IMMUNOFENOTIPOCitometria a flusso

Identificazionepopolazione

cellulare

ago-aspirato midollare, linfonodale, sangue periferico liquor, versamenti

Caratterizzazione

popolazione cellulare

• linea di appartenenza• stadio di differenziazione• asincronia maturativa• presenza di aberrazioni antigeniche

Quantificazione

Intensita’ di espressione di un determinato Ag sulla cellula (MIF e ABC)

L ’esecuzione di una corretta analisi citofluorimetrica

su popolazioni neoplastiche NON PUO’ PRESCINDERE

DALLA CONOSCENZA DELLE CARATTERISTICHE

MORFOLOGICHE della popolazione da esaminare e

dal sospetto diagnostico

Citometria Vs Citometria a flusso

Citometria• e’ possibile localizzare un antigene•scarsa capacita’ di analizzare piu’ parametri•scarsa capacita’ di valutare i diversi sottotipi cellulari•valutazione morfologica quantitativa e qualitativa

Citometria a flusso• e’ possibile analizzare moltissime cellule in un tempo breve•capacita’ di analizzare piu’ parametri•approccio multiparametrico quantitativo e qualitativo

IMMUNOFENOTIPO

                                                                                                                    ELETTRONICA

cellule in sospensione

passano in singola fila attraverso

un volume illuminato dove esse riflettono/rifrattono la luce ed emettono fluorescenza che viene raccolta, filtrata e

convertita ad un valore digitale

che viene inviato al compiuter

OTTICA

FLUIDICA

Tecnica multiparametrica che misura le caratteristiche fisiche e/o chimiche di cellule insospensione all’interno di un fluido di trasporto

Citofluorimetria: definizione

Camera di flusso (componente fluida)

Citofluorimetro: principi

Citofluorimetro: principi

SPETTRI DI FLUOROCROMI

Analisi citofluorimetrica

Perche’ si guarda FSC Vs SSC

Dato che FSC “ dimensione cellulare” e SSC “ struttura interna”, la misurazione combinata dei due parametri permette di distinguere diversi tipi cellulari di una popolazione eterogenea di cellule

CD45: ANTIGENE PAN LEUCOCITARIO, ovvero ESPRESSO CON CARATTERISTICA INTENSITA’ SU LEUCOCITI MA ESPRESSO IN MODO ANOMALO SU

CELLULE BLASTICHE

CITOGRAMMA NORMALEESEMPIO DI CITOGRAMMA NORMALE: IL CD45

CD45: citogramma di un midollo normale

1-LYMPH2-MONO 3-GRAN

4-BLAST

5-ERY

Perche’ si guarda CD45 Vs SSC

Dato che SSC “ dimensione cellulare” e CD45” pan leucocitario” la misurazione combinata dei due parametri permette di distinguere diversi tipi cellulari di una popolazione eterogenea di cellule

SSC

CD

45

Maturazione mieloide: SIDE SCATTER

Normale Aberrante

CD45: ANTIGENE PAN LEUCOCITARIO, ovvero ESPRESSO CON CARATTERISTICA INTENSITA’ SU

LEUCOCITI MA ESPRESSO IN MODO ANOMALO SU CELLULE BLASTICHE

CITOGRAMMA NORMALEESEMPIO DI CITOGRAMMA PATOLOGICO (LEUCEMIA ACUTA)

CITOGRAMMA NORMALEESEMPIO DI CITOGRAMMA PATOLOGICO (LEUCEMIA ACUTA)

CD45: ANTIGENE PAN LEUCOCITARIO, ovvero ESPRESSO CON CARATTERISTICA INTENSITA’ SU LEUCOCITI MA ESPRESSO IN MODO ANOMALO SU

