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Premessa

Il citomegalovirus (CMV) è il più importante agente di in-fezione congenita dell’uomo e la sordità neurosensoriale (sensorineural hearing loss o SNHL) è la più frequente conseguenza dell’infezione (1). L’infezione congenita da CMV (cCMV) colpisce annualmente dal 2 al 22‰ dei nati vivi dove la maggior incidenza dell’infezione è registrata nei paesi a basso reddito. Le conseguenze cliniche dell’in-

fezione da cCMV riguardano circa un quinto degli infetti e possono essere riconoscibili alla nascita o manifestarsi nel corso dell’infanzia, soprattutto come danni al sistema nervoso centrale, quali sordità neurosensoriale e ritardo di sviluppo psicomotorio (2). L’identificazione dei neonati con cCMV non si può basare sull’osservazione clinica in quanto il 90-95% degli infetti è asintomatico e nei neonati sintomatici il quadro clinico è spesso aspecifico (1, 2). Per una diagnosi certa di infezione da cCMV è indispensabile avvalersi di una diagnosi viro-logica qualificata in grado di isolare il virus infettivo o in-dentificarne le componenti virali (DNA/proteine) in campioni biologici quali urine, saliva e sangue, raccolti entro un tem-po massimo di due settimane dalla nascita, procedura com-plessa e difficilmente realizzabile in mancanza di fattori di

Articolo originale

Diagnosi dell’infezione congenita di citomegalovirus (cCMV) tramite CMV DBS test in bambini sordi LAURA PELLEGRINELLI, UMBERTO AMBROSETTI, ENRICO FAGNANI, FEDERICA DI BERARDINO, MIRKO ALDE’, LUISELLA ALBERTI, ELENA PARIANI,VALERIA PRIMACHE, SANDRO BINDA

Riassunto: Diagnosi dell’infezione congenita di citomegalo-virus (cCMV) tramite CMV DBS test in bambini sordi.

lauRa pelleGRinelli, umbeRto ambRosetti, enRiCo FaGnani, Federica di Berardino, Mirko alde’, luisella alBerti, elena paRiani, valeRia pRimaChe, sanDRo binDa

Il citomegalovirus (CMV) è il più importante agente di infezione congenita dell’uomo; la sordità neurosensoriale in caso di infe-zione congenita è la più frequente conseguenza della stessa. Lo screening uditivo neonatale permette di identificare la maggio-ranza dei bambini con sordità bilaterale o monolaterale perma-nente molto precocemente.Il CMV DBS test, basato sulla evidenziazione, mediante PCR, del DNA virale nei campioni di sangue neonatale essiccato su Guthrie card presenta una sensibilità del 99% permettendo di porre la diagnosi di infezione congenita da CMV a posteriori. Nel periodo 2014-2017 i neonati che hanno fallito lo screening audiologico tramite TEOAE e con sordità confermata dei potenziali ABR sono stati arruolati nello studio: 85 bambini sono risultati affetti da ipoa-cusia neurosensoriale; per 71 (83,6%) di questi (età mediana 3,4 anni; interquartile; 3,3 anni) è stato possibile valutare l’eventuale presenza di CMV-DNA nei rispettivi campioni di DBS. Dei 71 bambini esaminati, 51 (71,8 %) presentavano sordità bi-laterale, di questi 40 (78,4 %) avevano una asimmetria di soglia. Circa la metà 36 (50,7%) dei 71 bambini mostrava una sordità di grado grave/profondo (ABR soglia ≥70 dB). La presenza di cCMV è stata accertata nel 7% (5/71) dei bambini; la quota di bambini con sordità grave/profonda è statisticamente maggiore tra quelli risultati cCMV-positivi rispetto ai cCMV-negativi (100% vs 47%; p= 0,028).

summaRy: Diagnosis of congenital cytomegalovirus (cCMV) infection by CMV DBS test in deaf children.

lauRa pelleGRinelli, umbeRto ambRosetti, enRiCo FaGnani, Federica di Berardino, Mirko alde’, luisella alBerti, elena paRiani, valeRia pRimaChe, sanDRo binDa

