LEUCOCITOSI

PARAFISIOLOGICHE

E PATOLOGICHE

Raffaela Mazzone

S.S. Ematologia e Coagulazione

Dipartimento di Diagnostica

ASO OIRM Sant’Anna

Torino 11/02/2011

Nostro target : valutazione dei Globuli Bianchi non solo quantitativa, soprattutto qualitativa

MIDOLLO OSSEO

Analisi morfologiche

ANALISI CITOFLUORIMETRICHE

3-GRAN

2-MONO

1-LYMPH

4-BLAST

5-ERY

Analisi citogenetiche..

PHILADELPHIA

1969

….e molecolari

Morfologia normale

Anomalie degli eosinofili e dei monociti

Revue : “Aspect cytologique normal et pathologique du sang chez le nouveau-né et le jeune enfant “

Ann Biol Clin 2006;64(1):17-36

multinuclearità

IPOGRANULARITA’

LEUCOCITOSI NEUTROFILA POLIGLOBULIA INCREMENTO Hb ed Ht MACROCITOSI

RETICOLOCITOSI AUMENTATA

LEUCOCITOSI PARAFISIOLOGICHE : NEONATO NORMALE

Morfologia del neonato normale

Neutrofilia ,eritrocitosi,policromasia

LEUCOCITOSI PARAFISIOLOGICHE : GRAVIDANZA

LEUCOCITOSI NEUTROFILA

Talora presenza in circolo di precursori mieloidi

conteggio WBC

…nella “norma”..

….??!!

Solo allarme morfologico, non alterazioni numeriche : LLA

WBC : 6.68

CCCCCC

Al m.o.linfociti attivati e grandi linfociti

reattivi:10%

Solo allarme morfologico, non alterazioni numeriche :VIROSI EBV

WBC normali LINFOCITOSI modesta LLA

Importanza delle proporzioni tra le popolazioni leucocitarie

Ambulatoriale esterno: febbricola persistente MI

Al m.o.: linfociti attivati e grandi

Linfociti reattivi: 17%

WBC normali no linfocitosi ma flag morfologico : EBV

DEA : FEBBRE

LLA in LEUCOPENIA

NEUTROFILIA > 7.500 /8.000 / mm3

LINFOCITOSI > 9.000 lattanti

> 7.500 bambini

> 4.000 adulti

EOSINOFILIA 500-1.500 lieve –moderata

> 1.500 severa

MONOCITOSI bambini > 1.200

adulti > 1.000

BASOFILIA > 100

#

%

HARRISON

NEUTROFILIA ASSOLUTA mesi 24

INFEZIONE BATTERICA ACUTA

…..DOPO 3 GIORNI POST ANTIBIOTICI

EMOCROMO e F.L.nella norma per l’età

Nel bambino spesso la NEUTROFILIA

si accompagna a PIASTRINOSI reattiva

linfocitosi:>7.500/mm3

BAMBINO VIROSI NON EBV

MESI 19

linfocitosi:> 7.500/mm3

Nel bambino : virosi EBV

Anni 4

Anni 18 ricovero per trauma alle molinette

Conta WBC nella norma ma: linfocitosi assoluta , spiccata neutropenia

Al m.o. : 44 % di blasti di aspetto linfoide : LLA

linfocitosi:> 4.000/mm3 Anni 18

linfocitosi:>4000/mm3

Nell’adulto: disordine linfoproliferativo cronico

adulto

WBC normali LINFOCITOSI modesta LLA

Importanza delle proporzioni tra le popolazioni leucocitarie

WBC normali LINFOCITOSI modesta LLA

Importanza delle proporzioni tra le popolazioni leucocitarie

Definizione

Valori

normali

Eosinofilia

lieve

Eosinofilia

moderata

Eosinofilia

grave

Neonato < 700/mmc 700-1000/mmc 1000-3000/mmc >3000/mmc

Valori

normali

Eosinofilia

lieve

Eosinofilia

moderata

Eosinofilia

grave

Bambino < 350/mmc 350-1500/mmc 1500-5000/mmc > 5000/mmc

Patel L. Acta Paediatr, 1994

Rotenberg ME. Annu Rev Immunol, 2006

EOSINOFILIA E MONOCITOSI RELATIVE e TRANSITORIE

POST CHEMIOTERAPIA

Anni 3 EOSINOFILIA severa transitoria, regredita al controllo dopo 3 settimane

•Unico data anamnestico : antibiotico terapia per una parotite ( ?):

al m.o. linfociti reattivi

SOSPETTA GASTRITE EOSINOFILA

Sospetta forma idiopatica

DIFFICILE DIAGNOSI DI JMML

LEUCOCITOSI con NEUTROFILIA

CRITERIO DI DIAGNOSI PER JMML

splenectomia

MONOCITOSI ASSOLUTA CRITERIO DI DIAGNOSI PER JMML

Mattere caso di Raso Gaia

ASPETTI MORFOLOGICI DI

JMML

PROBLEMATICA DEI VALORI DI RIFERIMENTO

SESSO

ETA’

