo; se tie de azul a azul violeta con

sol. R lugol; da glucosa como producto final de la hidrlisis total.

(Smith L. y Cristol S.; 1990).

Grafico 1. Representacin esquemtica del Almidn.Fuente: Smith L. y Cristol S. (1990).

Grafico 2. Representacin esquemtica de una molcula de amilopectina..., lmite de la degradacin inicial por la -amilasa y confn de la dextrina-I;- - - -, lmite de la segunda degradacin por la -amilasa, y confn de la dextrina-III;(representa el lmite de la degradacin de la -glucosidasa para dar dextrina-II). R, esun grupo reductor terminal.Fuente: Smith L. y Cristol S. (1990).


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2.2. ALFA y BETA-AMILASA.El nombre de diastasas corresponde a un sinnimo de las amilasas, aunque se

usa principalmente para designar la alfa-amilasa, que se extrae de cereales.

Origen de alfa-amilasa: Fngico (Aspergillus oryzae), bacteriano (B.stearothermophilus, B. subtilis), de cereales y del pncreas.

Origen de beta-amilasa:cereales, soya y camote.La enzima alfa-amilasa se encuentra en poca cantidad en el trigo y abunda ms

en aquel que ha sido parcialmente germinado. La beta-amilasa, por elcontrario, se encuentra en gran cantidad en este cereal.

Acciones:Como es sabido, el almidn est formado por la fraccin amilosade cadena

recta de molculas de glucosa unidas por enlaces glucosdicos alfa-1,4; en tanto

que la fraccin amilopectina, adems de la cadena recta, presenta

ramificaciones con enlaces glucosdicos 1,6.

La alfa-amilasa cataliza la hidrlisis de la cadena lineal (amilosa) y la

ramificada (amilopectina) del almidn, rompiendo enlaces 1,4 interiores

(endoamilasa) para formar una mezcla de dextrinas; por ello se la conoce

como enzima dextrinognica (mezcla de amilodextrina, eritrodextrina,

acrodextrina y maltodextrina) con poca produccin de maltosa.

Por su accin, la alfa-amilasa provee de fragmentos menores que pueden ser

utilizados por la enzima beta-amilasa. La enzima alfa-amilasa requiere de un

activador como, por ej., cloruro de sodio. Es sensible a una acidez elevada y

se vuelve inactiva a pH 3,3 o a pH menor a 0C por 15 min. El pH ptimo

de accin est dentro del rango 5-7, siendo de 6,5 para la alfa-amilasa

bacteriana y pancretica. La enzima es resistente al calor, pues a 70C

conserva un 70% de su actividad. Acta sobre almidones crudos ygelatinizados.


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La beta-amilasa se la conoce con el nombre de enzima sacarognica, puesacta sobre la amilosa, rompiendo unidades 1,4, dando maltosa. Sobre la

amilopectina acta en las uniones alfa-1,4 de la cadena recta, y detiene su

accin a distancia de 2 unidades de glucosa antes de atacar las uniones alfa-

1,6. Se trata de una exo-amilasa, ya que acta sobre el terminal de la

molcula; mientras la amilosa es transformada totalmente en maltosa, la

cadena ramificada de la amilopectina se conserva en un 40-45% sin hidrolizar

(38).

La beta-amilasano necesita de activador para actuar, pero es menos estable alcalor, inactivndose a 70C por 15 min. El pH ptimo de la beta-amilasa es

de 4,5.

Aplicaciones:El uso de la alfa-amilasa para mejorar el valor panificador de harinas se basa

en el hecho de que un adecuado y mantenido desprendimiento de anhdrido

carbnico depende de la cantidad de maltosa y glucosa fermentescibles queestn presentes en la masa, y cuya formacin depende, a su vez, de la accin

sincronizada de la alfa- y la beta-amilasa; en mejor forma que por adicin de

extracto de malta usado tambin para este objeto. Mientras los cereales

germinados contienen ambas enzimas, muchas harinas de trigo son deficientes

en alfa-amilasa, siendo entonces conveniente su adicin.

La alfa-amilasa de origen fngico(como es la que se obtiene por crecimiento

del micelio del Aspergillus oryzae en fermentadores de cultivo sumergido que

permiten una agitacin y una aireacin intensa), aunque puede ser menos

potente que la de bacterias o de cereales, se puede obtener con baja actividad

de proteasa (desdobladora del gluten) y de maltasa, conservndose as la

maltosa, esencial para la fermentacin. La presencia de una cantidad suficiente

de alfa-amilasa durante el esponjamiento y fermentacin de la masa, tiene las

siguientes ventajas:


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mayor contenido de azcares fermentescibles en la masa;

aceleracin de la fermentacin

desprendimiento gaseoso, mayor y uniformemente mantenido

aumento del volumen y textura del pan con una miga de porosidad

ms fina y de costra ms uniforme y ms coloreada.

