SCREENING IMMUNOLOGICO

DELLA INFEZIONE

TUBERCOLARE

DANIELA CAMPISI S.C. MICROBIOLOGIA E VIROLOGIAA.O. OSPEDALE NIGUARDA MILANOdaniela.campisi@ospedaleniguarda.it

VARESE 09 NOVEMBRE 2011

Robert Koch Medico e Batteriologo tedesco nel XIX secolo scoprì il bacillo agente eziologico della Tubercolosi.

Vinse il premio Nobel nel 1905

Carlo Forlanini titolare della cattedra di “Patologia

Speciale Medica” dell’Università di Pavia

nel XIX secolo esegue il primo pneumotorace

artificiale terapeutico “collassoterapia”

Accettato a livello internazionale nel 1913

TUBERCOLOSI “I PERSONAGGI”

Clemens von Pirquet medico austriaco nel 1907 sviluppò la prima prova diagnostica della tubercolosi reazione “allergica” dopo applicazione di una goccia di tubercolina su una scarificazione praticata sulla cute di soggetti che erano stati esposti al bacillo di Koch

PATOGENESIEsposizione a

M.tuberculosis

(inalazione di

aerosol infetti)

MTB prolifera nello spazio

extracellulare e

vengono reclutate cellule infiammatorie

Ingestione da parte dei macrofagi

alveolari inattivi

INFEZIONE LATENTE E MALATTIA

le cellule T

controllano

l’infezione,

che rimane subclinica

nel 95% dei casi

INFEZIONE

Infezione latente: MTB

controllato dal sistema

immunitario per tutto il

resto della vita (tuttavia i

micobatteri rimangono vitali)

TB attiva e sintomatica:

I soggetti possono trasmettere la

malattia ad altri

L’INFEZIONE

I micobatteri rimangono vitali a livello intracellulare nei

macrofagi alveolari, dove si replicano.

La produzione di nuovi bacilli, insieme a detriti cellulari e

batterici inducono fattori chemiotattici dell’ospite e richiamano macrofagi

e linfociti circolanti

Infiltrazione di

� Granulociti neutrofili

(sostituiti da)

�Monociti – macrofagi

�T linfociti

LA RISPOSTA CELLULO-MEDIATA

Un ruolo centrale è rivestito dai linfociti T helper che

producono IFN gamma e IL (2, 4, 5, 6, 10 e 12).

Le citochine attivano i macrofagi rendendoli in grado di

contrastare i micobatteri e limitare l’infezione primaria.

I macrofagi attivati possono fagocitare e uccidere i

micobatteri.

I linfociti T citotossici possono lisare cellule

fagocitiche contenenti micobatteri in replicazione,

permettendo così la fagocitosi e l’uccisione dei

micobatteri da parte delle cellule fagocitiche attive

Classic Model of the Pathogenesis of TB

• Primary TBHealthy Host

Infection contained in the Lung and/or Lymph Nodes

Progressive Pulmonary Disease

Extrapulmonary TB

• Reactivation or Post-Primary TB

Comorbidity avert or occult

– Pulmonary in 85%– Extrapulmonary in 15%

Latent TB Infection (LTBI)90% remain well10% reactivate

FactorsHematologic malignancySteroidsAnti TNFageing

T Cells produce IFN-γγγγ in response to TB infection

TUBERCOLOSI PRIMARIA - SECONDARIA

E DIAGNOSI DI INFEZIONE LATENTELa prima infezione conferisce immunità acquisita nei confronti di M. Tuberculosis

nell’organismo rimangono batteri vitali ma in una specie di letargo metabolico anche per decenni

Il persistente controllo dell’infezione avviene ad opera delle cellule immunocompetenti, macrofagi attivati e linfociti T CD4 / CD8 della memoria

TUBERCOLOSI : malattia manifesta sia clinicamente che batteriologicamente polmonare e/o extra-polmonare

INFEZIONE TUBERCOLARE LATENTE : subclinica senza segni batteriologici o radiologici di malattia ( solitamente soggetti con intradermoreazione positiva che possono essere contatti di soggetti con tubercolosi )

