Il Progetto BUDGET Ricerca Industriale: 5.901.965 € Sviluppo Sperimentale: 1.337.462 €...

S.I.MI.S.A.

STATO AVANZAMENTO LAVORI SAL I – II - III

Il Progetto

S.I.Mi.S.A.“Strumenti Innovativi per il Miglioramento della Sicurezza

Alimentare”

BUDGET

Ricerca Industriale: 5.901.965 €Sviluppo Sperimentale: 1.337.462 €Formazione: 1.037.175 €

Responsabile scientifico: Dott. Angelo Visconti

Obiettivo Generale

L’obiettivo generale del progetto è la messa a punto di strumenti innovativi e affidabili per intervenire a livello di: PREVENZIONE – CONTROLLO – CORREZIONE della contaminazione al fine di contribuire alla realizzazione di un sistema integrato di sicurezza lungo tutta la filiera.

Key foods pugliesi: uva e vino, frumento e altri cereali e derivati, ed un insieme di prodotti freschi quali molluschi bivalvi, carni bovine, mozzarella e prodotti ortofrutticoli.

Selezionati in base a:rischio di contaminazione da differenti classi di contaminanti,valenza economica e territoriale,livello di interesse scientifico in termini di applicazione di tecnologie innovative.

Problematiche Tecnico-scientifiche

FILIERA VITI-VINICOLA

FILIERA CEREALICOLA

PRODOTTIFRESCHI

Ocratossina AFitofarmaciAllergeniBrettanomycesbruxellensis

MicotossineFitofarmaciFunghi tossigeniBacilliInsetti

Metalli pesantiPseudomonas spp.Patogeni emergentiListeriaSalmonella

RISULTATI ATTESI:Metodi rapidi e avanzati per la rivelazione di contaminanti chimici.

Nuovi metodi per il rilevamento di microrganismi patogeni e alteranti.Acquisizione di nuove conoscenze

Trasferimento tecnologico – Scale up industriale

Limiti imposti dalle normative – Esigenze reali delle imprese

Struttura del Progetto di Ricerca

% Avanzamento Rendicontazione per OR SAL I - II - III

OR1 OR2 OR3 OR4 OR5 OR6 OR7 OR80%

5%

10%

15%

20%

25%

30%

35%

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18% 18%

2%

36%

12%

19%

0%

% Avanzamento Rendicontazione per OS SAL I - II - III

OS 1.1 OS 2.1 OS 2.2 OS 2.3 OS 3.1 OS 3.2 OS 4.1 OS 5.1 OS 5.2 OS 5.3 OS 5.4 OS 6.1 OS 6.2 OS 7.1 OS 7.2 OS 7.3 OS 8.1 OS 8.2 OS 8.30%

10%

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76%

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9%

17%

40%

7%

25%

0% 0% 0%

Attività preliminari

OS 2.1: Messa a punto di metodiche di controllo per la selezione delle uve per la vinificazione e per la determinazione di ocratossina A in uva e vino

•Università degli Studi di Foggia - DiSA

OS 4.1: Messa a punto di metodiche per il trattamento di cariossidi di frumento con ozono gassoso e/o acqua ozonizzata per prevenire la contaminazione da microrganismi indesiderati e l'infestazione da insetti

•ISPA-CNR (Bari)•CDP srl

OS 6.1: Messa a punto di un protocollo biotecnologico per ridurre i rischi di alterazione da Pseudomonas spp. nelle mozzarelle

Università degli Studi di Bari, Dipartimento di Scienze del Suolo, della Pianta e degli Alimenti (DISSPA)Centro Latte Stasi (a cui, a breve, subentrerà Sanguedolce, Andria)Agriplan, Bari

OS7.2: Messa a punto di un prototipo per la diagnosi rapida di patogeni emergenti in molluschi bivalvi

•Università degli Studi di Foggia, SAFE•Università degli Studi di Bari, Dipartimento di Medicina Veterinaria •BonassisaLab srlSoggetto attuatore: D.A.Re. scrl

