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Isolamento Isolamento Esercitazione di microbiologia generale Esercitazione di microbiologia generale

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IsolamentoIsolamento

Esercitazione di microbiologia generaleEsercitazione di microbiologia generale

Per conoscere le le proprietà di specie di Per conoscere le le proprietà di specie di microrganismi che convivono nel medesimo microrganismi che convivono nel medesimo

ambiente dovremo riuscire a:ambiente dovremo riuscire a:

1. Letteralmente separarli fisicamente gli uni dagli altri;

2. Farli crescere separati in laboratorio in condizioni artificiali.

Operazioni fondamentali dell’indagine microbiologica

ISOLAMENTO E COLTIVAZIONEISOLAMENTO E COLTIVAZIONE

1. Letteralmente separarli fisicamente gli uni dagli altri;

2. Farli crescere separati in laboratorio

Isolamento: la separazione di un dato individuo (cellula) Isolamento: la separazione di un dato individuo (cellula) dagli altri individui (popolazione mista naturale di cellule) dagli altri individui (popolazione mista naturale di cellule) con cui convive.con cui convive.

Coltivazione: moltiplicazione del singolo individuo (cellula) suColtivazione: moltiplicazione del singolo individuo (cellula) suun substrato adatto alla crescita così da ottenere alla fine unaun substrato adatto alla crescita così da ottenere alla fine unapopolazione di cellule appartenenti ad un’unica specie.popolazione di cellule appartenenti ad un’unica specie.

Coltura pura o axenicaColtura o popolazione cellulare derivante dalla moltiplicazione di una

singola cellula microbica

Presupposto fondamentale per lo studio e l’identificazione dei m.o., isolati dai vari materiali sottoposti all’esame microbiologico, è quello di disporre di una coltura pura

Per coltura pura si intende l’insieme delle cellule che si

ottengono dalla riproduzione diuna sola cellula iniziale

TECNICHE DI SEMINA E ISOLAMENTO

•diluire il campione iniziale per separare le cellule presenti (isolamento)

•trasferire una singola colonia in un terreno sterile in modo da ottenere una popolazione di cellule identiche (coltura pura)

TECNICHE DI ISOLAMENTO

Per ottenere una coltura pura è quindi necessario:

TECNICHE DI ISOLAMENTO

�ISOLAMENTO PER STRISCIAMENTO

�ISOLAMENTO PER DILUIZIONE SUCCESSIVA

�ISOLAMENTO PER COLTURA MONOCITOGENETICA

ISOLAMENTO PER STRISCIAMENTO

• E’ necessario un terreno agarizzato su piastra Petri

•Si depone sul terreno una piccola quantità del campione da analizzare (popolazione mista)

•Con l’ansa si striscia il campione su tutta la piastra

•Il sistema può variare in relazione al percorso da far seguire all’ansa sulla superficie dell’agar

ISOLAMENTO PER STRISCIAMENTO 1

ISOLAMENTO PER STRISCIAMENTO 2

ISOLAMENTO PER STRISCIAMENTO

Le cellule vengono rilasciate in maniera disuguale:• le « strisciate » iniziali rilasceranno molte cellule che daranno

origine, dopo incubazione, ad una patina

•Il progressivo esaurimento del carico dell’ansa determinerà alla fine la semina di poche cellule separate tra loro.

Terreni di colturaTecniche di semina per isolamento

Semina per isolamento

Terreni di colturaTecniche di semina per isolamento

ISOLAMENTO PER DILUIZIONE SUCCESSIVA

•È necessario preparare una serie di provette contenenti acqua sterile, soluzione salina o terreno liquido

•Il campione viene inoculato in modo tale che ciascuna provetta riceva una certa quantità della sospensione cellulare della provetta precedente

•In questo modo ciascuna provetta rappresenta una determinata diluizione del campione iniziale

ISOLAMENTO PER DILUIZIONE SUCCESSIVA

1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

9 ml 9 ml 9 ml 9 ml 9 mlCampioneiniziale

Diluizione 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

Una certa quantità prelevata da ciascuna diluizione viene depositata su terreno agarizzato già solidificato

Con una bacchetta di vetro si spande il campione su tutta la piastra

A seconda della diluizione le cellule si svilupperanno separate le une dalle altre

ISOLAMENTO PER DILUIZIONE SUCCESSIVA

ISOLAMENTO PER SPANDIMENTO E PER DISSEMINAZIONE

DILUIZIONI

10-1 10-2 10-3 10-4

SEMINA E ISOLAMENTO PER

INCLUSIONE

Piastramento per inclusione: un volume noto di coltura viene pipettato su una piastra Petri sterile, viene poi aggiunto il terreno agarizzato ancora fuso ma non troppo caldo (45-48 °C). Il terreno viene mescolato alla coltura. Viene utilizzato per losviluppo di mo anaerobi

ISOLAMENTO PER SPANDIMENTO

A seconda della diluizione le cellule si svilupperanno separate le une dalle altre

Una certa quantità prelevata da ciascuna diluizione

viene depositata su terreno agarizzato già solidificato

Con una bacchetta di vetro si spande il campione

su tutta la piastra

Isolamento per coltura monocitogenetica

Questo tipo di isolamento permette di poter catturare una

cellula dalla piastra di coltura mediante l’utilizzo di un ago

capillare. In questo modo si ha l’assoluta certezza di aver

isolato una singola cellula

micromanipolatoreCapillare con il quale vengono posizionate le cellule sulla piastra (ingrandimento)

Posizionamento delle cellule su terreno completo. Le cellule sono posizionatea quattro a quattro. I numerie le lettere indicanoLa posizione di ogni cellula

a b c d1234

ID dei microrganismi Aspetto macroscopico delle colonie (1 di 2)

Forma Rilievo

piatto

sopraelevato

convesso

umbonato

sottile, allungatoeffusopuntiforme

circolare

filamentosa

rizoide

irregolare

d < 1 mm

irregolare, a filo intrecciato

irregolare, ramificata

ID dei microrganismiAspetto macroscopico delle colonie (2 di 2)

Superficie Margine

intero

ondulato

eroso

filamentoso

arricciato

liscia

radiata

rugosa

concentrica

rilevata ondulata

anelli concentrici

raggrinzita

ID dei microrganismiCaratteristiche biochimiche

– Capacità di utilizzare determinati substrati come unica fonte di carbonio– Presenza di particolari enzimi– Produzione di specifici prodotti metabolici terminali– Capacità di fermentare particolari zuccheri