LE PROTEINE SONO SOSTANZE ANFOTERICHE:la loro carica elettrica netta cambia in funzione del pH

Grazie a questa caratteristica possono essere separate con tecniche elettroforetiche in base a:

• mobilità elettroforetica• punto isoelettrico• massa molecolare

Elettroforesi delle sieroproteine:ELETTROFORESI ZONALE

pH

alc

alin

o e

co

stan

te

Sotto l’influenza di un campo elettrico le proteine, che a pH alcalino hanno carica elettrica netta negativa, migreranno con una velocità proporzionale al rapporto massa/carica dal catodo verso l’anodo.

I supporti solidi possono essere:• Acetato di cellulosa• Gel di agarosio• Gel di poliacrilamide

Le proteine vengono rivelate con l’uso di coloranti specifici quali:• Rosso Ponceau• Nero d’Amido• Blu di Comassie• Violetto HR• Oro colloidale

IDENTIFICAZIONE DELLE MC: ELETTROFORESI CAPILLARE

La separazione avviene in fase liquida a 24°C per 5min a 8000 V. le proteine migrano in base alla carica elettrica e alla ripartizione cromatografica sulle pareti del capillare.

La rivelazione avviene senza ausilio di coloranti tramite misura dell’assorbanza a 214 nm da parte un detector UV posto alla fine del capillare.

Elettroforesi delle sieroproteine:ELETTROFORESI ZONALE su Acetato di cellulosa

Elettroforesi delle sieroproteine:ELETTROFORESI Capillare

Bisalbuminemia

POLICLONALE

MONOCLONALEBICLONALETRICLONALE

• Immunoglobulina intatta• Catena Leggera• Ig intatta + Catena Leggera• Catena Pesante

Un clone può andare incontro ad uno switching di classe e produrre due o più classi di Catene Pesanti, ma ogni clone produrrà solo catene o mai entrambe

POLICLONALE MONOCLONALE

Le Ig monoclonali si possono distinguere dalle policlonali grazie alla loro uniforme mobilità elettroforetica.

IDENTIFICAZIONE DELLE MC:ELETTROFORESI ZONALE

Elettroforesi Capillare

Acetato di Cellulosa

Elettroforesi Capillare

Acetato di Cellulosa

Elettroforesi Capillare

Acetato di Cellulosa

Elettroforesi Capillare

Acetato di cellulosa ?

Elettroforesi Capillare

Acetato di Cellulosa

?

TIPIZZAZIONE DELLE MC: IMMUNOFISSAZIONE

Ele

ttro

fore

si

Incu

bazi

one

con

Ab

spec

ifico

Lava

ggi

Colorazione

Policlonale

G A M

Monoclonale

G A M

G A M

MC: IgG Lambda in quadro oligoclonale

TIPIZZAZIONE DELLE MC: IMMUNOFISSAZIONE

MC: IgG Kappa

G A M

G A M

MC: Catene Lambda libere

M

MC: IgM Lambda

?

TIPIZZAZIONE DELLE MC: IMMUNOFISSAZIONE

MC: IgA Kappa + Kappa libere

TIPIZZAZIONE DELLE MC: IMMUNOFISSAZIONE

G A M D E

MGUS62%

Amiloidosi8%

MM16%

Linfoproliferative3%

Altro4%

MW3%

SMM4%

Gammopatie Monoclonali:casistica della Mayo Clinic

anno 2001n=1068

Kyle RA et al. Rev.Clin.Exper Med 63:225-252,2002

Prevalenza della MGUSPrevalenza della MGUSStudio di popolazioneStudio di popolazione

Popolazione: 21463 Abitanti > 50aaOlmsted County (MIN)

Metodo: Elettroforesi su agarosio IFE su agarosio dei campioni positivi o sospetti per CM

Prevalenza totale : 3.2%

Kyle RA et al. Prevalence of Monoclonal Gammopathy of Undetermined SIgnificance N Eng J Med, 354(13):1362-1369, 2006