CELLULE BLASTICHE

STEM CELLSTEM CELL

CD117HLA-DRCD90CD38

CD34+Lymphoid progenitorLymphoid progenitor

CD19CD10CD22cCD79aTdTCD38sCD22CD24

B-progenitor

B lymphociteCD19

CD20CD22sCD79bFMC-7CD38sIgMIg kappaIg lambda

Cortical thymocytecCD3

CD1aCD2CD5CD7CD4 CD8CD38

T lymphocitesCD3CD7CD2CD5CD4CD8TCR a/bTCR g/d

CD34+

CD34+/- CD34-

CD34- CD34-

CD117HLA-DRCD90TdTCD38

CD117HLA-DRCDw123AC133CD33CD38

Myeloid progenitorMyeloid progenitor

CFU-GM CD33

CD13

Myeloblast

CD13CD33CD15

BFU-E/CFU-ECD36CD71Gli-A

CFU-MK

CD61CD41CD42a

CD34+

CD34+ CD34-

CD34-

CD34-

CD14CD11b

cCD79a

MPO

MATURAZIONE LINFOIDE B

MATURAZIONE LINFOIDE T

Schema di differenziazione delle cellule B normali

Sangue midollare da donatore sano Vs LAL B

Schema di differenziazione delle cellule B normali

SUPERFICIE

SCHEMA SEMPLIFICATO DELLA DIFFERENZIAZIONE LINFOIDE B

Marcatori B-lineage

CD4 CD2 CD5

CD5 CD2 CD4 C

D8

CD

3

CD

3

CD

8

CD

3

CD

3

Schema di differenziazione delle cellule T normali

SCHEMA SEMPLIFICATO DELLA DIFFERENZIAZIONE LINFOIDE T

Marcatori T-lineage

SUPERFICIE

IMMUNOFENOTIPOUtilizzo di 6-8 colori per la identificazione di antigeni di superficie,

citoplasmatici e nucleari; possibilita’ di studiare qualsiasi sospensione cellulare

Identificazione dei “leukemia-associated” Phenotypes (LAIP)

Firma fenotipica paziente-specifica

Utilizzo delle aberrazioni specifiche sia per la diagnosi che per lo studio della Malattia Minima Residua

IMMUNOFENOTIPO

Permette di IDENTIFICARE,QUANTIFICARE E CARATTERIZZARE gli elementi acquisiti (linea di appartenza, stadio di differenziazione, presenza di aberrazioni, intensita’ di espressione antigenica MIF e ABC)

In caso di antigeni specifici l’immunofenotipo può rispondere a domande su diagnosi, prognosi e malattia residua minima

Marcatori cellulari: la nomenclatura CDSi considera membro di un Cluster Differentiation un marcatore di superficie che:•identifica un particolare tipo cellulare o un certo stadio differenziativo

•ha una struttura biochimica definita

•è riconosciuto da un gruppo di MoAb diversi

FL2-H FL2-H FL2-H

Area di calcolo Area di calcolo

ABCABC ( (Antibody Binding CapacityAntibody Binding Capacity))

MIF La Mean Intensity Fluorescence è un valore fornito dal citofluorimetro e rappresenta il rapporto tra la fluorescenza del campione e quella dell’isotipo; e’ proporzionale ai siti di legame MIF= intensita’ media M2/intensita’ media M1

ABC Antibodies Bound per Cell è un valore

che si ottiene confrontando l’espressione di un antigene con una curva di riferimento costruita con rapporti noti tra molecole di antigene/valore di fluorescenza

ESPRESSIONE DI UN ANTIGENE

Ag aberranti: es. blasti di LAL della linea B con Ag T o mieloidi; blasti di LMA con Ag T o B

Espressione Ag asincrona: es. CD19/CD34/TdT/cyt. in LAL B, CD34/CD56 o CD15 in LAM

Espressione Ag “ectopica”: es. blasti di LAL-T a livello midollare, blasti TdT+ a livello extra-midollare

Diversa entità di espressione Ag: es CD10, CD19, TdT in LAL B

Assetti immunofenotipici leucemia-associati

Studio citofluorimetrico della MMRCOSA si va a cercare?

Metodi di analisi della Malattia Minima residua nelle Leucemie AcuteMetodi di analisi della Malattia Minima residua nelle Leucemie Acute

Con le tecniche convenzionali di citomorfologia è possibile identificare l'1-5% di cellule leucemiche in una popolazione di cellule normali

La sensibilità aumenta in modo significativo (fino a 10-4) quando vengono applicate tecniche immunologiche utilizzando anticorpi diretti contro antigeni di differenziazione delle serie linfoide ed enzimi selettivamente espressi negli stadi più precoci dell'ontogenesi

Grazie alla combinazione di tre metodologie (biologia molecolare, cariotipo, FCM) tutti i pazienti possono essere stratificati in più gruppi di rischio appropriato per la ripartizione terapia basata sul rischio

