INTRODUZIONE DEL MONITORAGGIO IMMUNOLOGICO

CMV-SPECIFICO NEI PAZIENTI TRAPIANTATI

Studente:

Dott.ssa Daniela Nozzi

Relatore: Prof. Fausto Baldanti

Correlatore: Dott.ssa Irene Cassaniti

UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI PAVIA

Dipartimento di Scienze Clinico Chirurgiche, Diagnostiche e Pediatriche

Master di II livello

in Diagnostica Microbiologica Avanzata

TRAPIANTO

• Infezioni veicolate durante l’allotrapianto

• Infezioni polmonari • Infezioni in tessuti

devitalizzati, o da raccolte di liquidi non drenati

• Infezioni da patogeni nosocomiali

• Infezioni veicolate durante l’allotrapianto

• Infezioni polmonari • Infezioni in tessuti

devitalizzati, o da raccolte di liquidi non drenati

• Infezioni da patogeni nosocomiali

PERIODO DI MAGGIORE IMMUNOSOPPRESSIONE

TIMELINE DELLE INFEZIONI POST-TRAPIANTO DI ORGANO SOLIDO

• Infezioni residue del primo mese• Infezioni da virus immunomodulanti • Infezioni opportunistiche

• Infezioni residue del primo mese• Infezioni da virus immunomodulanti • Infezioni opportunistiche

Infezioni comuni o rare: • acquisite in comunità• opportunistiche • virali croniche

Infezioni comuni o rare: • acquisite in comunità• opportunistiche • virali croniche

<4 SETTIMANE 1-6 MESI DA 6 MESI a 1 ANNO

IMMUNOSOPPRESSIONE COMPLESSIVA VARIABILE

INTRODUZIONE

INFEZIONE DA CITOMEGALOVIRUS NEI TRAPIANTATI DI ORGANO SOLIDO (OS)

• Principale e grave complicazione nei trapiantati di OS

• Elevato rischio di compromissione d’organo

• Episodi di rigetto e fallimento del trapianto

• Elevata morbidità e mortalità

Risposta Immunitaria:

• Attivazione RI innata e adattativa

• Ruolo centrale dell’immunità

adattativa cellulo-mediata CMV-

specifica (linfociti T CD4+ e

linfociti T CD8+) nel controllo

della replicazione virale-CMV

Fattori di rischio:

• Tipo di organo solido trapiantato

• Sierostato-CMV D/R

• D+/R- maggiore rischio

• Alto grado mismatch HLA D/R

• Regime di immunosoppressione

• Co-infezione con HHV6 o HHV7

PROFILASSI UNIVERSALE

STRATEGIA PREEMPTIVE

MANAGEMENT

Antivirale subito dopo il trapianto (per 3-6 mesi) in tutti i pazienti o in un gruppo di pazienti considerati a rischio

Antivirale subito dopo il trapianto (per 3-6 mesi) in tutti i pazienti o in un gruppo di pazienti considerati a rischio

Terapia antivirale solo in pazienti in cui la CMV DNAemia supera un certo valore di cut-off

Terapia antivirale solo in pazienti in cui la CMV DNAemia supera un certo valore di cut-off

CLINICO DI LABORATORIO

SIEROLOGIA: stratificazione del rischio

D-R- D-R+ D+R+ D+R-

Rischio minore Rischio maggiore

QNAT(Quantitative Nucleic Acid Amplification Testing)

MONITORAGGIO IMMUNOLOGICO della risposta cellulo-mediata CMV-specifica

PRE-TRAPIANTO

POST-TRAPIANTO

SCOPO

PROPORRE UNA METODOLOGIA PER

IL MONITORAGGIO IMMUNOLOGICO CMV-SPECIFICO

NEL PAZIENTE TRAPIANTATO DI ORGANO SOLIDO

SCHEMA OPERATIVO

VALUTAZIONE METODICHE: ricerca bibliografica

1. Principio del saggio2. Prestazioni: sensibilità, specificità,

riproducibilità, risposta funzionale e/o fenotipica, restrizione HLA

3. Procedimento operativo: fattibilità, tempi, materiale

4. Vantaggi5. Svantaggi

1. Principio del saggio2. Prestazioni: sensibilità, specificità,

riproducibilità, risposta funzionale e/o fenotipica, restrizione HLA

3. Procedimento operativo: fattibilità, tempi, materiale

4. Vantaggi5. Svantaggi

METODO IDEALE

1. Riflette la situazione di rischio o malattia da CMV

2. Informazione utile per la scelta clinica e facile da interpretare

3. Informazioni qualitative e funzionali delle cellule T CD4+ e TCD8+ CMV-specifiche

4. Affidabile, sensibile, specifico5. Altamente riproducibile6. Risultati in breve tempo7. Poco costoso8. Adatto a strumentazioni disponibili9. Campioni facilmente reperibili e

trasportabili

1. Riflette la situazione di rischio o malattia da CMV

2. Informazione utile per la scelta clinica e facile da interpretare

3. Informazioni qualitative e funzionali delle cellule T CD4+ e TCD8+ CMV-specifiche

4. Affidabile, sensibile, specifico5. Altamente riproducibile6. Risultati in breve tempo7. Poco costoso8. Adatto a strumentazioni disponibili9. Campioni facilmente reperibili e