La alfa-amilasa de origen bacteriano es ms estable al calor que la de hongos y

de cereales, de manera que no se inactiva totalmente en el horno panificador.

Por este motivo, su adicin debe ser bastante cuidadosa para evitar una

sobreproduccin de dextrina residual y con ello una miga gomosa y pegajosa

(38, 40). Por otra parte, una actividad residual de la alfa-amilasa bacteriana en

el pan tiene la ventaja de suministrarle una mejor conservacin, al restringir

durante el almacenamiento del pan la retrogradacin de su almidn, causante

del envejecimiento. Al sustituir la adicin, de la amilasa por extracto, jarabe o

harina malteados, debe tenerse presente la relativa termo-resistencia de su

alfa-amilana y su considerable actividad proteoltica, cuyas desventajas se han

sealado anteriormente.

Maldonado y Guerrero (2000); realizaron un ensayo experimental sobre

hidrlisis cida y enzimtica del almidn, y para confirmar azcares reductores

realizaron la reaccin de Benedict, lo realizaron en un bao de agua hirviendo

por 5 minutos, retiraron los tubos y observaron; en el cuadro 1 reportaron sus

resultados.

Cuadro 1. Resultados hidrlisis cida y enzimtica del almidn.

Fuente: Maldonado y Guerrero (2000).


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En la hidrlisis cida se produce un rompimiento total de los enlaces que

mantienen unido a los monmeros del almidn y se forma glucosa, maltosa,

isomaltosa.

En la hidrlisis enzimtica se produce un rompimiento parcial de los enlaces

que mantienes unido a las unidades del almidn y se formar maltosa, glucosa

y dextrina lmite que es una cadena ramificada.

2.3. RECONOCIMIENTO QUIMICO DE LA GLUCOSA.

El reconocimiento qumico de los principios inmediatos es una prctica de laque no debera abusarse en el medio escolar, dado que sus resultados no son

fcilmente explicables en dicho mbito pedaggico. De todos modos, resulta

interesante realizar algn ensayo de los de tipologa ms conocida.

Presentamos aqu el clsico reconocimiento de la glucosa por medio de la

solucin de Fehling.

La solucin de Fehling se prepara como sigue:

Sol. A: 17.3 gr. De sulfato de cobre en 250 cc. De agua destilada.

Sol. B: 86.5gr. de tartrato sdico-potsico en 125 cc. De aguadestilada.

25 gr. De hidrxido potsico en 125 cc. De aguadestilada.

Las soluciones A y B se guardan por separado. Para constituir la solucin de

Fehling se mezclan ambas soluciones inmediatamente antes de su utilizacin.

La mezcla se realizar a partes iguales.

Para comprobar la reaccin con licor de Fehling, se prepara una solucin de

glucosa a la que se le aade la solucin de Fehling, se prepara una solucin de

glucosa a la que se le aade la solucin de Fehling y se calienta la mezcla al

bao Mara. Se producir un precipitado rojizo de xido de cobre, reaccin

tpica de la glucosa. Como complemento, podemos verificar que la citadareaccin no se produce con la sacarosa. (Nogus, 1988).


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3.1. MATERIALES: 100 g de Trigo Almidn de papa

Reactivo de Fehling A y B Tubos de ensayo

Vasos de precipitacin Gradilla


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Fiola Probeta

Pipetas

Varilla de vidrio

Matraces Centrifuga

Papel filtro pH - metro


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3.2.- MTODOa Extraccin de B-Amilasa de trigo Remojado del trigo

Una vez seleccionado (separacin de pajas y semillas extraas) se pes lasemilla (250-500g), se lav con agua potable, seguidamente se remojo enun recipiente hasta alcanzar el 45% de humedad, por un tiempo de 6-8h,a temperatura ambiente, se cambi el agua al menos 3 veces paraoxigenar el material, luego se retir el agua y se coloc las semillas enpapel absorbente por 30 minutos.

GerminacinLas semillas con 45 % de humedad en peso se colocaron en bandejas parala germinacin y se sometieron en el germinador en donde se mantuvo auna temperatura de 16 C, con una humedad relativa de 100%. Una vezque el acrospiro alcanzo de a o 9 mm de longitud del grano sedetuvo la germinacin.


