INTERFERENZA DELL’IPERLIPEMIA E DELL’IPERPROTEINEMIA …

INTERFERENZA DELL’IPERLIPEMIA E

DELL’IPERPROTEINEMIA NELLA

DETERMINAZIONE DEGLI

ELETTROLITI: CONFRONTO TRA UN

METODO DIRETTO ED UNO

INDIRETTO

SAMUELA BALESTRA

TECNICO IN ANALISI BIOMEDICHE

SSMT – LOCARNO

Responsabile: Roberto Della Bruna

Eseguito al laboratorio dell’Ospedale La Carità di Locarno

Samuela Balestra Lavoro di Diploma 2008‐2009

Riassunto Abstract

Introduzione e obiettivo

La misura della concentrazione degli elettroliti nel siero è

utile per la diagnosi e per il controllo di alcune patologie.

A dipendenza dell’apparecchio utilizzato per l’analisi, sono

usati principalmente due metodi: uno indiretto ed uno

diretto. La differenza tra i due metodi è che il primo

effettua una diluizione del campione con della soluzione

tamponata prima della misurazione del campione, mentre

il secondo no. Questa diluizione potrebbe, nei campioni

iperlipemici, o anche in caso di iperproteinemia,

modificare il valore della concentrazione degli elettroliti:

infatti una parte del volume pipettato sarebbe “occupato”

dai lipidi o, analogamente, dalle proteine. I risultati

sarebbero quindi falsamente diminuiti nel metodo

indiretto. Obiettivo del lavoro è quindi stabilire se esista

una differenza significativa tra i due metodi, tramite un

confronto di campioni.

Materiali e metodi

Sono stati analizzati 59 campioni iperlipemici di siero

raccolti dai laboratori ODL e ORL. L’apparecchio EML100,

che utilizza un metodo ISE diretto, e l’apparecchio

Beckman Coulter DXC600, che utilizza invece un metodo

ISE indiretto, hanno permesso il confronto dei campioni

con i due metodi. I risultati sono poi stati analizzati e

confrontati tramite il programma statistico “Analyse-it”.

Risultati

Il programma ha determinato che esiste una modesta

influenza dei lipidi nella differenza tra il metodo diretto e

quello indiretto per la misurazione della concentrazione

del sodio e del cloro, mentre non ne è influenzato il valore

del potassio. Lo stesso vale per l’iperproteinemia, anche se

l’influenza è meno marcata.

Conclusione

In base ai risultati ottenuti con il seguente lavoro, si è

deciso che non si effettuerà nessuna correzione automatica

del valore, ma questo lavoro dimostra che in caso di forte

iperlipemia o iperproteinemia, si dovrebbe utilizzare un

metodo diretto piuttosto che uno indiretto. Questa

conclusione è dovuta al fatto che la concentrazione dei

lipidi o delle proteine deve essere veramente molto

elevata, affinché ci sia una differenza clinicamente

rilevante tra i due metodi.

Introduction and objective

The measure of the electrolyte's concentration in serum is

useful for the diagnosis and the checking of some

pathologies.

Depending on which apparatus is used for the test,

basically two methods are used: a direct one and an

indirect one.

The difference between the two methods is: the indirect

method makes a dilution with a buffer solution before the

measuring, the direct method does not. This dilution could

change the readings of sodium concentration in

hyperlipemic and hyperproteinemic samples: a share of

the pipetted volume would be occupied by lipids or

proteins. The results could therefore be falsely diminished

with the indirect method. The objective of this work is to

establish if there is a significant difference between those

two methods by comparing the samples.

Materials and methods

59 Hyperlipemic serum samples taken from the

laboratories of ODL and ORL were analyzed.

The apparatus EML100, which utilizes a ISE direct

method, and the apparatus Beckman Coulter DXC600,

which instead uses a ISE indirect method, allowed the

comparison of the samples with these two methods.

The results were analyzed and compared with the

statistical program “Analyse-it”.

Results

The program determines that there is a modest influence

of the lipids in the difference between direct and indirect

method for the sodium and chlorine measuring; whereas

there is no influence on the potassium value. The same

applies for hyperproteinemia, but in this case the influence

is minor.

Conclusion

Based upon the results obtained by this diploma study, it

has been decided that the method used until now will not

be changed. But this work demonstrates that in case of a

high hyperlipemia or hyperproteinemia, the direct method

should be used instead of the indirect one.

This conclusion is due to the fact that the lipid's

concentration has to be really very high to show a relevant

difference between the two methods.


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Indice

Introduzione 4

Obiettivo 6

Materiali e metodi 7

Risultati 9

Discussione 20

Conclusioni 22

Bibliografia 23

Ringraziamenti 24


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Introduzione

Il sodio è un elettrolita che fa parte, insieme al potassio, al cloro e al magnesio, di quelli

quantitativamente più importanti. Il 97% del sodio totale si trova nello spazio

extracellulare; la sua assunzione avviene in maniera preponderante attraverso il sale da

cucina, mentre la sua eliminazione avviene principalmente attraverso i reni.

I valori di riferimento del sodio nel siero/plasma in EOLAB sono di 135 – 145 mmol/L (1).

La misura della concentrazione del sodio nel siero rappresenta una misura della

regolazione dell’osmolalità e del volume extracellulare: è quindi utile per la diagnosi e per

il controllo di alcune patologie come l’aldosteronismo, il diabete insipido, il morbo di

Addison, la disidratazione ed anche per altre malattie che potrebbero provocare

un’alterazione degli elettroliti (2).

Il cloro è presente prevalentemente nello spazio extracellulare, nella misura del 56%, e la

sua assunzione dipende prevalentemente dalla dieta. Lo ione cloro, oltre ad essere

importante per il bilancio idrico, lo è anche per l’equilibrio acido-base (2).