ETNIA

Condizioni e abitudini di vita

Es.gravidanza, periodo neo e perinatale

IMPORTANZA FONDAMENTALE DI VALORI PRECEDENTI DI QUEL

SINGOLO PAZIENTE

“RIFERIMENTO CON SE STESSI!”

Valori Hb correlati

al peso alla nascita

Valori Hb per etnia

VALORI DI RIFERIMENTO

Linee guida SIMEL 2007

Il laboratorio deve fare diagnosi

Nostri strumenti :

1. Colloquio con il clinico

2. Dati anamnestici sintomi e segni

3. Numeri e flags strumentali

4. Osservazioni della microscopia ottica s.p. midollo

5. Citochimica citofluorimetria citogenetica biologia molecolare

PERCORSO DIAGNOSTICO IN LABORATORIO

CONTAGLOBULI di ultima generazione

•Nella CONTA delle cellule gli strumenti sono estremamente

più ACCURATI e PRECISI dell’uomo

•Nell’ interpretazione, valutazione al m.o. e stesura

del REFERTO l’uomo rimane insostituibile

CONTA WBC

ICEBERG di un fenomeno: in circolo è presente solo una minima parte della popolazione totale !!

STUDI di CINETICA sulla granulocitopoiesi: 4 compartimenti:

– MITOTICO MIDOLLARE

– POSTMITOTICO MIDOLLARE ( maturativo e di deposito o di riserva )

– VASCOLARE o EXTRAMIDOLLARE

– ( PMN circolanti e marginali, adesi all’endotelio)

– TESSUTALE

CONTA WBC : metodi di lettura

strumentali • IMPEDENZIOMETRICO ( corrente

elettrica continua a bassa frequenza: volume cellulare )

– RADIO FREQUENZA ( corrente elettrica alternata ad alta frequenza : caratteristiche interne)

– OTTICO ( luce laser con scatter frontale e laterale )

– SCATTER a FLUORESCENZA (illuminazione in fluorescenza di acidi nucleici.)

– CITOCHIMICA automatizzata mieloperossidasi sudan nero

CONTA WBC : metodi di lettura

Gli strumenti, secondo le varie filosofie analitiche, producono NUMERI analizzati da sofisticati software, espressi in CURVE GAUSSIANE , CITOGRAMMI e SCATTERGRAMMI caratteristici per i diversi tipi cellulari

Da cui definizione di

– Popolazioni normali

– Flags di allarme

N.B.: i contaglobuli nella conta delle cellule sono circa 4 volte più precisi di metodi manuali: azzerano quasi l’errore statistico di campionamento contando circa 10.000 elementi per campione!

CONTA WBC : metodi di lettura

Il MEDICO LABORATORISTA ha una più completa visione del campione rispetto ai dati che arrivano al clinico.

Valuta i MESSAGGI DI ALLARME:

– QUANTITATIVI: >o < ai range di riferimento impostati o della linearità di conta dell’analizzatore

– INTERFERENZIALI: mancata separazione di clusters cellulari normali a causa di cellule patologiche o di altre interferenze

– MORFOLOGICI: allarme per cellule immature o atipiche

Schema Scattergram

Principi e Tecnologie : scatter a fluorescenza

Determinazione finale dell'area di Linfociti, Granulociti, Monociti e Ghost

Analisi dei Cluster

Immature Gran

Blasts/ Atypical Lymph

Left Shift

PLT Clumps

Side Scatter

Flu

ore

sce

nza

Segnalazioni Aree Canale Diff

NRBC

Neutrofili

+

V

O

L

U

M

E

-

- Attività perossidasica + Citochimica

automatizzata

Linfociti

+

V

O

L

U

M

E

-

- Attività perossidasica + Citochimica

automatizzata

Monociti

+

V

O

L

U

M

E

-

- Attività perossidasica +

LUC: linfociti

Atipici/ Blasti

+

V

O

L

U

M

E

-

- Attività perossidasica +

Il referto ematologico

In casi selezionati e filtrati dagli allarmi strumentali da:

un attento esame microscopico!

il processo conclusivo di tutto l’iter diagnostico è

Morfologia strumentale +

morfologia al microscopio ottico

• Camere di Reazione “sporche”

• Campione emolizzato

• Eritroblasti (eritroblastosi)

• Eritrociti lisi-resistenti

• Agglutinati Piastrinici

Citoematologia e Automazione III incontro 6-2-1986 Pitfalls e Pseudopitfalls in citometria

L. Pasini, P. Cappelletti, G. Briani, P. Doretto

False Leucocitosi

V.Rocco Benevento

Sovrastima dei

WBC da

Campione

Emolizzato

È dovuto alla

presenza di

stromi cellulari

che vengono

contati, a causa

della loro

disposizione sui

citogrammi, come

WBC.