Nel caso in cui il complesso primario non venga completamente sterilizzato si può osservare una riattivazione anche a distanza di tempo “tubercolosi secondaria”

�Moltiplicazione batterica

�Formazioni di lesioni granulomatose

�Micobatteri in circolo

�Diffusione dell’infezione in altre sedi polmonari e extrapolmonari

FATTORI GENETICI NELL’UOMO INFLUENZANO

LA SUCETTIBILITA’ ALL’INVEZIONE MALATTIA TUBERCOLARE

� Numerosi studi dimostrano l’associazione di Antigeni HLA con la suscettibilità alla

malattia a seconda delle diverse etnie

� I geni coinvolti nella maggiore o minore suscettibilità sono diversamente distribuiti a

seconda delle regioni geografiche

� In Nord Europa bassa endemia di alleli correlati

� I geni coinvolti nella difesa contro le infezioni evolvono molto più rapidamente di altri

nel genoma umano probabilmente in seguito alla pressione esercitata dai contatti

continui con agenti e patogeni

� Nelle regioni Asiatiche e in particolare in India Ag HLA-DR2 e DQ1

� In Canada HLA-B8 in Egitto HLA-A2 e –B5 in Grecia – B27

� Nelle popolazioni di colore del Nord America prevalgono HLA-B5 –B15 e DR5

� I geni VDR (Vitamine D Receptor) e MBP (Mannose-Binding Protein) sono

associati alla suscettibilità o resistenza a TB polmonare perché essi influenzano la

risposta cellulomediata

� Il gene NRAMP1 associato a una proteina macrofagica rinominato SCL11A1 è uno

dei più noti e studiato esso controlla la disponibilità di ioni ferro che rendono la

cellula maggiormente permissiva all’infezione sia in soggetti HIV POSITIVI e in

soggetti HIV negativi

DIAGNOSI IMMUNOLOGICA

DI INFEZIONE LATENTE

� TEST CUTANEO ( TST ) CON PPD : intradermoreazione “ in vivo “comparsa di infiltrato e lettura dopo 48/72 ore misurazione dell’alone con cut off variabile per gruppi specifici

� QUANTIFERON-TB Gold : test “ in vitro “ misura, con tecnica ELISA, la quantità di Interferone gamma ( IFN ) rilasciato dai linfociti T in risposta a stimolazione con antigeni tubercolari ESAT-6 e CFP-10 specifici per MTB e assenti nel BCG

� T-SPOT - TB : test “ in vitro “ misura il numero di linfociti T che producono Interferone gamma con tecnica Elispot

Latent TB and TSTT

UB

ER

CU

LIN

SK

IN T

ES

T

Ne

ed

le T

oo

Sh

all

ow

Ne

ed

le T

oo

De

ep

Inserted Properly

Iniezione intradermica di 0,1 di

derivato tubercolinico proteico

purificato (PPD) sulla superficie

volare dell’avambraccio metodo di

Mantoux

The Tuberculin Skin Test: Major Limitations

TST & IGRAs - IFN-γγγγ release: rationale

TEST IGRA Interferon Gamma Release Assays DAL 2001 a oggi (1)

� 2001 1°IGRA approvato FDA con specificità tuttavia < a TST misurava la quantità di gamma interferone rilasciato in risposta a PPD

� Un nuovo IGRA misura la risposta a peptidi sintetici – proteine specifiche di

M. Tuberculosis “Early Secretory Antigenic Target-6” ESAT-6 , “ Culture Filtrate Protein 10” CFP-10 (assenti nei ceppi BCG) esse sono presenti in tutti i ceppi di M.Tuberculosis

� Tuttavia ESAT-6 e CFP-10 sono presenti anche in M.Kansaii, M. szulgai e M. marinum si possono avere risposte falsamente positive

� 2005 nuovo Quantiferon - TB Gold (QFT-GT) 2°IGRA approvato FDA : aliquote separate di sangue vengono incubate con controllo e due combinazioni diverse di ESAT-6 e CFP-10 , viene calcolata la differenza tra la concentrazione di gamma interferon del campione stimolato con Ag e la concentrazione del CN quindi esclusione di falsi positivi tramite cut off del Nil che deve essere < 0,7 UI / ml