I valori di riferimento del cloro nel siero/plasma in EOLAB sono di 97 – 107 mmol/L (3).

La maggior quantità del potassio, ovvero il 98%, è intracellulare. La concentrazione

extracellulare, anche se non è rappresentativa della quantità totale del potassio, è

importante perché colpisce la conduzione neuromuscolare e cardiaca. Concentrazioni

sieriche < a 2,0 mmol/l possono essere mortali: è importante, in questo caso, sapere se la

diminuzione è dovuta a una carenza di potassio o a causa della sua distribuzione nelle

cellule (2).

I valori di riferimento del potassio nel siero/plasma in EOLAB sono di 3,5 – 5,0 mmol/L

(4).

A dipendenza dell’apparecchio utilizzato per l’analisi, per gli elettroliti vengono usati

principalmente due metodi: la potenziometria diretta (“ISE diretto”, ISE sta per Ion-

Selective Electrode, elettrodo ionoselettivo o a membrana), rispettivamente la

potenziometria indiretta (“ISE indiretto”). Come dicono già le parole stesse, si tratta di un

metodo diretto e di uno indiretto. La differenza tra i due metodi consiste nella diluizione

effettuata sul campione prima della misurazione, quando si utilizza un metodo indiretto.

Questa diluizione potrebbe, nei campioni iperlipemici o iperproteinemici, modificare il


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risultato della concentrazione degli elettroliti (possibile pseudoiponatriemia,

pseudoipocloremia o pseudoipopotassiemia): infatti per ottenerla si preleva una piccola

quantità di campione che potrebbe essere occupata in buona parte dai lipidi o dalle

proteine, i quali hanno un volume “molto grande” rispetto agli elettroliti. I valori possono

quindi essere erroneamente diminuiti con il metodo indiretto, mentre dovrebbero esserlo

di meno nei risultati ottenuti con il metodo diretto. Per quest'ultimo, il campione viene

misurato direttamente sul siero, senza procedere a nessuna precedente diluizione (5, 6,7).

Infatti nel liquido a contatto con gli elettrodi, la concentrazione degli elettroliti è quella

effettiva e fisiologicamente rilevante. I lipidi non influenzano la misura. Un discorso

analogo vale per una concentrazione molto elevata di proteine nel siero, anche se questo

stato si presenta, nella routine, con una frequenza nettamente minore di quanto non

avvenga per le iperlipemie (5, 6, 7).

Attualmente nei laboratori vengono usati sia il metodo a potenziometria diretta che quello

a potenziometria indiretta. Di regola la misura diretta viene eseguita nei reparti

(gasometria), mentre le misure eseguite nel laboratorio sono solitamente indirette.

Nei laboratori di EOLAB viene usato l’apparecchio Beckman Coulter DXC 600/800 per la

misura indiretta, mentre vengono utilizzati apparecchi della Radiometer (EML100 o ABL)

per la misura diretta.

Per stimare l’effetto di un'iperlipemia e di un'iperproteinemia nella determinazione degli

elettroliti e per stimare l’eventuale importanza nella diagnostica di routine, si è deciso di

analizzare il problema più a fondo mediante un confronto tra le misure con i due metodi.


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Obiettivo

L’obiettivo del mio lavoro di diploma è di stabilire, raccogliendo il maggior numero

possibile di campioni di siero iperlipemici, e per mezzo di un confronto dei due metodi

(diretto e indiretto), se esista una differenza reale e significativa; e in caso ci fosse, di

quantificarla.

Scopo di questo lavoro è quindi anche di stabilire se, nei campioni iperlipemici, o in quelli

con un'iperproteinemia, gli elettroliti debbano venire direttamente misurati con un

apparecchio che utilizza un metodo ISE diretto; oppure di trovare una formula di

correzione che si possa mettere in relazione ai risultati.


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Materiali e metodi

Nel periodo compreso tra gennaio ed aprile 2009, sono stati raccolti 59 campioni

iperlipemici di siero provenienti dai laboratori dell'Ospedale La Carità e dell'Ospedale

Civico.

I campioni raccolti hanno un valore aumentato del colesterolo e/o dei trigliceridi. Si tratta

quindi di valori > 1,70 mmol/L per quel che riguarda i trigliceridi, oppure > 5,00 mmol/L

per il colesterolo.

Per quello che riguarda le proteine invece, la scelta è stata casuale in quanto un'

iperproteinemia è meno frequente e sarebbe stato quindi molto difficile trovare dei

campioni adatti. Per ottenere quindi il valore delle proteine, sono stati utilizzati i campioni

iperlipemici.

I campioni sono stati analizzati subito, tenuti in frigo per un massimo di 7 giorni, oppure

congelati ed analizzati il prima possibile.

Con il Beckman Coulter DXC600 sono state eseguite le analisi delle proteine totali, del

colesterolo, dei trigliceridi, del sodio, del potassio e del cloro, mentre con l’EML100 sono

state effettuate le analisi del sodio, del potassio e del cloro.

Tutti i campioni sono stati esaminati in doppio su entrambi gli apparecchi.

Alcuni campioni (numeri 7, 29, 39 e 53) sono stati diluiti 1:3 con soluzione fisiologica (Nacl

0,9%) per poter ottenere il risultato dei trigliceridi, altrimenti soppresso dall’apparecchio

perché troppo elevato: i limiti dell’apparecchio per l’analisi dei trigliceridi sono di

0,1 – 11,3 mmol/L.

Il Beckman Coulter DXC600 utilizza, per quel che riguarda il colesterolo, i trigliceridi e le

proteine totali, un metodo "end point" temporizzato; mentre per quel che riguarda gli

elettroliti impiega la potenziometria indiretta (“ISE” indiretto) mediante due elettrodi

ionoselettivi, dei quali uno agisce come elettrodo di riferimento (comune per sodio,

potassio e cloro)(1,3,4).