trasportabili

IMPLEMENTAZIONE NELLA PRATICA CLINICA DEI TRAPIANTATI DI OS

SCELTA DEL SAGGIO

Valutazione dell’applicabilitàValutazione dell’applicabilità

SOLUZIONI PROPOSTE

MONITORAGGIO IMMUNOLOGICO

APPROCCI NON VIRUS SPECIFICI

CONTA DEI LINFOCITI T CON

CITOMETRIA A FLUSSO STANDARD

IMMUKNOW ASSAY

APPROCCI VIRUS SPECIFICI

COLORAZIONE INTRACELLULARE DELLE

CITOCHINE

COLORAZIONE DEL TETRAMERO pMHC

QUANTIFERON-CMV

ELISPOT IFN-γ

QUANTIFERON-CMV ASSAY

COLORAZIONE INTRACELLULARE DELLE CITOCHINE COLORAZIONE DEL TETRAMERO

ELISPOT INF-γAPPROCCI

VIRUS-SPECIFICI

QUALE SCEGLIERE?

COLORAZIONEINTRACELLULARE DELLE

CITOCHINE

COLORAZIONE DEL TETRAMERO

QUANTIFERON-CMV ELISPOT IFN-γ

MATERIALE Sangue intero, PBMCs PBMCs Sangue intero PBMCs

TEMPO 8-24 h 2-3 h 24 h 48 h

ANTIGENE Peptidi, proteine, lisati Peptidi 22 peptidi CMV Peptidi, proteine, lisati

RISULTATO % cell T, cell T /µl sangue % cell T epitopo-specifiche IFN-γ IU/mlUnità formanti spot per numero

di input PBMCs

FUNZIONE CELLULARE Si No Si Si

FENOTIPO CELLULARE Si Si No No

VANTAGGI

• Parametri fenotipici e funzionali

• Analisi simultanea linfociti T CD4+ e linfociti T CD8+ specifici-CMV

• Nessuna restrizione MHC/peptide

• No stimolazione in vitro

• Elevata sensibilità• Risultati rapidi• Piccola quantità di

sangue intero

• Facile da eseguire• Saggio standardizzato• Controllo positivo• Controllo negativo• Forniti i valori di cut-off

• Funzione cell T• Semplice, elevata sensibilità• Elevata riproducibilità• Nessuna restrizione

HLA/peptide• Ridotto numero di cell iniziali

SVANTAGGI

• Laborioso• Richiede citofluorimetro e

personale specializzato• Dipendente dalla

stimolazione in vitro• Elevato segnale di

background

• Specificità ristretta al singolo epitopo

• Conoscenza HLA del pz e peptide

• Impiegato per un numero ridotto di HLA

• Nessuna informazione sulla funzione cell T

• Nessuna misurazione quantitativa cell T

• Limitato alla risposta cell T CD8+

• Limitato a individui con HLA più diffusi

• Non differenzia tra cell T CD8+ e cell T CD4+

• Analisi rivolta alla citochina selezionata (IFN-γ)

• Dipende dalla stimolazione in vitro

SiSi

PBMCs di 5 pazienti stimolati con 8 Ag-CMV (Augustine JJ, 2012)

Calarota SA,2013

SEPARAZIONE PBMCs ELISPOT IFN-γ

LETTURA E NORMALIZZAZIONE DEI RISULTATI

METODICA ELISPOT IFN-γ

ELISPOT NORMALIZZATO:

CELLULE T CD4+ IFN-γ CMV specifiche/µl

CELLULE T CD8+ IFN-γ CMV specifiche/µl

ELISPOT NORMALIZZATO:

CELLULE T CD4+ IFN-γ CMV specifiche/µl

CELLULE T CD8+ IFN-γ CMV specifiche/µl

METODICA ELISPOT IFN-γprospettive per i pazienti trapiantati di organo solido

Metodica innovativa nell’immunologia virale

Elevate potenzialità nel monitoraggio dei pazienti trapiantati

Fornisce informazioni utili per la gestione del paziente

Monitoraggio pre-trapianto: «stratificazione del rischio» nei riceventi : valutazione management clinico

Monitoraggio post-trapianto: predizione del rischio di viremia-CMV : strategia preemptive

Metodica innovativa nell’immunologia virale

Elevate potenzialità nel monitoraggio dei pazienti trapiantati

Fornisce informazioni utili per la gestione del paziente

Monitoraggio pre-trapianto: «stratificazione del rischio» nei riceventi : valutazione management clinico

Monitoraggio post-trapianto: predizione del rischio di viremia-CMV : strategia preemptive

Ringraziamenti

• Prof. Fausto Baldanti

• Dott.ssa Cassaniti Irene

• Dott.ssa Comolli Giuditta

• Dott.ssa Prestia Martina

• Adzazehoun Guy

• Garbagnoli Gabriella

• Landini Viviana

Laboratorio di Immunologia Virologica, IRCCS Policlinico San Matteo (Pavia)