Cytomegalovirus (CMV) is the most important congenital in-fection in human beings. Sensorineural hearing loss is the most usual consequence in congenital infection.Newborn auditory screening let us know to identify the majority of children suffering from bilateral or monolateral deafness very early.The CMV DBS test, based on the evidence by PCR test of viral DNA in newborn dried blood samples on Guthrie card, shows a sensibility of 99% and allows to diagnose congenital CMV in-fection in retrospectively.Within 2014-2017 the newborns that failed the auditory scree-ning by TEOAE suffering from deafness evidenced by ABR test, were selected in this study: 85 newborns were affected by sen-sorineural hearing loss.71 newborns were submitted to the DBS test: 71,8% were af-fected by bilateral deafness; 78,4% were affected by asymme-tric deafness; 50,7% had a profound deafness; 7% (5/70) were affected by a congenital CMV infection.

Key woRDs: Sordità neurosensoriale - screening uditivo neonatale - CMV DBS test.Sensorineural hearing loss - newborn auditory screening - CMV DBS test.

Fondazione IRCCS “Ca’ Granda” Ospedale Maggiore Policlinico di Milano, Italia Dipartimento di Scienze Cliniche e di Comunità Autore per la corrispondenza: Umberto Ambrosetti, e-mail: umberto.ambrosetti@policlinico.mi.it

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Solamente nella Regione Toscana tutti i neonati risultati “refer” o “fail” allo screening uditivo neonatale al primo livel-lo realizzato con le emissioni acustiche evocate transienti (TEOAE) devono eseguire non oltre il 15° giorno dalla na-scita la ricerca del DNA di CMV nelle urine (4).Il presente studio preliminare e monocentrico ha valutato il contributo di cCMV in bambini con sordità neurosensoriale attraverso uno screening di cCMV integrato allo screening audiologico neonatale condotto in un centro Audiologico di terzo livello (U.O.S.D. di Audiologia, Fondazione IRCCS Ca’ Granda Ospedale Maggiore Policlinico di Milano) in Lombardia dal 2014 al 2017.

Materiali e metodi

Il Laboratorio di Virologia del Dipartimento di Scienze Bio-mediche per la Salute dell’Università degli Studi di Milano ha messo a punto un metodo di diagnosi retrospettiva dell’infe-zione congenita da citomegalovirus (CMV DBS test), basa-to sulla evidenziazione, mediante PCR, del DNA virale nei campioni di sangue neonatale essiccato su Guthrie card. Tali campioni, dopo essere stati utilizzati per la diagnosi precoce delle malattie metaboliche ereditarie, obbligatoria in Italia, vengono conservati presso il corrispondente Cen-tro Regionale di Screening che in Lombardia si trova presso l’Ospedale V. Buzzi di Milano. La sensibilità e la specificità del test, ottenute dal confronto con il test diagnostico di riferimento tramite isolamento virale in coltura cellulare da campioni di urine raccolte entro le prime 2 settimane di vita, sono risultate superiori al 99% (5).La metodica, messa a punto dal gruppo Barbi et al. (5) pre-vede: a) una prima fase di estrazione del DNA dal campione me-

diante shock termico b) l’amplificazione di una sequenza specifica del genoma

virale (gene gB) mediante n-PCR (in house) c) la visualizzazione degli amplificati mediante corsa elet-

troforetica su gel di agarosio (2%). I risultati ottenuti vengono interpretati secondo uno speci-fico algoritmo. Nel dettaglio: dal DBS neonatale si ricava 1 dischetto di 3 mm di diametro che viene depositato in una provetta da 0,5 ml con aggiunta di 35 μl di terreno sterile (E-MEM, Ea-gle-Minimum Essential Medium). Tale operazione viene ri-petuta tre volte. Per evitare cross-contaminazioni la punzo-natrice viene decontaminata mediante lavaggio con alcool etilico al 70% seguito da flambatura.Ciascuna delle tre provette, inizialmente conservata a 4°C over-night, viene sottoposta a 55°C per 1 ora e a 100°C per 7 minuti. Dopo centrifugazione a 10.000 rpm, il surnatante viene trasferito in una nuova provetta da 0,5 ml e posto a -80°C. Il materiale è quindi utilizzato come templato per l’amplifi-cazione in nested-PCR di una regione conservata del DNA di CMV codificante la glicoproteina gB (gene gB). I neonati che hanno fallito lo screening audiologico at-traverso la valutazione delle TEOAE e con sordità con-fermata dei potenziali evocati uditivi del tronco (Auditory Brainstem Response o ABR), coorte di nascita 2014-2017 in Lombardia, sono stati arruolati nello studio dopo aver sottoscritto l’apposito consenso informato. I pazienti per i quali è stato possibile svolgere indagini virologiche in