La concentrazione degli elettroliti viene misurata in seguito a una diluizione 1:33 con della

soluzione tamponata. Il tampone è utilizzato per stabilire un coefficiente di attività

costante per gli ioni, calibrando l’elettrodo sui valori di concentrazione. Gli elettrodi degli

elettroliti sono costituiti per ognuno in un modo diverso: per il sodio si tratta di un

elettrodo in vetro al silicato di alluminio – sodio – litio, per il cloro è costituito da un

composto di cloruro di argento, mentre per il potassio è costituito da una membrana di


8

valinomicina. Per tutti e tre gli elettroliti l’elettrodo di riferimento è, come già spiegato,

comune per tutti gli elettroliti e cioè, in questo caso quello di riferimento del sodio.

fig.1 elettrodo ionoselettivo per le misurazioni potenziometriche

Quando la diluizione viene a contatto con l’elettrodo e ha quindi luogo il processo di

scambio ionico, si sviluppa una variazione di potenziale dell’elettrodo. Queste variazioni

vengono messe in relazione con l’elettrodo di riferimento. Il potenziale di riferimento

consente di calcolare, per mezzo dell’equazione di Nernst, la concentrazione dell'elettrolita

(1,3,4).

L’EML100 sfrutta invece la potenziometria diretta (“ISE diretto”) per effettuare le stesse

analisi. I risultati ottenuti con questo metodo dovrebbero essere paragonabili ai risultati

ottenuti con la potenziometria indiretta e viceversa (8).

Il principio del metodo è simile, si basa anch’esso sull'utilizzo di elettrodi ionoselettivi, ma

differisce per il fatto che il campione è misurato direttamente, senza procedere ad alcuna

diluizione precedente del siero (8).

La potenziometria diretta dà un valore più vicino alle reali condizioni fisiologiche che non

quella indiretta.

Per ogni apparecchio sono utilizzati reagenti appositi forniti dalla ditta stessa

dell’apparecchio.

L’analisi dei dati è stata resa possibile tramite la ricerca della relazione tra la somma dei

lipidi, o il valore delle proteine totali, e la differenza tra la misura diretta – indiretta.

I dati sono stati in seguito ordinati e inseriti nel programma statistico “Analyse-it” e

analizzati con il metodo non parametrico di Passing & Bablok.


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Campione TP Chol Tg Na K Cl Na K Cl

1 4090111032 60 59 4.54 4.54 1.11 1.11 139 140 4.1 4.1 106 106 141 141 4.2 4.2 105 1052 4090112025 40 40 1.40 1.37 3.23 3.23 136 137 4.7 4.7 110 111 135 135 4.7 4.7 107 1073 4090112089 73 72 4.29 4.43 5.17 5.19 143 143 4.0 4.0 106 105 145 145 4.0 4.1 103 1034 4090113030 60 60 5.00 5.03 4.15 4.25 142 139 4.4 4.3 111 108 140 140 4.3 4.3 105 1055 4090113104 76 75 6.40 6.39 0.83 0.84 132 133 4.1 4.2 99 100 135 135 4.1 4.3 99 986 4090113090 72 71 6.45 6.49 1.12 1.11 136 136 4.6 4.6 105 105 137 137 4.6 4.6 102 1017 1090112253 78 77 6.98 6.86 12.03 12.12 137 138 3.9 3.9 102 102 141 141 4.0 4.1 100 1008 4090114057 62 62 5.00 5.03 0.88 0.88 142 143 4.6 4.6 110 111 145 145 4.7 4.7 108 1089 4090115078 65 64 7.50 7.43 1.69 1.68 137 139 3.8 3.8 104 105 142 142 3.9 3.9 103 103