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MoliendaLas semillas se molieron en un moulinex, hasta obtener una partcula de0,5 a 0,7 mm de tamao, se asegur que la corteza pajosa este molida.

DilucinLas semillas molidas de diluyeron en una proporcin de 1:2, se agita, sefiltra y centrifuga a 5000 rpm. El sobrenadante tuvo que ser transparente,seguidamente se guard en tubo falcon esterilizado en congelacin hastael momento del anlisis.


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b Ensayos hidrolticos Preparacin del sustrato

Se prepar una suspensin de almidn al 15 % (P/V) Y pH =5, se mezclbien y se llev a coccin por 30 minutos a temperatura de ebullicin otambin se pudo haber auto clavado a 120C por 15 minutos. Se enfri yse tom alcuota para los ensayos de hidrolisis enzimtica y acida.

Hidrolisis enzimtica y acidaSe realiz en tubos de prueba con tapa rosca, se utiliz un equipo debao mara, durante la hidrolisis y se agito en intervalos de tiempo de 15minutos.


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Brix inicial antes de la hidrlisis)

Brix final Despus de la hidrlisis)Acida amilasa salival amilasa amilasa y

amilasaBlanco

Brix 8,2 2,4 3,2 3,0 1.0

Resultados de la accin b iocataltica de las amilasasLos resultados de son cualitativa, esencialmente en la coloracin, para la cualse muestra la siguiente tabla

Acida amilasasalival

amilasa amilasa y amilasa

Blanco

Hidrlisis No hubo Si Si Si NoColor Celeste Rojo ladrillo Rojo

ladrilloRojo ladrillo Azul

BrixMuestra antes de la hidrlisis 3


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Al agregar el Fehling A y B se observ el cambio de color de azul a un rojoladrillo por lo que se puede decir que hay presencia de azcares reductores.

Discusiones:Segn Nogus (1988) refiere que la solucin de Benedict (y la solucin del

mismo gnero de Fehling que contiene el ion complejo de tartrato cprico),dan un precipitado rojo ladrillo de cuando oxidan a una aldosa. Losazcares que dan pruebas positivas con las soluciones de Tollens o Benedictse conocen como azucares reductores.

Segn Smith L. y Cristol S. (1990)., en la cebada predomina la beta amilasa,suficiente para producir los azucares necesarios para el desarrollo de los

microorganismos; durante el malteado, que es una germinacin controladadel grano, se producen las enzimas de alfa amilasa y beta amilasa, cuyaactividad conjunta sobre el almidn se conoce como actividad diastsica.

Smith L. y Cristol S. (1990) nos dice que los cereales como la enzima alfa-amilasa en su accionar degrada la amilosa en maltosa y pequeoscompuestos de glucosa. Sin embargo, esta enzima solo es capaz de degradarparcialmente la amilopectina y el glucgeno debido a que no es capaz dedesdoblar los enlaces glicosidicos 1-6 encontrados en los puntos de

ramificacin de la cadena del polisacrido.

La accin de la alfa amilasa sobre los almidones presentes en los granos decebada depende de la estructura granular porosa que puedan tener y que loshaga accesibles a la enzima.

La hidrlisis de la amilosa produce oligosacridos de bajo peso molecularabarcando desde maltosa a maltohexosa dependiendo del origen ynaturaleza de la amilosa. Siendo una amilasa sacarognica, el almidn se

hidrolizara inicialmente a dextrinas y posteriormente a maltosa y glucosa,que son azcares libres diferencindola as de las amilasas liquificantes que nolos producen.

Los grnulos de almidn en la cebada estn compuestos casi enteramente deamilopectina, recubiertos por una capa delgada de protena y exteriormentepor una capa delgada de celulosa, por lo que requiere un proceso de rupturapara facilitar el ataque enzimtico. La hidrolisis de la amilopectina produceglucosa, maltosa y una variedad de dextrinas alfa limitantes ramificadas que

contienen enlaces alga 1,6 del polmero original; al estar presente la alfa


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amilasa experimental, los almidones presentes se hidrolizan parcialmenteproduciendo dextrinas que originan un color pardo al reaccionar con iodo.


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De lo realizado en la prctica, se llega a las siguientes conclusiones:

Se consigui la extraccin de amilasas, mediante la germinacin de cereales.

La amilasa, tiene mayor actividad hidroltica que la amilasa.

Una combinacin de y amilasas, muestran una alta actividad enzimtica, a

comparacin de las mismas por separado.