Misura della fluorescenza: utilità

Le cellule possono essere identificate grazie alle loro molecole di superficie e relativo specifico marker (CD, “cluster di differenziazione”)

Anticorpi monoclonali per specifici antigeni CD possono essere utilizzati per identificare il tipo di cellula

L’anticorpo monoclonale può essere coniugato con un Fluorocromo (FITC, PE, Tandem ECD, PC5………) e si può eseguire un test di immunofluorescenza diretta

STEM CELLSTEM CELL

CD117HLA-DRCD90CD38

CD34+Lymphoid progenitorLymphoid progenitor

CD34+

CD117HLA-DRCD90TdTCD38

CD117HLA-DRCDw123AC133CD33CD38

Myeloid progenitorMyeloid progenitor

CFU-GM CD33

CD13

Myeloblast

CD13CD33CD15

BFU-E/CFU-ECD36CD71Gli-A

CFU-MK

CD61CD41CD42a

CD34+

CD34+ CD34-

CD34-

CD34-

CD14CD11b

MPO

103

102

101

NeutrofiliMetamielocitiMielocitiPromielocitiMieloblasti

CD34

HLA-DR CD117

CD13

CD33

CD11b

CD64

CD65

CD54

CD10

CD35

CD13

Modificazioni fenotipiche durante la normale differenziazione neutrofila

MPO

CD15

CD16

SCHEMA SEMPLIFICATO DELLA DIFFERENZIAZIONE MIELOIDE

la granulopoiesi

SCHEMA SEMPLIFICATO DELLA DIFFERENZIAZIONE MIELOIDE

la monocitopiesi

I II III IV

Myelo/monoblast

CD34CD117HLA-DRCD13++CD33++

Promyelocyte

CD117CD13++CD33++CD15

Myelocyte

CD13 dimCD13 dimCD15CD11b*

Metamyelocyte Band cell

CD13CD33 dimCD15CD11bCD16*

CD34/CD117/CD45/CD13.33

CD15/CD11b/CD45/CD33

V

Neutrophil

CD13++CD33CD15CD11b++CD16++CD45**

CD16/CD13/CD45/CD11b

Maturazione mieloide

CD16

CD11b

CD16/CD11b/CD45/CD34

Adherence to

Fibrinogen,

Chemotaxis…

Neutrofilo

Maturazione mieloide

Maturazione mieloide

STEM CELLSTEM CELL

CD117HLA-DRCD90CD38

CD34+Lymphoid progenitorLymphoid progenitor

CD19CD10CD22cCD79aTdTCD38sCD22CD24

B-progenitor

B lymphociteCD19

CD20CD22sCD79bFMC-7CD38sIgMIg kappaIg lambda

Cortical thymocytecCD3

CD1aCD2CD5CD7CD4 CD8CD38

T lymphocitesCD3CD7CD2CD5CD4CD8TCR a/bTCR g/d

CD34+

CD34+/- CD34-

CD34- CD34-

CD117HLA-DRCD90TdTCD38

CD117HLA-DRCDw123AC133CD33CD38

Myeloid progenitorMyeloid progenitor

CFU-GM CD33

CD13

Myeloblast

CD13CD33CD15

BFU-E/CFU-ECD36CD71Gli-A

CFU-MK

CD61CD41CD42a

CD34+

CD34+ CD34-

CD34-

CD34-

CD14CD11b

cCD79a

MPO

CD34CD34 pos/CD45 pos =0.58%Gate Totale

0 256 512 768 1024

Capraro R. MO 13/9/04.001FSC-Height ->

10 10 10 10 100 1 2 3 4

Capraro R. MO 13/9/04.001CD45 Fitc ->

Gate Totale

0 256 512 768 1024

Lattanzi conc finale .001FSC-Height ->

CD34 pos/CD45 pos =0.7%

10 10 10 10 100 1 2 3 4

Lattanzi conc finale .001CD45 FITC ->

Midollo donatore sano

Aferesi donatore sano

0 256 512 768 1024

SCO 04B/1812.001FSC-Height ->

Gate Totale

10 10 10 10 100 1 2 3 4

SCO 04B/1812.001CD45 FITC ->

CD34 pos/CD45 pos =0.3%

Sangue cordone ombelicale