10 4090116019 42 44 1.40 1.42 7.40 7.43 130 130 6.1 6.1 103 103 130 130 6.1 6.1 97 9711 4090119020 70 70 3.04 3.12 4.19 4.13 142 141 5.9 5.9 108 109 143 143 5.9 5.9 108 10812 4090119084 66 66 7.18 7.20 4.43 4.48 141 140 4.2 4.2 110 109 142 141 4.3 4.2 108 10813 4090118059 73 74 5.15 5.21 2.41 2.45 141 141 4.8 4.8 104 104 143 142 4.9 4.9 103 10314 4090119063 69 69 3.21 3.23 0.98 1.02 145 144 4.3 4.3 106 105 144 145 4.3 4.3 105 10515 4090126044 60 59 5.34 5.34 0.79 0.81 140 139 4.1 4.0 108 107 141 141 4.1 4.1 107 10716 4090118043 89 91 7.36 7.39 4.17 4.17 146 147 4.6 4.7 109 110 151 151 4.7 4.7 110 11017 4090126074 74 72 6.55 6.58 1.44 1.44 141 141 4.3 4.3 106 106 143 144 4.4 4.4 105 10518 4090126084 78 78 4.79 4.88 1.35 1.35 141 141 4.4 4.4 107 106 144 144 4.5 4.5 107 10719 4090127048 74 73 5.90 5.72 2.02 1.96 136 137 4.6 4.6 105 105 142 141 4.8 4.8 106 10620 4090127063 75 76 5.07 5.09 2.36 2.33 139 139 4.2 4.2 102 101 145 144 4.4 4.4 103 10321 4090127008 74 74 5.50 5.45 3.46 3.47 137 139 3.9 3.9 101 102 142 142 4.0 4.0 102 10222 4090127119 64 65 7.47 7.54 2.34 2.33 141 142 4.4 4.4 103 103 144 144 4.5 4.5 102 10323 4090128082 76 76 4.90 4.87 0.90 0.89 138 137 3.9 3.9 106 105 143 143 4.1 4.1 106 10524 1090129081 76 76 5.14 5.11 6.31 6.32 136 137 4.2 4.3 103 104 142 142 4.4 4.4 105 10525 4090131088 62 63 6.77 6.72 1.70 1.72 142 142 3.5 3.5 100 100 144 144 3.6 3.6 100 10026 4090201004 74 75 6.97 6.91 3.18 3.23 134 134 4.8 4.8 99 99 138 138 4.9 4.9 100 10027 4090202090 72 71 6.52 6.55 2.32 2.32 138 138 4.3 4.4 105 106 140 140 4.5 4.5 105 10528 1090203207 76 76 3.73 3.63 5.24 5.21 141 141 4.2 4.2 104 105 143 142 4.3 4.3 105 10629 4090206056 70 71 7.15 6.96 1.10 1.10 140 139 4.5 4.5 105 105 140 140 4.5 4.5 104 10430 4090210078 77 76 7.10 7.02 1.29 1.29 139 138 4.5 4.5 104 105 142 142 4.6 4.6 102 10231 4090213077 78 78 8.15 8.12 3.00 3.03 137 138 4.8 4.9 99 100 143 143 5.1 5.1 100 10032 4090208065 74 75 2.41 2.39 3.63 3.63 134 136 4.9 5.0 100 101 137 136 5.0 5.0 99 9933 4090302101 67 67 10.73 10.75 2.18 2.21 138 137 3.8 3.8 101 104 141 141 3.9 3.9 101 10134 4090208067 69 69 6.47 6.32 6.07 6.11 151 151 4.3 4.2 116 114 158 158 4.5 4.5 117 11835 4090207065 69 69 6.23 6.16 7.39 7.42 147 148 4.8 4.8 112 113 146 146 4.8 4.8 108 10836 4090212130 71 72 7.94 7.89 1.41 1.40 140 141 4.0 4.0 106 106 142 144 4.0 4.2 106 10637 4090213040 66 65 4.26 4.19 4.43 4.43 139 138 4.0 4.0 103 105 142 141 4.2 4.1 104 10538 4090208071 68 69 2.27 2.21 4.47 4.47 136 135 5.0 5.0 102 101 137 137 5.1 5.1 101 10139 4090226041 59 58 14.88 15.10 33.81 33.63 133 134 3.9 3.9 96 97 145 145 4.3 4.3 103 10440 4090226108 72 71 4.96 4.92 2.64 2.63 142 143 5.1 5.1 105 105 146 146 4.7 5.3 106 10541 4090207078 71 69 3.25 3.24 3.76 3.72 142 143 4.5 4.5 107 108 142 143 4.6 4.6 107 10742 4090218066 71 70 6.83 6.87 3.25 3.21 140 140 4.2 4.2 105 105 144 142 4.4 4.4 105 10643 4090218073 79 79 6.74 6.72 2.91 2.94 137 136 4.5 4.4 99 98 141 141 4.6 4.7 100 10044 4090210058 72 71 4.97 4.79 3.71 3.76 141 140 3.9 3.9 101 100 143 143 4.0 4.0 100 10045 4090218058 73 72 8.53 8.42 4.73 4.81 141 142 5.6 5.6 105 105 146 145 5.8 5.8 106 10646 4090206098 56 57 5.44 5.38 3.90 3.90 136 138 4.1 4.2 97 99 140 142 4.2 4.2 96 9647 1090302123 68 66 7.95 8.03 6.02 6.01 139 139 4.8 4.8 101 102 143 141 4.8 4.8 102 10248 1090302250 82 83 4.54 4.58 2.36 2.30 138 137 3.9 3.9 107 106 141 141 4.0 4.0 106 10649 1090302136 79 78 5.63 5.57 2.87 2.85 138 138 3.8 3.8 106 106 141 140 4.0 3.9 105 10550 1090227010 66 66 9.17 9.16 2.29 2.32 137 138 4.2 4.3 102 102 139 139 4.3 4.3 102 10251 4090304070 70 70 7.06 7.10 0.99 0.98 142 142 4.1 4.1 109 108 141 140 4.1 4.1 104 10452 1090227225 66 67 6.23 6.30 2.44 2.45 142 143 4.3 4.3 111 111 143 142 4.3 4.3 109 10953 1090302249 70 70 8.77 8.56 22.74 22.77 142 142 4.1 4.1 105 105 150 143 4.4 4.2 112 10654 1090303135 79 79 5.47 5.49 2.10 2.10 143 143 4.0 4.0 112 111 145 144 4.2 4.2 111 11155 1090303152 69 68 8.05 8.00 4.63 4.55 141 140 3.4 3.4 108 110 143 143 3.5 3.5 108 10956 1090303174 77 78 4.12 4.23 2.90 2.90 141 140 3.9 3.9 105 104 141 142 4.0 4.0 104 10457 1090303078 69 69 4.27 4.20 3.28 3.29 141 141 4.4 4.4 109 109 141 141 4.5 4.5 108 10858 1090302164 76 74 6.69 6.66 2.30 2.30 143 143 5.2 5.1 108 107 144 144 5.2 5.2 106 10759 4090303129 61 61 8.40 8.53 33.30 32.55 139 137 4.0 4.0 106 108 145 145 4.2 4.2 107 106

Wilcoxon 2p =Ripetibilità (CV&) =

Beckman DxC 600 potenziometria indiretta EML100 potenziometria diretta

0.300.40 0.35 0.810.22 0.210.22 0.21 0.74 0.361.52% 0.62%0.76% 0.73%

0.100.98% 1.00% 1.65% 0.50% 0.58%

Risultati

Tabella 1. Risultati dei 59 campioni di siero iperlipemico


10

Nella tabella 1. vengono mostrati i risultati, dei campioni utilizzati, dei diversi parametri

misurati. I diversi sieri sono stati numerati da1 a 59, mentre nella seconda colonna si può

vedere il numero del campione dato dal laboratorio per poterli rintracciare in caso di

bisogno.