rischio riconosciuti, quali lo stato sierologico in gravidanza. La mancanza di informazioni su un’infezione materna in gravidanza e l’assenza nel neonato di una sintomatologia chiaramente rilevabile possono concorrere in misura con-sistente nel sottostimare la frequenza delle infezioni con-genite e il loro ruolo nel determinare la sordità infantile. E’ noto che circa l’1 ‰ dei bambini nati è affetto da sordità neurosensoriale grave o profonda già presente alla nascita o che si manifesta in seguito (2, 3). Il ritardo nella diagno-si della sordità neurosensoriale infantile, oltre ai danni a livello dell’acquisizione del linguaggio, comporta anche la difficoltà nella corretta identificazione della causa, in parti-colare per quanto riguarda le forme da infezione congenita.

Screening neonatale della sordità

L’ipoacusia bilaterale infantile è una condizione clinica fre-quente (l’incidenza in Regione Lombardia varia dallo 0,7 ‰ nati fino allo 0,9 ‰ nati considerando i bambini con uno o più fattori di rischio audiologico, in modo particolare i di-messi dalle terapie intensive neonatali) e rilevante per la salute dell’individuo e per i costi economici e sociali che comporta. Lo screening uditivo neonatale permette di identificare mol-to precocemente la maggioranza dei bambini con sordità bilaterale o monolaterale, entro il 3°- 4° mese dalla nascita, ed intervenire con un programma terapeutico e riabilitativo entro il 6° mese di vita, nel periodo di massima plasticità cerebrale, nel quale si sviluppano complessi circuiti inter-neuronali in cui l’input acustico periferico è essenziale per una corretta maturazione delle vie uditive centrali.Lo screening uditivo neonatale universale deve essere ef-fettuato nel punto nascita prima della dimissione ospedalie-ra su tutti i neonati. La realizzazione dello screening si basa sulla collaborazio-ne tra diverse figure professionali (neonatologi, pediatri, infermieri, ostetriche, audiologi, otorinolaringoiatri, pediatri di famiglia, neuropsichiatri infantili, logopedisti, audiometri-sti), che lavorano in modo multidisciplinare e a livello inte-raziendale, comunicando in modo efficace e sostenendo i genitori nel percorso di cura.Recentemente, l’approvazione del D.P.C.M. n. 15, 12 gen-naio 2017, riguardante la definizione e aggiornamento dei livelli essenziali di assistenza (LEA), di cui all’articolo 1, comma 7, del D.L. 30 dicembre 1992, n. 502, ha reso ob-bligatorio l’effettuazione dello screening uditivo neonatale in tutte le Regioni (art. 38 “Ricovero ordinario per acuti” al punto 2 afferma...diagnosi precoce della sordità conge-nita…).Attualmente solo 6 regioni, con apposite delibere di Giunta (Toscana D.G.R. n. 365, 21/05/2007, UmbriaD.G.R. n. 789, 21/05/2007 Campania D.G.R. n. 267, 23/02/2009, Emilia Romagna D.G.R. n. 694, 23/05/2011, Lazio D.G.R. n. 115, 23/03/2012, Veneto D.G.R. n. 2077, 30/12/2015), hanno stabilito norme per l’effettuazione dello screening neona-tale della sordità.Va precisato che nelle altre regioni scoperte da una specifi-ca normativa, i programmi di screening della sordità vengo-no attuati a “pelle di leopardo” e non in modo “universale”.Oggigiorno in Italia non sono previsti né screening univer-sali né screening mirati per identificare l’infezione congeni-ta di citomegalovirus (cCMV).

