La Diagnostica Allergologica Molecolare:

novità e ricadute pratiche nell'ambulatorio del Pediatra

Luciana IndinnimeoDipartimento di Pediatria e NPI

Sapienza, Roma

Dall’estratto alla molecola

Strumenti di primo livello nella diagnostica clinica delle allergie:

Skin Prick Test: Ricerca delle IgE specifiche in

vitro

Rilevano la presenza in vivo delle IgE specifiche Si avvale di metodiche ELISA

Limiti

Differente concentrazione e composizione proteica tra gli estratti allergenici da fonti

definite solo recentemente negli estratti vengono quantizzate (μg/ml) le

concentrazioni delle proteine allergeniche maggiori.

- Impossibilità di stabilire nei pazienti polisensibili se ci sia co-sensibilizzazione o co-

riconoscimento

• Fonte allergenica: contenitore materiale degli allergeni (es. il latte, l’uovo,)

• Allergeni: proteine provenienti dalle fonti allergeniche, possono presentare un elevato numero di determinanti antigenici o epitopi.

• Epitopi: sequenze aminoacidiche lineari o conformazionali riconosciute da uno specifico anticorpo IgE.

Il ripiegamento strutturale è importante per il meccanismo della sensibilizzazione immunologica e nella

relativa risposta anticorpale.

• Allergeni molecolari: molecole allergeniche di cui la fonte è naturale purificata o prodotta con la tecnica del DNA ricombinante

I reagenti sono standardizzati e quantificati (peso in grammi).

ISAC: test multiplo, consente di costruire allergen microarray

Valutazione simultanea delle IgE specifiche per 112 molecole allergeniche purificate, naturali o ricombinanti provenienti da 43 fonti allergeniche

quali polline di erbe, graminacee, alberi, epiteli di animali, alimenti, veleni d’insetto, muffe.

Individua l’esatto profilo di produzione delle IgE specifiche del soggetto in esame.

Il progresso della diagnostica in vitro avviene con l’impiego delle singole molecole allergeniche purificate naturali o

ottenute con i metodi della biologia molecolare e l’identificazione delle IgE specifiche per le singole proteine

(ImmunoCAP)

Per utilizzare correttamente la diagnosi molecolare nelle allergie è necessario conoscerne alcuni aspetti fondamentali

Phleum pratense 1

rPhl p 1

Prime 3 lettere del Genere

Prima letteradella Specie

ordine di identificazione

r = recombinantn = natives = synthetic

Dermatophagoides pteronyssinus 1.016

Der p 1.0101

prime 3 lettere del Genere

prima letteradella Specie

ordine di identificazione

r = recombinantn = natives = synthetic

Der p 1.0123

isoforms

a. similar molecular sizeb. identical biological function, if known, e.g. enzymatic actionc. > 67% identity of amino acid sequences.

Nomenclatura delle molecole allergeniche

Modified da Marsh DG, Bull WHO, 1975

Classificazione delle molecole allergeniche

Allergeni genuini: specie-specifici, caratteristici della specie biologica di appartenenza, possono presentare affinità strutturali notevoli con molecole omologhe ristrette a quella specie.

sono marcatori di sensibilizzazione

Allergeni cross-reattivi: panallergeni, molecole simili (ma non identiche), presenti in specie biologiche anche non correlate.

marcatori di possibile cross-reattività

Panallergeni

• Profilina• Calcium-Binding-Protein• Pathogenesis Related Protein• Lipid Transfer Protein• Storage Protein• Tropomiosina

PROFILINA

Funzione: Proteina conformazionale, con struttura altamente conservata, presente in tutte le cellule eucariotiche. Regola l’aggiunta di monomeri ai filamenti di actina preformata e quindi la cinesi cellulare.

Denaturata dal calore e dalla digestione gastrica.

Famiglie: sono presenti come allergeni minori nei pollini (Graminacee, Betulla, Ambrosia, Artemisia), come allergeni maggiori di molti alimenti di

origine vegetale (Rosacee, Nocciola, Sedano, Arachidi, Pomodoro, Latice).

Significato clinico: vista l’analogia tra profiline appartenenti a specie diverse, la sensibilizzazione verso una può determinare cross- reattività tra diversi inalanti e tra inalanti ed alimenti. Il 10-30% dei pz con allergia alimentare associata ad una pollinosi è sensibilizzato alla profilina.

PROFILINA

• Struttura tridimensionale della profilina del polline di betulla (Bet v 2) e

dell’Hevea brasiliensis (Hev b 8, latice): la struttura si compone di due α-

eliche (in verde) e di un β-foglietto (in giallo) di 5 filamenti antiparalleli.

• Le 2 profiline hanno una omologia di sequenza del 75% (Hauser10).

All’origine della reattività delle IgE specifiche verso le profiline vi è la sensibilizzazione tramite le vie respiratorie ai pollini:

Graminacee (Phl p 12) in Europa centro-meridionale, Betulla (Bet v 2) in nord Europa.