Si può notare che i valori sono compresi tra:

Parametro Beckman DXC 600 EML100

Proteine totali (TP) 40 – 91 g/l ---

Colesterolo (Chol) 1,37 – 15,10 mmol/l ---

Trigliceridi (TG) 0,79 – 33,81 mmol/l ---

Sodio (Na) 130 – 148 mmol/l 130 - 158 mmol/l

Potassio (K) 3,4 – 6,1 mmol/l 3,5 – 6,1 mmol/l

Cloro (Cl) 96 – 116 mmol/l 96 – 118 mmol/l

Tutte le misure sono state eseguite in doppio. Le ripetibilità sono buone per entrambi gli

apparecchi, essendo tutte < 2%, e compatibili con quanto solitamente rilevato per questa

tipologia di analisi. Per quel che riguarda gli elettroliti, la ripetibilità per il sodio e il

potassio è risultata migliore in potenziometria indiretta, invece per quel che riguarda il

cloro, è migliore quella diretta.

Il test di Wilcoxon mostra che la media ottenuta con i due apparecchi non è statisticamente

diversa; questo dato si usa anche per fare in modo di accorgersi se ci siano errori

grossolani nelle misurazioni o anche nella digitazione dei risultati nella tabella. (una

differenza significativa delle medie avrebbe dato un valore <0.05).


11

ParametroCampione Media Tp Media Chol Media TG Total Lipid Media Na Media K Media Cl Media Na Media K Media Cl Na D-I K D-I CL D-I

1 59.5 4.54 1.11 5.65 139.5 4.1 106 141 4.2 105 1.5 0.1 -12 40 1.39 3.23 4.62 136.5 4.7 110.5 135 4.7 107 -1.5 0.0 -3.53 72.5 4.36 5.18 9.54 143 4.0 105.5 145 4.1 103 2 0.0 -2.54 60 5.02 4.20 9.22 140.5 4.4 109.5 140 4.3 105 -0.5 0.0 -4.55 75.5 6.40 0.84 7.23 132.5 4.2 99.5 135 4.2 98.5 2.5 0.0 -16 71.5 6.47 1.12 7.59 136 4.6 105 137 4.6 101.5 1 0.0 -3.57 77.5 6.92 12.08 19.00 137.5 3.9 102 141 4.1 100 3.5 0.2 -28 62 5.02 0.88 5.90 142.5 4.6 110.5 145 4.7 108 2.5 0.1 -2.59 64.5 7.47 1.69 9.15 138 3.8 104.5 142 3.9 103 4 0.1 -1.5