La hidrolisis acida, no reacciono con el reactivo de Felhing, debido a que el

acido utilizado, no tena la pureza requerida.


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Smith L. y Cristol S. 1990. Qumica Orgnica. Primera edicin. Editorial

Revert.

Maldonado N. y Guerrero L. 2000. Facultad de Ciencias Qumicas.

Universidad de Guayaquil.

Nogus R. 1988. La observacin de los seres vivos. Primera edicin. Editorial

Universidad Autnoma de Barcelona.

http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas

/schmidth02/parte07/08.html
http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/schmidth02/parte07/08.htmlhttp://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/schmidth02/parte07/08.htmlhttp://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/schmidth02/parte07/08.htmlhttp://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/schmidth02/parte07/08.htmlhttp://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/schmidth02/parte07/08.html


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a Desarrollar y explicar el mecanismo bioqumico de hidrolisis enzimtica de laalfa, beta y acida del almidn.Hidrlisis del almidn. Como actan las enzimas

La hidrlisis implica la ruptura de un enlace mediante la adicin en medio del

mismo de los elementos del agua. Los polisacridos de la dieta se metabolizan

mediante hidrlisis a monosacridos. La mayora de los pasos de la degradacin

de almidn a glucosa pueden ser catalizados por tres enzimas distintas, si bien hay

otras ms que se necesitan para completar el proceso. Las tres primeras enzimasson una -amilasa, -amilasa y almidn fosforilasa. Al parecer solo la -amilasa

puede atacar grnulos de almidn intactos, por lo que cuando participan la -

amilasa y la almidn fosforilasa, es probable que acten sobre los primeros

productos liberados por la -amilasa. La -amilasa ataca de manera aleatoria

enlaces 1,4 en las molculas de amilosa y amilopectina, al principio creando

huecos al azar en los granos de almidn y liberando productos que aun son

grandes. En cadenas de amilosa no ramificadas, el ataque repetido por la -amilasa produce maltosa, un disacrido que contiene dos unidades de glucosa. Sin

embargo, la -amilasa no puede atacar los enlaces 1,6 localizados en los puntos

de ramificacin de la amilopectina, por lo que la digestin de amilopectina cesa

cuando an quedan dextrinas ramificadas con cadenas de longitud corta. Muchas

-amilasas son activadas por Ca+, lo cual es una de las razones por las que el

calcio es un elemento esencial.

La -amilasa hidroliza al almidn en -maltosa; la enzima acta primero solo

sobre los extremos no reductores. La -maltosa cambia con rapidez, por

mutarrotacin, para formar las mezclas naturales de isomeros y . La hidrlisis

de amilosa por la -amilasa es casi completa, pero la degradacin de

amilopectina es incompleta porque no son atacados los enlaces de los puntos de

ramificacin. La actividad de ambas amilasas implica la incorporacin de una

molcula de H2O por cada enlace roto, por lo que son enzimas hidrolasas.


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Figura 1: hidrolisis enzimtica de la alfa

b Cuales son las ventajas y desventajas de la hidrolisis qumica e enzimticadesde el punto de vista tecnolgico, ambiental, econmico y alimentario.HIDRLISIS ENZIMTICA

Ventajas Y desventajasLa hidrlisis enzimtica en los ltimos 30 aos ha desplazado la hidrlisis cida,

debido a que se dispone de nuevas enzimas. Hoy en da la mayor parte de la

hidrlisis de almidn se realiza usando enzimas, ya que esta tcnica presenta ventajas

como: Control de la formacin de productos no deseables y mayor flexibilidad del

producto.

La hidrolisis enzimtica, dichos azucares pueden ser aprovechados en laproduccin de alcohol etlico para diferentes propsitos como la produccin

de bebidas alcohlicas

Mejores expectativas de futuro: Proceso especifico Altos rendimientos


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HIDRLISIS CIDA

Ventajas Y DesventajasLa hidrlisis cida del almidn a glucosa es una tcnica que tiene muchas desventajas:

Formacin de productos no deseables y flexibilidad muy pobre (el producto final

slo se puede modificar cambiando el grado de hidrlisis), por ltimo es necesaria

que el equipo resista el cido y las temperaturas requeridas durante el este proceso.

c Cul es la importancia de la hidrolisis del almidn desde el punto de vistaalimentario, farmacutico y qumico.

La importancia de la hidrolisis del almidn desde el punto de vista alimentario,

farmacutico y qumico se encuentra en gran variedad de aplicaciones industriales,

algunas de ellas se indican en la Figura 2:

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