� 2007 Quantiferon - TB Gold in tube:

1°provetta TB contiene una combinazione di 14 peptidi che coprono l’intera sequenza aminoacidica di ESAT-6 e CFP-10 e una parte della sequenza TB7.7

2°provetta Nil contiene solo eparina Controllo Negativo

3°provetta MIT ( Mitogeno )contiene eparina destrosio e fitoemagglutinina verifica l’immunocompetenza del soggetto

Dopo un’ incubazione a 37 °C di 16-24 ore nel plasma separato viene misurata la concentrazione di gamma interferon con metodica ELISA

Test Nil compreso tra 0.7 e 0.8 e una risposta TB > del 25-50% del Nil viene interpretata come positivo piuttosto che indeterminato

Test Nil compreso tra 0.7 e 0.8 e una risposta TB < 25% del Nil viene interpretata come Indeterminata

TEST IGRA Interferon Gamma Release Assays DAL 2001 a oggi (2)

� 2008 T-SPOT diventa il 4°IGRA approvato FDA : le cellule mononucleate del sangue periferico (Peripheral Blood Mononuclear Cells ) PBMC vengono incubate con sostanze controllo e con due combinazioni di peptidi ( intera sequenza di ESAT-6 e di CFP-10 ) il principio del metodo è ELISpot che misura il > numero di cellule secernenti gamma interefrone - spot- in ciascun pozzetto di reazione dopo stimolazione antigenica specifica, rispetto alla media della risposta nel pozzetto controllo ( Nil )

� Una risposta borderline è considerata quella con 5,6,7 spot (N.B: la maggior parte degli studi non statunitensi che hanno utilizzato T-SPOT per lo screening non hanno usato il cut off indicato da FDA )

� Sia QFT TB Goold che T-SPOT sono approvati come test di identificazione in vitro di infezione da M. Tuberculosis ( compresa l’infezione da malattia attiva ) se utilizzati congiuntamente a una valutazione del rischio a indagini radiologiche e altre valutazioni mediche e diagnostiche

� Ciascuno dei test QFT-TB Gold, T-Spot e TST misura aspetti diversi della risposta immune e utilizza antigeni e criteri interpretativi differenti i risultati dei test possono non essere intercambiabili .

Test differenti = risultati differenti

Interferon Gamma Release Assays (IGRAs)

QuantiFERON-TB Gold In-Tube

by

www.cellestis.com

(AUS)

T-Spot.TB

by

www.oxfordimmunotec.com

(UK)

ELISA.ELISA.

Dry plate.Count spots.Read plate.Analyze results.Obtain results using QuantiFERON Software.

DA

Y 2

Harvest plasma (automated / batched).

Centrifuge QuantiFERON tubes.

Comparison of Methods

Collect blood in specialized CPT tube.

Separate lymphocytes by centrifugation.

Collect PBMC.

Centrifuge PBMC.

Wash PBMC in pre-warmed media.

Centrifuge PBMC.

Wash PBMC in pre-warmed media.

Centrifuge PBMC.

Count viable cells in haemocytometer.

Adjust concentration of PBMC.

Dispense PBMC and antigens.

Incubate at 37°C with C02 for 16-20 hours.

QuantiFERON-TB Gold In-Tube T-Spot.TBD

AY

1

Stain cells.

Collect blood in QuantiFERON tubes.

Incubate tubes at 37°C for 16-24 hours.

T-C

ell

Xte

nd

re

ag

en

t o

pti

on

Interpretation of IGRA Results

T-Spot.TB cut-off> 6 spots according to manufacturer (Europe)

> 8 spots according to FDA (USA)

QFT-IT cut-off> 0,35 IU/mL according to manufacturer

> 0,35 IU/mL confirmed by FDAAntigens: ESAT-6, CFP-10, TB 7.7

Antigens: ESAT-6, CFP-10

Interpretation of IGRA Results

Mitogen Control:Indication of the immune status of the person being tested.