Una volta sensibilizzati, l’ingestione di vegetali con profiline determina usualmente reazioni locali indotte dagli

alimenti in genere crudi: -SOA associata o meno a lieve angioedema -SINDROME POLLINE-ALIMENTI quando c’è un coinvolgimento sistemico in assenza di sintomi orali.

Betulla verrucosa e panallergeni

CBPCBP

Mothes N et al Int Arch Allergy Immunol. 2004 Dec;135(4):357-73 Mothes N et al Int Arch Allergy Immunol. 2004 Dec;135(4):357-73

Termolabile, si associa ad OSA e a reazioni allergiche a frutta e vegetali nell’Europa del Nord

Termolabile, si associa ad OSA e a reazioni allergiche a frutta e vegetali nell’Europa del Nord

Diagnosi di allergia alle profiline

Pazienti polisensibili ai pollini con rinite o asma lieve, con o senza SOA da ingestione di alcuni alimenti:

- I Livello SPT contenente la profilina naturale purificata del polline della palma da dattero che ha una elevata cross-reattività con le altre profiline.

- II Livello mediante la biologia molecolare, ricerca di IgE specifiche effettuata con:

CAP (Phadia) che consente di determinare 3 singole profiline (Bet v2, Phleum p12, Hev b8).

ISAC test che consente la simultanea ricerca delle IgE specifiche verso 5 profiline.

SOA per alimenti + riscontro di IgE specifiche per profiline, in assenza di altri allergeni dei vegetali e della frutta che possono causare reazioni allergiche gravi….

Tranquillizzare il paziente nell’assunzione di quegli alimenti, perché i sintomi non dovrebbero essere mai più gravi della SOA.

• Funzione: proteine conformazionali ubiquitarie tra i procarioti e gli eucarioti,

codificate, ma indotte da situazioni patologiche (agenti infettivi virali, batterici o

fungini) o stress abiotici (ormonali, traumatici o climatici).

Sono sensibili al calore e agli enzimi digestivi.

• Famiglia: rappresentano l’allergene maggiore del polline della Betulla (Bet v1), si

trovano anche in altri pollini ed alimenti vegetali (Rosacae mela, pera, ciliegia,

pesca, albicocca, fragola; Fabacae soia, arachide, fagiolo; Apiacae sedano,

carota).

• Significato clinico: A seguito della sensibilizzazione primaria all’allergene

pollinico della betulla si possono sviluppare sintomi allergici dopo ingestione

di Bet v1 related proteins presenti in numerosi frutti, noci e vegetali, ma

soprattutto con mela e nocciola.

PATHOGENESIS RELATED PROTEINSPR-10

Betulla verrucosa e panallergeni

CBPCBP

Mothes N et al Int Arch Allergy Immunol. 2004 Dec;135(4):357-73 Mothes N et al Int Arch Allergy Immunol. 2004 Dec;135(4):357-73

Termolabile, si associa ad OSA e a reazioni allergiche a frutta e vegetali nell’Europa del Nord

Termolabile, si associa ad OSA e a reazioni allergiche a frutta e vegetali nell’Europa del Nord

Lipid Tranfer proteins (LTP)

Sono veri panallergeni con variabile grado di crossreattività: 36 LTP agiscono come allergeni una volta ingeriti

Fanno parte delle proteine di difesa delle piante contro l’attacco di batteri, funghi, virus e sono ubiquitariamente espresse in tutto il regno delle piante

I più alti livelli di espressione sono stati rilevati nelle cellule periferiche associate con la parete cellulare e con la cuticola dei tessuti epidermici

Per la loro resistenza alla digestione peptica e al calore sono considerati allergeni alimentari che possono causare gravi reazioni (allergeni alimentari di classe 1)

Radauer C et al JACI 2008:121:847-52

Allergia alla nocciola

Proteine di deposito

LTP

Lipid Tranfer proteins

• Famiglia:presenti nella buccia della frutta appartenente alla famiglia delle Rosacee (soprattutto pesca Pru p3), ma anche delle Betulacee (nocciola Cor a8) ed in altri alimenti vegetali (arachide Ara h8, mais, orzo, uva, verza, etc.) Per la loro localizzazione, si ha una maggiore allergenicità nella

buccia rispetto alla polpa.

SEED STORAGE PROTEINS (SSP)• Funzione: proteine quali le 11S globuline (famiglia delle Cupine), le 2S

albumine, come Ara h2 (famiglia delle Prolamine) e le 7S viciline, allergeni PREDOMINANTI nella maggior parte dei semi e della

frutta a guscio come arachidi, soia, noci, semi di cereali. Struttura chimica molto stabile al calore e alle proteasi.

• Significato clinico: marker di rischio per gravi reazioni sistemiche; esse sono di gran lunga il primo allergene alimentare responsabile di gravi reazioni anafilattiche nell’adulto mentre nel bambino sono il terzo allergene alimentare dopo latte e uova.