10 43 1.41 7.42 8.83 130 6.1 103 130 6.1 97 0 0.0 -611 70 3.08 4.16 7.24 141.5 5.9 108.5 143 5.9 108 1.5 0.0 -0.512 66 7.19 4.46 11.65 140.5 4.2 109.5 141.5 4.3 108 1 0.0 -1.513 73.5 5.18 2.43 7.61 141 4.8 104 142.5 4.9 103 1.5 0.1 -114 69 3.22 1.00 4.22 144.5 4.3 105.5 144.5 4.3 105 0 0.0 -0.515 59.5 5.34 0.80 6.14 139.5 4.1 107.5 141 4.1 107 1.5 0.0 -0.516 90 7.38 4.17 11.55 146.5 4.7 109.5 151 4.7 110 4.5 0.0 0.517 73 6.57 1.44 8.01 141 4.3 106 143.5 4.4 105 2.5 0.1 -118 78 4.84 1.35 6.19 141 4.4 106.5 144 4.5 107 3 0.1 0.519 73.5 5.81 1.99 7.80 136.5 4.6 105 141.5 4.8 106 5 0.2 120 75.5 5.08 2.35 7.43 139 4.2 101.5 144.5 4.4 103 5.5 0.2 1.521 74 5.48 3.47 8.94 138 3.9 101.5 142 4.0 102 4 0.1 0.522 64.5 7.51 2.34 9.84 141.5 4.4 103 144 4.5 102.5 2.5 0.1 -0.523 76 4.89 0.90 5.78 137.5 3.9 105.5 143 4.1 105.5 5.5 0.2 024 76 5.13 6.32 11.44 136.5 4.3 103.5 142 4.4 105 5.5 0.2 1.525 62.5 6.75 1.71 8.46 142 3.5 100 144 3.6 100 2 0.1 026 74.5 6.94 3.21 10.15 134 4.8 99 138 4.9 100 4 0.1 127 71.5 6.54 2.32 8.86 138 4.4 105.5 140 4.5 105 2 0.2 -0.528 76 3.68 5.23 8.91 141 4.2 104.5 142.5 4.3 105.5 1.5 0.1 129 70.5 7.06 1.10 8.16 139.5 4.5 105 140 4.5 104 0.5 0.0 -130 76.5 7.06 1.29 8.35 138.5 4.5 104.5 142 4.6 102 3.5 0.1 -2.531 78 8.14 3.02 11.15 137.5 4.9 99.5 143 5.1 100 5.5 0.3 0.532 74.5 2.40 3.63 6.03 135 5.0 100.5 136.5 5.0 99 1.5 0.0 -1.533 67 10.74 2.20 12.94 137.5 3.8 102.5 141 3.9 101 3.5 0.1 -1.534 69 6.40 6.09 12.49 151 4.3 115 158 4.5 117.5 7 0.3 2.535 69 6.20 7.41 13.60 147.5 4.8 112.5 146 4.8 108 -1.5 0.0 -4.536 71.5 7.92 1.41 9.32 140.5 4.0 106 143 4.1 106 2.5 0.1 037 65.5 4.23 4.43 8.66 138.5 4.0 104 141.5 4.2 104.5 3 0.2 0.538 68.5 2.24 4.47 6.71 135.5 5.0 101.5 137 5.1 101 1.5 0.1 -0.539 58.5 14.99 33.72 48.71 133.5 3.9 96.5 145 4.3 103.5 11.5 0.4 740 71.5 4.94 2.64 7.58 142.5 5.1 105 146 5.0 105.5 3.5 -0.1 0.541 70 3.25 3.74 6.99 142.5 4.5 107.5 142.5 4.6 107 0 0.1 -0.542 70.5 6.85 3.23 10.08 140 4.2 105 143 4.4 105.5 3 0.2 0.543 79 6.73 2.93 9.66 136.5 4.5 98.5 141 4.7 100 4.5 0.2 1.544 71.5 4.88 3.74 8.62 140.5 3.9 100.5 143 4.0 100 2.5 0.1 -0.545 72.5 8.48 4.77 13.25 141.5 5.6 105 145.5 5.8 106 4 0.2 146 56.5 5.41 3.90 9.31 137 4.2 98 141 4.2 96 4 0.0 -247 67 7.99 6.02 14.01 139 4.8 101.5 142 4.8 102 3 0.0 0.548 82.5 4.56 2.33 6.89 137.5 3.9 106.5 141 4.0 106 3.5 0.1 -0.549 78.5 5.60 2.86 8.46 138 3.8 106 140.5 4.0 105 2.5 0.2 -150 66 9.17 2.31 11.47 137.5 4.3 102 139 4.3 102 1.5 0.0 051 70 7.08 0.99 8.07 142 4.1 108.5 140.5 4.1 104 -1.5 0.0 -4.552 66.5 6.27 2.45 8.71 142.5 4.3 111 142.5 4.3 109 0 0.0 -253 70 8.67 22.76 31.42 142 4.1 105 146.5 4.3 109 4.5 0.2 454 79 5.48 2.10 7.58 143 4.0 111.5 144.5 4.2 111 1.5 0.2 -0.555 68.5 8.03 4.59 12.62 140.5 3.4 109 143 3.5 108.5 2.5 0.1 -0.556 77.5 4.18 2.90 7.08 140.5 3.9 104.5 141.5 4.0 104 1 0.1 -0.557 69 4.24 3.29 7.52 141 4.4 109 141 4.5 108 0 0.1 -158 75 6.68 2.30 8.98 143 5.2 107.5 144 5.2 106.5 1 0.0 -159 61 8.47 32.93 41.39 138 4.0 107 145 4.2 106.5 7 0.2 -0.5

ParametroIndiretta ( Backman Coulter DXC600 ) Diretta ( EML100 )

Tabella 2. Medie dei risultati e differenza tra misura diretta e misura indiretta ( D – I )


12

Analogamente a quanto fatto in altri lavori simili (5,7), per poter stimare l’influenza dei

lipidi e delle proteine sulla misurazione degli elettroliti, i dati sono stati ordinati come in

tabella 2.

Nelle varie colonne dei parametri è stata riportata la media delle misure ottenute con la

prima e la seconda misura. La colonna in viola corrispondente alla media dei lipidi totali,

rappresenta la somma del valore dei trigliceridi e del colesterolo del dato campione,

mentre le altre tre colonne in viola rappresentano la differenza tra metodo diretto ed

indiretto; ciò è stato ottenuto sottraendo la misura indiretta da quella diretta. Questo

calcolo è stato effettuato per ogni elettrolita, quindi sodio, potassio e cloro.

La differenza tra la misura diretta-indiretta degli elettroliti è stata analizzata in funzione

della concentrazione totale di lipidi (colesterolo + trigliceridi) , rispettivamente della

concentrazione totale di proteine, secondo il metodo non parametrico di Passing & Bablok.


13

n 59

Range 4.220 to 48.710

Parametro ReplicatesTotal Lipid 1

Na D-I 1

Bias 95% CIConstant -2.99 -5.32 to -0.69

Proportional 0.59 0.32 to 0.89H0: Constant bias = 0. H1: Constant bias ≠ 0.H0: Proportional bias = 1. H1: Proportional bias ≠ 1.

Cusum linearity test - p > 0.1

INFLUENZA DEI LIPIDI SULLA DETERMINAZIONE DEGLI ELETTROLITI

Grafico 1. Passing & Bablok (Na D-I – Lipidi totali)

L’equazione che mette in relazione la concentrazione totale di lipidi con la differenza tra la

misura diretta e indiretta del sodio è:

D – I = -2,99 + 0,59 per concentrazione lipidica (Grafico 1)

La pendenza è significativamente diversa da 0 (o,59, intervallo di confidenza 0.32-0.89).


14

n 59

Range 4.220 to 48.710


K D-I 1

Bias 95% CIConstant 0.10 0.03 to 0.10


Cusum linearity test - p 0.05 < p < 0.1 (non-linear relationship between X and Y detected)

Si può quindi affermare che esiste un’influenza significativa del contenuto di lipidi sulla

differenza tra le due misure diretta e indiretta.

La relazione è di tipo lineare.

Grafico 2. Passing & Bablok ( K D-I – Lipidi totali )

Per quanto riguarda il potassio (Grafico 2), la pendenza non è significativamente diversa

da 0: si può quindi affermare che il contenuto totale di lipidi non influenza la misura del

potassio nel siero/plasma.