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Conclusioni

I risultati si allineano con quelli riportati recentemente da altri gruppi di ricerca (7, 8), ma si discostano da quelli di un nostro precedente lavoro in cui la percentuale di casi di SNHL attribuibili all’infezione da CMV congenita era del 10% nei bambini il cui SNHL era stato diagnosticato nei primi 2 mesi di vita e 34,2% nei bambini con sordità di cau-sa non identificata diagnosticata nella prima infanzia. In quest’ultimo gruppo il 42,7% dei bambini con una perdita uditiva >70 dB era CMV-positivo (9).Lo studio ha confermato l’utilità dei DBS per la definizio-ne dell’eziologia di una sordità non genetica, soprattutto quando sono trascorse le prime 2 settimane di vita per cui le indagini virologiche di riferimento non sono più in grado di distinguere un’infezione pre- da una perinatale poten-zialmente contratta durante il parto o con il latte materno (10-12). La ricaduta relativa al prezioso contributo che il DBS fornisce per fini diagnostici è che tali campioni devono essere conservati per lunghi periodi di tempo. La delibera di giunta della Regione Lombardia Welfare, documento direttore Generale 1.12.2017 n. 15229 (BURL serie ordinaria 13.12.2017) “Approvazione della versione 04 del Titulario e massimario del sistema sanitario lombar-do, già sistema sanitario e sociosanitario di Regione Lom-bardia” alla classe 3 prevenzione medica-sanitaria, codice sottoclasse 04 (pag. 202) stabilisce che i documenti relativi alla gestione degli screening abbiano un tempo di conser-vazione di 10 anni.L’approccio diagnostico utilizzato in questo lavoro potrebbe aiutare i clinici nella diagnosi differenziale della sordità e nell’opportuna gestione del paziente.

Bibliografia

1. Kenneson A, Cannon MJ. Review and meta-analysis of the epidemi-ology of congenital cytomegalovirus (CMV) infection. Rev Med Virol. 2007 Jul-Aug;17(4):253-76.

2. Grosse SD, Ross DS, Dollard SC. Congenital cytomegalovirus (CMV) infection as a cause of permanent bilateral hearing loss: a quantitative assessment. J Clin Virol. 2008 Feb;41(2):57-62.

3. Dollard SC, Grosse SD, Ross DS. New estimates of the prevalence of neurological and sensory sequelae and mortality associated with congenital cytomegalovirus infection. Rev Med Virol. 2007 Sep-Oct;17(5):355-63.

4. Berrettini S, Ghirri P, Lazzerini F, Lenzi G, Forli F. Newborn hearing screening protocol in tuscany region. Ital J Pediatr. 2017 Sep 20;43 (1):82.

5. Barbi M, Binda S, Primache V, et al. Cytomegalovirus DNA detection in Guthrie cards: a powerful tool for diagnosing congenital infection. J Clin Virol 2000;17: 159-65.

6. Avettand-Fenoël V, Marlin S, Vauloup-Fellous C, Loundon N, François M, Couloigner V, Rouillon I, Drouin-Garraud V, Laccourreye L, Denoyelle F, Guilleminot T, Grabar S, Leruez-Ville M. Congenital cytomegalovirus is the second most frequent cause of bilateral hear-ing loss in young French children. J Pediatr. 2013 Mar;162(3):593-9.

7. Boudewyns A, Declau F, Smets K, Ursi D, Eyskens F, Van den Ende J, Van de Heyning P. Cytomegalovirus DNA Detection in Guthrie Cards: Role in the Diagnostic Work-Up of Childhood Hearing Loss. Otol Neurotol. 2009 Oct;30(7):943-9.

8. Lee ER, Chan DK. Implications of dried blood spot testing for con-genital CMV on management of children with hearing loss: A prelimi-nary report. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 2018 Dec 21;119:10-14.

9. Barbi M, Binda S, Caroppo S, Ambrosetti U, Corbetta C, Sergi P. A wider role for congenital cytomegalovirus infection in sensorineural hearing loss. Pediatr Infect Dis J. 2003 Jan;22(1):39-42.

campioni di Dried Blood Spot (DBS) sono stati inclusi nel-lo studio. Non tutti i casi di SNHL sono stati indagati per cCMV in quanto i rispettivi DBS erano stati raccolti tar-divamente o in quantità scarsa o rimossi dopo un dato periodo di conservazione.