Controls for correct blood handling and storage beforeincubation.

Indeterminate Result (no response to Mitogen):Is meaningful

It does not indicate necessarily just a failed test.

Mitogen Control & Indeterminate Results for QFT

CONCORDANZA TRA I TEST E

RIPRODUCIBILITA’

� Varia ampiamente essendo influenzata da fattori quali :

prevalenza di infezione

proporzione di infezioni confermate microbiologicamente

stime di esposizione recente o remota

età ( Osservazione: in età avanzata TST potrebbe essere più sensibile degli IGRA )

etnia

pregressa vaccinazione con BCG

un recente TST

patologie concomitanti comprese altre infezioni da Micobatteri non tubercolari

condizioni di immunosoppressione inclusa l’infezione da HIV

� Studi longitudinali hanno rivelato considerevoli fluttuazioni nel rilascio di

Interferon gamma in singoli pazienti : limiti della precisione ? O effettive

fluttuazioni ? Nuova infezione ? Conversione /Reversione ?

� Problema dei valori di cut off IFN

� Da un valore >0.50 UI/ml a < 0.20 True Reversion ( Pai et Al. 2009 )

� Dati Sud Africani suggeriscono che un incremento del valore da < 0.35 UI/ml a

> di 0.70 UI/ml True Conversion

ACCURATEZZA SPECIFICITA’ E SENSIBILITA’ DEI TEST QFT T-Spot

� Un limite della valutazione è la mancanza di un “GOLD STANDARD” per confermare la

diagnosi di LTBI ( infezione latente ) e di Tubercolosi attiva con esami colturali negativi

RICORDANDO CHE:

� L’accuratezza è una misura della % di risultati di un test che sono effettivamente corretti e tiene conto della specificità ( % di veri negativi che risultano negativi al test ) e della sensibilità ( la proporzione di veri positivi che risultano positivi al test )

� Le valutazioni di accuratezza sono molto difficoltose le stime delle performance dei test possono variare a seconda delle popolazioni oggetto di studio, in conseguenza alle differenze di prevalenza dell’infezione da M. tuberculosis e di Micobatteri non tubercolari di malnutrizione e immunosoppressione

� Essendo TST e IGRA test indiretti le valutazioni di sensibilità dei test attraverso le loro performance tra gli individui affetti da tubercolosi attiva confermata da esami colturali potrebbero non essere affidabili nella LTBI

� Le differenze immunologiche che favoriscono la progressione dell’infezione a malattia possono influenzare i test immunologici

� Un trattamento può alterare la risposta immunologica e il risultato del test

� Gli studi pubblicati utilizzano spesso criteri, cut off diversi da quelli FDA e anche misure diverse del diametro dell’infiltrato

� I valori di sensibilità e specificità stimate hanno un ampia variabilità

� Nelle popolazioni a bassa probabilità di infezione la specificità del QFT TB può raggiungere il 99% vs quella del 85% di TST e del 88% di T-Spot la specificità di IGRA può anche essere sovrapponibile confrontando soggetti vaccinati BCG e soggetti non vaccinati ( BCG utilizzato in popolazioni con aumentato rischio di infezione )

Summary of National Guidelines Around the World

General testing approach Countries

TST must be replaced by IGRA Germany ,Swiss , Denmark( BCG-vaccinated contacts/adults)

Either TST or IGRA can be used USA

France

Australia (refugees)

Japan (QFT preferred in all groups except in children <5 y)

Denmark (child contacts)

Two-step approach: TST first, followed by IGRA (either to improve specificity or sensitivity)

UK, Canada, Italy, Spain, Australia, Slovakia, Germany[contacts], Swiss[contacts], Netherlands[contacts, immigrants], Norway, Korea[contacts]

Madhu Pai

Diel R, Loddenkemper R and Nienhaus A Chest, 2009* Manufacturer spots cut-off

SPECIFICITY

QFT:

• 5 published studies involving 513 subjects

• 4 tested QFT positive

• Specificity (509/513)99.2%

T-Spot.TB*:

• 3 published studies involving 255 subjects

• 35 tested T-Spot.TB positive

• Specificity (220/255)86.3%

TST

• All Studies 59.0%

Meta-Analysis Key findings:IGRA and TST Sensitivity and Specificity

Meta-Analysis Key findings:IGRA and TST Sensitivity and Specificity

SENSITIVITY

QFT:• All studies (n=19; 988 patients) 81.0%• Developed country studies (n=13; 619 patients )

84.5%• Developing country studies (n=6; 369 patients) 74.3%

T-Spot.TB*:• All studies (n=17; 837 patients) 87.5%• Developed country studies (n=15; 812 patients) 88.5%• Developing country studies (n=2; 25 patients) 52.0%

Significantly different, P<0.001

TST:• All studies (n=25; 1238 patients) 69.9%• Developed country studies (n=23; 1184 patients) 71.5%• Developing country studies (n=2; 54 patients 35.2%

Diel R, Loddenkemper R and Nienhaus A Chest, 2009* Manufacturer spots cut-off

LE DOMANDE A CUI RISPONDERE IN FUTURO

� Gli IGRA sono in grado di predire una futura tubercolosi attiva?

� Quale il significato dei risultati discordanti?

� Gli IGRA hanno performance diverse nei bambini in confronto agli adulti (Mitogeno –età < 5 anni ), nei soggetti HIV positivi rispetto ai negativi, in soggetti con infezione recente rispetto a soggetti con infezione acquisita anni prima, e in soggetti con infezione latente rispetto a pazienti con infezione attiva?

� Come spiegare risultati differenti dei test TST QFT T-Spot eseguiti simultaneamente ?

� Potranno essere migliorate sensibilità e specificità dei test IGRA modificando lametodologia e adottando criteri di interpretazione diversi o aggiungendo ulteriori antigeni ?

� Quale il migliore approccio per stabilire i cut off di interpretazione degli IGRA incluse situazioni in cui i valori di Nil sono elevati o i valori di Mitogeno sono bassi ?

� L’introduzione del “borderline “ potrebbe migliorare l’accuratezza

� Qual’ è il significato clinico della conversione/regressione ?

� Come monitorare la qualità degli IGRA ( preanalitica: ritardo dell’incubazione oltre le 12 ore > n°indeterminati danneggia l’interpretazione neg/pos particolarmente importante nei campioni pediatrici) ?

� Esiste correlazione tra conta linfocitaria e produzione di interferone (HIV positivi ) ?

� In che modo fattori genetici del microrganismo o dell’ospite interferiscono con i test IGRA ?

� Quali effetti può produrre la terapia sui test IGRA ?

WORLD HEALTH ORGANIZATION (WHO Stop TB Department ) RACOMANDATION 2011 IN LOW AND MIDDLE

INCOME COUNTRIES

� IGRA non devono essere usati in questi paesi per la diagnosi di TB polmonare o extra-polmonare sia in soggetti HIV negativi che HIV positivi per evitare il trattamento non necessario nei falsi positivi data la bassa specificità dei test IGRA e TST in questo contesto

� IGRA non possono sostituire TST per la diagnosi di infezione latente o attiva nei bambini e nei soggetti HIV positivi ( n°CD4 < 200 correla con il decremento di test positi del 27% con T-Spot e del 35 % con TST )

� IGRA non possono sostituire TST nello screening dei lavoratori impiegati in assistenza a soggetti con infezione

� IGRA non possono sotituire TST nello screening dell’infezione latente nei contatti sia adulti che pediatrici o in eventi epidemici

� IGRA e valori predittivi IGRA e TST non possono essere utilizzati per identificare individui a rischio di progressione di TB attiva