La relazione tra contenuto lipidico e la differenza D – I del potassio non è lineare.


15

n 59

Range 4.220 to 48.710


CL D-I 1




Grafico 3. Passing & Bablok ( Cl D-I – Lipidi totali )

L’equazione che mette in relazione i lipidi totali con la differenza tra metodo diretto e

metodo indiretto nella misurazione della concentrazione del cloro è:

D – I = -3,34 + 0,32 per concentrazione lipidica (Grafico 3)

La pendenza è significativamente diversa da 0 (0,32, intervallo di confidenza di

0.19–0.57). Si può quindi affermare che esiste un'influenza dei lipidi sulla misurazione del

cloro.

La relazione è di tipo lineare.


16

n 59

Range 40.00 to 90.00

Parametro Replicatesmedia Tp 1

Na D-I 1



Cusum linearity test - p < 0.01 (non-linear relationship between X and Y detected)

INFLUENZA DELLE PROTEINE TOTALI SULLA DETERMINAZIONE DEGLI

ELETTROLITI

Grafico 4. Passing & Bablok ( Na D-I – Proteine totali )

L’equazione che mette in relazione le proteine totali con la differenza tra metodo diretto e

metodo indiretto nella misurazione della concentrazione del sodio è:

D – I = -8,13 + 0,15 per concentrazione proteica (Grafico 4)


17

n 59

Range 40.00 to 90.00


K D-I 1

Bias 95% CIConstant -0.07 -0.31 to 0.10



La pendenza è significativamente diversa da 0 (o,15, intervallo di confidenza di 0.08-0.24),

per cui esiste un'influenza delle proteine sulla misurazione del sodio, ma questa influenza è

minore di quella che hanno i lipidi.

La relazione non è di tipo lineare, l’equazione di Passing Bablok è quindi

un’approssimazione della relazione esistente tra le due misure.

Grafico 5. Passing & Bablok ( K D-I – Proteine totali )


18

n 59

Range 40.00 to 90.00


CL D-I 1




Per quanto riguarda il potassio, la pendenza non è significativamente diversa da 0, quindi

la concentrazione delle proteine totali non ha un' influenza sulla concentrazione di potassio

nel siero/plasma. (Grafico 5)

La relazione tra le due misure è lineare e dipende probabilmente dal "bias" dei due

strumenti.

Grafico 6. Passing & Bablok ( Cl D-I – Proteine totali )


19

L’equazione che mette in relazione le proteine totali con la differenza tra metodo diretto e

metodo indiretto nella misurazione della concentrazione del cloro è:

D – I = -8,28 + 0,11 per concentrazione proteica (Grafico 6)

La pendenza è significativamente diversa da 0 (0,11, intervallo di confidenza di 0.06-0.17),

per cui esiste un'influenza delle proteine sulla misurazione del sodio, ma questa influenza è

minore di quella che hanno i lipidi.

La relazione tra il contenuto di proteine e la differenza D – I del cloro è di tipo lineare.


20

Discussione

Scopo di questo lavoro era di verificare se la concentrazione dei lipidi totali, o

rispettivamente quella delle proteine totali, avesse oppure no un'influenza sulla misura

diretta o indiretta.

Tramite questo lavoro abbiamo potuto stabilire che la ripetibilità, anche se buona per

entrambi gli apparecchi (tutte inferiori al 2%), per il sodio e il potassio è migliore con

l’apparecchio che utilizza il metodo ISE indiretto; mentre per il cloro è migliore il metodo

ISE diretto.

Per l’analisi dei dati è stato utilizzato il metodo non parametrico di Passing & Bablok,

siccome i valori (somma totale dei lipidi e differenza tra le misure degli elettroliti) non

sono distribuiti in modo normale.

L’influenza dei lipidi

Le differenze tra le misure dirette ed indirette del sodio e del cloro sono significativamente

dipendenti dalla concentrazione totale dei lipidi, ciò si può stabilire dato che le pendenze

delle linee di regressione sono, in entrambi i casi, significativamente diverse da 0.

L’influenza che hanno i lipidi sulla concentrazione del sodio è maggiore di quella che

hanno su quella del cloro, questo si deduce dal fatto che la pendenza della linea di

regressione è maggiore nel primo caso (0,59 > 0,32).

La differenza tra metodo diretto e indiretto nella misurazione del potassio non è invece

influenzata dai lipidi, essendo la pendenza della linea di regressione uguale a 0.

Analizzando le relazioni trovate per sodio (D – I = -2,99 + 0,59 x lipidi) e cloro

(D – I = -3,34 + 0,32 . lipidi), si può notare che, per avere una differenza di misura di

5 mmol/l tra la misura diretta e indiretta del sodio, è necessaria una concentrazione di

lipidi > 13.5 mmol/l. La stessa differenza si nota per il cloro a partire da una

concentrazione totale di lipidi > 26 mmol/l.

Fino a queste concentrazioni di lipidi, la differenza tra le due misure non è clinicamente

significativa, per cui non risulta necessario introdurre sistematicamente un fattore di

correzione per la misura di questi due elettroliti, essendo queste situazioni poco frequenti.

I laboratori devono però sapere che, a partire da una concentrazione totale di

lipidi > 13.5 mmol/l, la misura degli elettroliti per potenziometria diretta è senz’altro

preferibile.


21

L’influenza delle proteine

Analogamente a quanto stabilito con i lipidi, le differenze tra le misure dirette ed indirette

del sodio e del cloro sono influenzate dalla concentrazione proteica totale, in quanto le

pendenze delle linee di regressione sono significativamente diverse da 0. Anche in questo

caso la dipendenza è maggiore per il sodio (0,15 > 0,11). Si può comunque stabilire che

l’influenza delle proteine è minore rispetto a quella dei lipidi, essendo le pendenze minori.