Nella maggior parte

dei casi, inficia la

conta dei Monociti e

dei Polimorfonucleati

(sovrastima)

Sangue

Midollare

Sovrastima dei WBC da Eritroblastosi

NRBC

Sovrastima dei

WBC da

Eritroblastosi

N

E

O

N

A

T

O

Eritroblastosi fetale e neonatale Il conteggio dei NRBC può

riflettere l’ entità dell’eritropoiesi inefficace

La conta dei NRBC correla con il benessere

neonatale

Un numero alto di NRBC riflette

la gravità e la durata dell’ IPOSSIA Nicolaides et al, Am J Obstet Gynecol 1989

Phelan JP et al Obstet Gynecol 1998

S.Perrone, G. Buonocore Arch Dis Fetal Neonatal 2004

Entità di RETICOLOCITOSI e di ERITROBLASTOSI:

buon indice prognostico

nella malattia emolitica da Rh,

al contrario di quello osservato nella alloimmunizzazione da Ag Kell

Vaughan et al,1994; Weiner et Widness,1996

FALSE LEUCOCITOSI : ERITROBLASTOSI

FALSA IPERLEUCOCITOSI

ERITROBLASTOSI neonatale

ERITROBLASTOSI neonatale

FALSE LEUCOCITOSI :

Eritroblastosi al m.o.

Spiccata eritroblastosi in

alloimmunizzato anti D a basso titolo

e anti ag privato

AL M.O.: NRBC 300/100 WBC

WBC corretti: 10.82 / mm3

FALSE LEUCOCITOSI : ERITROBLASTOSI

FALSE LEUCOCITOSI : ERITROBLASTOSI in Hb S omozigote

WBC CORRETTI: 13.000

NRBC : 53/100 WBC

Pseudoleucocitosi

(pseudolinfocitosi)

da incompleta lisi

dei Globuli Rossi

NRBC

FALSE LEUCOCITOSI

WBC perox

27.940

WBC Baso

17,400

N 29%

E 1%

L 63%

M 7%

PMN 59%

MN 41%

I casi in cui ricorre questa interferenza sono :

• campioni ad alto contenuto di azoto ureico o bilirubina

• campioni di soggetti in trattamento dialitico

• emoglobinopatie con elevato contenuto di HbF (non

confermato da ricerche mirate)

• campioni di neonati o prematuri

• Hb Hammersmith

• Eritrocitosi

• campioni ad elevato contenuto di emoglobina

• HEMPAS

Agglutinati Piastrinici

Un caso relativamente frequente di sovrastima leucocitaria

incorre in presenza di agglutinati piastrinici.

Le variazioni riguardano:

• Le piastrine che sono fortemente ridotte

• Il numero dei leucociti contati sul canale perox che risulta

falsamente aumentato

FALSE LEUCOCITOSI

Sovrastima

WBC da

Agglutinati

Piastrinici

WBC perox 9.920

Nrbc +

Aggregati +

WBC Baso 8.070 PLT 48.000

Grandi PLT ++

MPV 11.6

PDW 80.6

LEUCOCITOSI spiccata LAM

Campione dal DEA : febbre , linfoadenopatia :MI

Al m.o.:linfociti attivati e grandi

Linfociti reattivi :14%

LEUCOCITOSI LINFOCITOSI EBV

LEUCOCITOSI spiccata

LINFOCITOSI spiccata LLA

d

i

a

CCCCCC

LEUCOCITOSI LINFOCITOSI LLA

RUOLO FONDAMENTALE del MICROSCOPIO OTTICO

SPESSO L’ALLARME STRUMENTALE

“ LINFOCITI ATIPICI” è ASSOCIATO

ALL’ALLARME “ BLASTI”

IL LABORATORIO E’ CHIAMATO

OGNI GIORNO A NUMEROSE

DIAGNOSI DIFFERENZIALI

FRA PATOLOGIE INFETTIVE E

ONCOLOGICHE

Allarme Atipici Attivazione linfocitaria

Bambina, 5 anni. MNI. Igrandi linf.reattivi 10%, mielociti 2% Segni di disgranulocitosi a carico dei neutrofili

Uomo, 27 anni. Epatite. linfociti attivati 4%

Donna, 45 anni. Virosi CMV Linfociti attivati.