Risultati

In base ai risultati dello screening audiologico, nel perio-do di studio 85 bambini sono risultati affetti da ipoacusia neurosensoriale; per 71 (83,6%) di questi (età mediana 3,4 anni; interquartile; 3,3 anni) è stato possibile valutare l’e-ventuale presenza di CMV-DNA nei rispettivi campioni di DBS. Dei 71 bambini esaminati 51 (71,8%) presentava sordità bilaterale, di questi 40 (78,4 %) avevano una asimmetria di soglia. Circa la metà 36 (50,7 %) dei 71 bambini mostrava una sordità di grado grave/profondo (ABR soglia ≥70 dB). La presenza di cCMV è stata accertata nel 7% (5/71) dei bambini; la quota di bambini con sordità grave/profonda è statisticamente maggiore tra quelli risultati cCMV-positivi rispetto ai cCMV-negativi (100% vs 47%; p= 0,028).

Discussione

Annualmente in Italia, a fronte di una frequenza di cCMV pari allo 0,3-0,5%, su circa 450.000 nati vivi, 1.350-2.250 bambini risultano essere congenitamente infetti e di questi 270-450 sono a rischio di danni permanenti (5). È ormai accertato come l’infezione citomegalica congenita sia la seconda causa, dopo le mutazioni genetiche, della sordi-tà che si può manifestare anche tardivamente nell’arco dei primi 6-8 anni di vita (6). In assenza di uno screening neonatale universale per Cito-megalovirus in grado di identificare tutti i bambini positivi, lo screening di cCMV integrato allo screening audiologico per-metterebbe almeno l’identificazione delle infezioni legate a sordità. I motivi per cui si ritiene utile eseguire la ricerca del citomegalovirus risiedono, oltre che per fini epidemiologici ed eziologici, nella constatazione che la perdita dell’udito neurosensoriale presenta un alto tasso di progressione che può essere prevenuta mediante un tempestivo trattamen-to farmacologico e nel fatto che può essere monitorata la comparsa di altri sintomi, in particolare neurologici.La cCMV può essere rilevata con elevata specificità me-diante coltura cellulare o tecniche di biologia molecolare in campioni di urina e/o saliva raccolti prima delle 2 settimane di età o a posteriori mediante il CMV DBS test da eseguire su campioni ematici essiccati, raccolti nei primi giorni di vita (5). Il ricorso al CMV DBS test presenta alcuni vantaggi, tra i quali: utilizzo di un campione ematico già raccolto per gli altri screening obbligatori, è organizzativamente meno impegnativo dell’impiego del test di riferimento, garantisce risultati ottimali in termini di sensibilità e specificità, con-sente facilmente di diagnosticare l’infezione congenita da CMV anche a distanza di mesi o anni dalla nascita.Questo studio retrospettivo di cCMV mediante CMV DBS test condotto dall’Università degli Studi di Milano e dall’U.O.S.D di Audiologia, Fondazione I.R.C.C.S. Ca’ Granda Ospedale Maggiore Policlinico di Milano ha dimostrato che il 7% dei bambini in età pediatrica con SNHL aveva contratto l’infe-zione citomegalica in utero.

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L. Pellegrinelli et al.

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12. Meyer L, Sharon B, Huang TC, Meyer AC, Gravel KE, Schimmenti LA, Swanson EC, Herd HE, Hernandez-Alvarado N, Coverstone KR, McCann M, Schleiss MR. Analysis of archived newborn dried blood spots (DBS) identifies congenital cytomegalovirus as a major cause of unexplained pediatric sensorineural hearing loss. Am J Otolaryn-gol. 2017 Sep -Oct;38(5):565-570.

10. Barbi M, Binda S, et al. Diagnosis of congenital CMV infection via dried blood spots. Rev Med Virol 2006; 16: 385-92.

11. Hideaki M, Yuichi I, Yuji I, Mitsuo M, Shin-Ya N, Satoshi O. A ratio-nal approach to identifying newborns with hearing loss caused by congenital cytomegalovirus infection by dried blood spot screening. Journal Acta Oto-Laryngologica Volume 138, 2018 - Issue 8.

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