Anche in questo caso, per avere differenze clinicamente significative sulla concentrazione

del sodio (>5 mmol/l), il contenuto totale di proteine deve essere > 87.5 g/l.

Per il cloro vale un discorso analogo a partire da una concentrazione totale di proteine

>120 g/l.

Queste situazioni sono nella pratica estremamente rare, per cui una correzione sistematica

delle misure non è necessaria.

Se, come da ipotesi, la differenza delle misure dirette e indirette è dovuta al volume

occupato da lipidi e proteine, ci saremmo dovuti aspettare una differenza analoga per

quanto riguarda la misura del potassio.

La differenza tra metodo diretto e indiretto nella misurazione del potassio non è invece

influenzata né dai lipidi, né dalle proteine, essendo la pendenza della linea di regressione

uguale a 0.

La sola spiegazione che abbiamo al riguardo, è dovuta al valore numerico dell’analisi,

inferiore a cloro e sodio. Per il potassio si misurano tipicamente valori di 3.5-5.0mmol/l.

I risultati sono arrotondati ad una cifra dopo la virgola, per cui eventuali effetti non molto

marcati scompaiono nell’errore di misura.

I risultati ottenuti confermano in sostanza quanto descritto in letteratura (5,6,7). Per avere

un’idea più precisa della relazione numerica tra contenuto di lipidi o proteine e differenza

nella misura degli elettroliti, si dovrebbe ampliare il collettivo di pazienti studiati,

selezionandoli in funzione di concentrazioni lipidiche e proteiche molto elevate. Non è

stato possibile farlo nell’ambito del presente studio, in quanto queste situazioni sono

abbastanza rare nella routine di tutti i giorni.


22

Conclusioni

Scopo del lavoro era di valutare l’influenza di lipidi e proteine sulla determinazione diretta

e indiretta degli elettroliti.

Un’influenza è stata osservata per quanto riguarda le analisi di sodio e cloro, non per

quanto riguarda la misura del potassio.

L’influenza dei lipidi è risultata molto più marcata rispetto a quella delle proteine.

Per raggiungere differenze clinicamente significative nella determinazione degli elettroliti

sono però necessarie concentrazioni di lipidi o proteine raramente riscontrate nella routine

(soprattutto per quanto riguarda la concentrazione proteica).

Si rinuncia quindi a mettere correzioni sistematiche sulle analisi.

Al laboratorio si raccomanda di preferire la determinazione diretta degli elettroliti quando

il contenuto lipidico totale eccede 13.5 mmol/l.


23

Bibliografia

1. Dipartimento di medicina di laboratorio EOC. D-10-015/D Sodio (Beckman) SOP.

15.02.2008

2. Dr. Giovanni Togni. Dispense Chimica clinica 2006/2007.

3. Dipartimento di medicina di laboratorio EOC. D-10-092/D Cloro (Beckman) SOP.

15.02.2008

4. Dipartimento di medicina di laboratorio EOC. D-10-016/D Potassio (Beckman)

SOP. 15.02.2008

5. Gabor B. Levy. Determination of Sodium with Ion-Selective Electrodes.

Chimical Chemistry, Vol. 27, No. 8, 1981

6. Anton H. J. Maas, et al. Ion-Selective Electrodes for Sodium and Potassium: A New

Problem of What Is Measured and What Should Be Reported.

Clinical Chemistry, Vol 31, No. 3, 1985

7. Goce Dimeski, et al. Effect of Hyperlipidemia on Plasma Sodium, Potassium, and

Chloride Mesurements by an indirect Ion-Selective Electrode Measuring System.

Clinical Chemistry, Vol 52, No. 1, 2006

8. Radiometer. EML105/100 Manuale dell’Operatore.

Immagine:

fig. 1. http://www.britannica.com/EBchecked/topic-art/292844/3147/An-ion-selective-

electrode-for-use-in-potentiometric-measurements, consultato il 25.05.09


24

Ringraziamenti

Ringrazio in primo luogo il Dr. Roberto Della Bruna per avermi seguito durante il lavoro di

diploma, per la pazienza e la disponibilità con le quali mi ha spiegato nozioni a me

completamente nuove.

In secondo luogo ringrazio tutto il personale del laboratorio della Carità, specialmente la

capo reparto Germana Tosi, per avermi permesso di eseguire il lavoro e, insieme al team

del laboratorio del Civico, di avermi tenuto da parte dei campioni che ho poi utilizzato.

Ringrazio anche il direttore Andrea Boffini, il Dr. Giovanni Togni, Sonja Marci, Daniela

Marcacci e Claudio Naiaretti per le nozioni di metodologia, i preziosi consigli e non da

ultimo le nozioni scientifiche di chimica clinica, che mi hanno permesso di svolgere questo

lavoro.

Ringrazio la professoressa Susan Gilbert per la sua disponibilità e passione con la quale mi

ha aiutato nella parte inglese del lavoro.

Un ringraziamento particolare va alla mia famiglia, mia mamma e mio papà, che hanno

letto e riletto il mio lavoro, anche senza essere del mestiere e magari senza capirci niente,

in cerca di errori ortografici, per la stampa e la rilegatura del lavoro, e per le crisi isteriche

che hanno sopportato in questo periodo.

Per ultime, ma non per questo meno importanti, vorrei ringraziare le mie compagne di

classe, che hanno ascoltato e riascoltato il mio lavoro di diploma, non solo in italiano, ma

in tedesco e inglese. Un ringraziamento speciale alla mia compagna e amica Sandra Jovic,

per i consigli e per aver ascoltato tutti i miei sfoghi riguardo a questo lavoro di diploma.

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