• Proteine di deposito nel grano: Tri a 18; Tri a 19, una gliadina, conosciuta come ω-gliadina "veloce", responsabile dei quadri di anafilassi correlata all’esercizio fisico.

TROPOMIOSINAProteina di 34-42 kd termostabile Proteina di 34-42 kd termostabile

• Funzione: proteina altamente conservata, presente nelle cellule muscolari e non muscolari di tutte le specie di vertebrati ed invertebrati. Contribuiscono alla contrazione muscolare, al trasporto di mRNA ed al supporto meccanico della cellula. Resistente al calore.

• Famiglia: presente in due phylum del regno animale: artropodi (crostacei, acari, insetti e nematodi) e molluschi; le diverse tropomiosine hanno un’elevata omologia di sequenza le cross-reattività possono assumere significato clinico rilevante.

Cross-reattività

La tropomiosina è l’allergene maggiore dei crostacei e uno dei principali responsabili della cross-reattività tra crostacei, acari, insetti e nematodi.

Der p10 Tropomiosina

Molluschi

Crostacei

Gamberetti: Pen a 1

Granchio: Chaf1 Aragosta:

Pan s1

Calamaro: Tod p1

Ostrica:

Cra g1

Lumaca: Tur c1

Der p 1Der p 1 cysteine proteasecysteine protease 25

Der p 2Der p 2 14 Der p 3 trypsin 28/30 Der p 4 amylase 60 Der p 5 14 Der p 6 chymotrypsin 25 Der p 7 22/28

Der p 8 glutathione transferase

Der p 9 collagenolytic serine pro. Der p 10Der p 10 ttropomyosinropomyosin 36 Der p 11 paramyosin 103 Der p 14 apolipophorin like prot. Der p 20 arginine kinase 40*

Un solo estratto, quante componenti. Un solo estratto, quante componenti.

Allergene KD

Manifestazioni cliniche:

Tropomiosina dei crostacei e molluschi: i sintomi si manifestano al

contatto o all’inalazione (la trop. è ancora presente nei vapori in seguito alla

cottura) con l’alimento; in genere si verificano entro due ore dall’ingestione.

Variano dall’ORTICARIA, SOA, CAPOGIRI, VOMITO, DIARREA, TOSSE

FINO allo SHOCK ANAFILATTICO e FDEIA.

La tropomiosina dell’Acaro (Dep p10) difficilmente è causa di sintomi respiratori.

La sensibilizzazione ai Dermatofagoidi (Der p10) è stata riscontrata in oltre il

90% degli allergici ai gamberetti.

Con la sensibilizzazione alla tropomiosina del gamberetto, la probabilità di

manifestare reazioni all’ ingestione di altri crostacei è alta; dal 38% all’80%.

Solo il 10-15% dei soggetti sono contemporaneamente allergici ai crostacei ed

ai molluschi.

Diagnosi di allergia alla Tropomiosina - CHI?

• Bambini che presentano sensibilizzazione allergica ai crostacei e ai molluschi, all’Acaro

della polvere, agli artropodi e all’Anisakis.

• Bambini con allergia all’Acaro della polvere da sottoporre ad ITS potrebbe essere utile

richiedere l’indagine molecolare per accertarsi che la sensibilizzazione all’Acaro sia

dovuta agli allergeni maggiori (Der p1 o Der p2) e non alla Tropomiosina (Der p10).

Vrtala S, Allergy 2008

Iter diagnostico nell’allergia alimentare

- Anamnesi rigorosa

- E.O. con la presenza di un quadro clinico compatibile

- Test diagnostici in vivo e in vitro (Prick-test, IgE specifiche) che supportano

il sospetto diagnostico ma vanno valutati nel contesto clinico

- Diagnostica molecolare

- Test diagnostico che prevede una dieta di eliminazione e un successivo test

di provocazione: Test di Provocazione Orale (TPO) in doppio cieco

controllato contro placebo (DBPCFC) è il gold standard per la diagnosi.

American College of Allergy, Asthma, & Immunology.Food allergy: a practice

parameter.

Ann Allergy Asthma Immunol 2006; 96:S1-68.

Cosa aggiunge la Diagnostica Molecolare?• Valuta il rischio clinico della reazioneCi permette di valutare il rischio clinico connesso con la sensibilizzazione. La sensibilizzazioni ad allergeni stabili può causare reazioni locali e sistemiche, mentre la sensibilizzazione a componenti labili determina soprattutto reazioni locali

• Spiega i sintomi dovuti alla cross-reattivitàPossiamo distinguere i sintomi dovuti ad anticorpi cross-reagenti, da quelli causati da una sensibilizzazione genuina. Discriminazione tra allergeni maggiori e allergeni minori

• Identifica correttamente i pazienti per la ITS Definendo il profilo di sensibilizzazione e utilizzando un estratto compatibile aumenta le probabilità di successo del trattamento