RACCOMANDAZIONI GENERALI PER L’UTILIZZO

DEGLI IGRA MMWR GIUGNO 2010

� POSSONO ESSERE UTLIZZATI PER SCOPI DI SORVEGLIANZA SANITARIA O PER IDENTIFICARE SOGGETTI CHE

TRARREBBERO BENEFICIO DAL TRATTAMENTO

� DOVREBBERO ESSERE ESEGUITI E INTERPRETATI SECONDO PROTOCOLLI PRESTABILITI

� DOVREBBERO ESSERE RIPORTATI SIA L’INTERPRETAZIONE QUALITATIVA CHE IL DATO QUANTITATI VO

INSIEME A CRITERI DI INTERPRETAZIONE DEL DATO

� DOVREBBE ESSERE SCRUPOLOSAMENTE TENUTA SOTTO CONTROLLO LA FASE PREANALITICA

� CONSIDERARE LE CARATTERISTICHE DELLA POLAZIONE DA SCREENARE

� ANALOGAMENTE AL TST GLI IGRA NON DOVREBBERO ESSERE UTILIZZATI PER TESTARE SOGGETTI CON

BASSO RISCHIO DI INFEZIONE O PROGRESSIONE A TUBERCOLOSI ATTIVA

ANCHE USANDO UN UN TEST CON SPECIFICITA’ PROSSIMA AL 99 % QUANDO LA PREVALENZA

E’ < 1% LA PROBABILITA’ DI RISULTAT FALSAMENTE POSITIVI E’ MOLTO ELEVATA

� LA SCELTA DEL TEST PIU’ ADEGUATO O DELLA COMBINAZIONE DI PIU’ TEST DOVREBBE ESSERE BASATA

SULLE RAGIONI E SUL CONTESTOIN CUI VENGONO ESEGUITI

RACCOMANDAZIONI GENERALI PER L’UTILIZZO DEGLI IGRA MMWR GIUGNO 2010 II parte

1. IGRA è preferibile ma TST è accettabile : in persone senza fissa dimora o che fanno uso distupefacienti – in soggetti vaccinati BCG per aumentare la specificità e l’accettabilità di un trattamento per LTBI

2. TST è preferibile ma un IGRA è accettabile : in bambini di età < 5 anni ( alcuni ricercatori suggeriscono di usarli entrambi ) American Academy of Pediatrics

3. Uso indifferente di uno dei due : screening dei contatti risultati negativi prima di 8 settimane dall’esposizione ( ripetizione a 8-10 settimane )

screening di soggetti a rischio di esposizione occupazionale con attenzione particolare a

CONVERSIONE-REVERSIONE

Conversione di TST = negativo vs positivo infiltrato>= 10 mm entro 2 anni

Conversione di IGRA = negativo vs positivo entro 2 anni ?

non dimostrata associazione tra IGRA e rischio di progressione

4. Utilizzare sia IGRA che TST : in bambini < 5 anni e soggetti HIV positivi con rischio aumentato di

infezione, progressione e di esito infausto – quando i valori misurati di un primo test sono

anomali es. valore di Nil > di quanto normalmente osservato nella popolazione oggetto del test

( > 0.7 UI/ml ) – la risposta al Mitogeno del QFT è < 0.5 UI/ml o il numero di spot nel pozzetto

stimolato con mitogeno del di T-Spot è < 20 per la ripetizione di un test IGRA è preferibile un

secondo campione

L’esperienza del nostro

laboratorio

CONCLUSIONI� Le conversioni e reversioni esistono “wait and see”

� Un risultato Borderline va ripetuto a 1 mese 2 mesi 6 mesi 1 anno

� Negli esposti il rischio non è pari a zero se TST ha un diametro < 5 mm

� E’ possibile avere TST positivo QFT negativo oppure TST negativo eQFT positivo

� Non è consigliato l’uso della quantizzazione degli IGRA per il monitoraggio della terapia

Speranza per un futuro vaccino

Ricercatori americani dalla Albert Einstein college of Medicine, della Howard Hughes Medical Institute e della Colorado State University

hanno pubblicato su Online Nature Medicine i risultati incoraggianti di uno studio effettuato sul topo manipolando il gene “ESX-3” correlato con la risposta immunitaria cellulomediata verso M.smegmatis letale

per questo animale

VIRGINIAMIA FIGLIA CHE A SOLI UNDICI ANNI HA COLLABORATO ALLA

REALIZZAZIONE GRAFICA DELLA RELAZIONE

RINGRAZIAMENTI