Allarme “Blasts?”

LMA Blasti

LA Blasti

AREB Blasti

AREB Disgranulocitosi

• Presenza di “linfociti atipici, attivati,grandi

linfociti reattivi “ in strisci di

• sangue periferico

• Aumento del n.° di linfociti nel sangue

(Linfocitosi) , la monocitosi ci può essere o no

ma non è il marcatore morfologico!

Nelle prime due / tre settimane di malattia

CF: aumento del n.° assoluto dei linfociti T CD8+ DR+ attivi contro il virus e causa dei sintomi

MONONUCLEOSI INFETTIVA

Le vecchie dizioni:

Non dovrebbero più essere usate

m.o. linfociti “ normali”

EBV : diversi aspetti morfologici….

…nello stesso paziente

Aspetti monocitoidi

Eterogeneità morfologica

EBV : diversi aspetti morfologici….

EBV : diversi

aspetti morfologici….

Atipie

nucleo-citoplasmatiche

..un altro caso

…un altro caso

elementi attivati in corso di virosi non EBV

elementi attivati in corso di virosi non EBV

LINFOCITI IN

APOPTOSI

Diagnosi differenziale con linfoblasti: con occhi esperti potrebbe

bastare la morfologia

È l’ “ insieme” che fa fare diagnosi ,quasi mai la singola cellula!

S.P.: piccoli blasti linfoidi

Midollo : monomorfismo cellulare

LLA FAB L1

LLA FAB L2

LLA FAB L2: Linfoblasto attenzione alla singola cellula !

Grande linfocita reattivo

emocromi normali??

DIAGNOSI : LLA

FALSA BASOFILIA

emocromi normali??

DIAGNOSI : LLA e

HCL Aspirato midollare : tappeto di linfoblasti

41 ANNI

GRAVIDANZA 15°

SETT

HAIRY CELL

LEUKEMIA

emocromi normali??

F.I. anni 41 16° settimana di gravidanza : cellula capelluta HCL

…quando tutto si complica!!

WBC :124.000

ATTENZIONE!: MORFOLOGIA DA LMA ,

IMMUNOFENOTIPO due cloni uno CALL e uno PREPRE B

con traslocazione 9-22 ( striscio periferico ) Caso 2

Caso 2

Caso 2

Caso 2

CONCLUSIONI DIAGNOSTICHE caso 2

MORFOLOGIA ( DA DISCUTERE! ) : agoaspirato

midollare : midollo osseo completamente invaso da cellule

leucemiche con 2 popolazioni morfologiche: la più numerosa blasti

di piccole e medie dimensioni riconducibili a serie linfoide

( Perossidasi negativi, PAS positivi), l’altra blasti di grosse

dimensioni ,assai immaturi, con rare granulazioni citoplasmatiche,

(Perox neg, PAS debole pos),compatibili con blasti di natura

mieloide ( quella più rappresentata nel periferico!)

IMMUNOFENOTIPO (DA DISCUTERE! ):

ha evidenziato due cloni: uno CALL pos e

uno pre-preB,con pos del marcatore mieloide CD33

CITOGENETICA E BIOLOGIA MOLECOLARE

Positività per il riarrangiamento BCR-ABL t( 9;22) con

espressione di p190

DIAGNOSI DEFINITIVA :

LEUCEMIA ACUTA LINFOBLASTICA ( FAB L2) Ph+,

con coespressione morfologica e

citofluorimetrica di blasti più immaturi esprimenti marcatori mieloidi

TERAPIA : è stato seguito il protocollo EsPhALL ( protocollo europeo per LLA Ph+)

Fase I induzione + Glivec , Blocchi 1-2-3 + Glivec

TMO allogenico il 9/8/2006 da fratello HLA identico

Ancora attualmente remissione continua anche molecolare ( p190 neg)

BUON USO DEI TEST DI LABORATORIO : EBM

.. .. RA Moore, Evidence –based Medicine Jan/Febr 1998 pp 7-8

Think like a clinician! I asked David Sackett, as physician practicing evidence based medicine ,

what he wanted from evidence-based biochemistry.

Sackett expressed 3 desires:

• to discuss a patient’s illness with a colleague

•To abandon reporting of normal ranges

•To have evidence available to support the validity,

importance and clinical usefulness of

biochemical tests

Grazie per l’attenzione!

New Zealand