Avanzamento OS 2.1/ OS 4.1

€ 10,174.22

€ 315,033.78

Budget TOTALE OS 2.1 € 325.208,00

Rendicontato Residuo

€ 6,324.63

€ 294,826.37



Avanzamento OS 6.1//7.2

€ 31,738.81

€ 338,924.19



€ 51,462.84

€ 681,555.16



OR 1 – Strumenti Preventivi Innovativi per la Riduzione del Rischio di Microrganismi Alteranti in Vino

OS 1.1: Messa a punto di un protocollo biotecnologico per minimizzare lo sviluppo di lieviti del genere Brettanomyces e per ridurre la produzione e la presenza di etilfenoli nel vino

Partner: Università degli Studi di Foggia - Dipartimento Di Scienze Agrarie, degli Alimenti e

dell’Ambiente (SAFE) ISPA-CNR (Lecce)

Soggetto attuatore: D.A.Re. scrl

Avanzamento OS 1.1

OS 1.1

OS 2.1

OS 2.2

OS 2.3

OS 3.1

OS 3.2

OS 4.1

OS 5.1

OS 5.2

OS 5.3

OS 5.4

OS 6.1

OS 6.2

OS 7.1

OS 7.2

OS 7.3

OS 8.1

OS 8.2

OS 8.3

0%

10%

20%

30%

40%

50%

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€ 172,531.67

€ 267,396.33



Stato di avanzamento delle attività (al 30/04/2013)

Task 1.1.1: Sviluppo di metodiche biotecnologiche e cromatografiche per l'analisi delle dinamiche microbiche di Brettanomyces bruxellensis (M1-12)

- stato: completato

Task 1.1.2: Studio dell’influenza dei parametri fisico-chimici relativi alle vinificazioni aziendali sullo sviluppo di diversi ceppi di Brettanomyces bruxellensis isolati da vini pugliesi e sulla connessa produzione di etil-derivati (M5-25)

- stato: in corso (50% completamento)

Task 1.1.3: Studio di strategie di riduzione del rischio da Brettanomyces bruxellensis e definizione di un protocollo di prevenzione (M9-27)

- stato: in corso (35% completamento)OR Mesi

Attività 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36OR1

OS 1.1

A1.1.1.a X X X X X A1.1.1.b X X X X X A1.1.2.a X X X X X X A1.1.2.b X X X X X X A1.1.2.c X X X X X X A1.1.2.d X X X X X X X A1.1.3.a X X X X X X X X A1.1.3.b X X X X X X A1.1.3.c X X X X X X X X X X X

Risultati Principali – Task 1.1.1 (UNIFG, CNR)

Task 1.1.1: Sviluppo di metodiche biotecnologiche e cromatografiche per l'analisi delle dinamiche microbiche di Brettanomyces bruxellensis

Selezione di ceppi di Brettanomyces bruxellensis in vini pugliesi e validazione della metodica molecolare per l’identificazione e quantificazione rapida di B. bruxellensis in vino

Ottimizzazione di un metodo basato sull’applicazione dell’ HPLC per la quantificazione degli acidi idrossicinnamici e dei corrispondenti vinil- ed etil-derivati in vino


Task 1.1.2: Studio dell’influenza dei parametri fisico-chimici relativi alle vinificazioni aziendali sullo sviluppo di diversi ceppi di Brettanomyces bruxellensis isolati da vini pugliesi e sulla connessa produzione di etil-derivati

Studio sulla relazione tra sviluppo di B. bruxellensis, produzione di etilderivati, e diversi parametri chimico-fisici specifici delle vinificazioni svolte presso le aziende proponenti

Analisi del trascrittoma di un ceppo di B. bruxellensis accresciuto in mosto-vino


Task 1.1.3: Studio di strategie di riduzione del rischio da Brettanomyces bruxellensis e definizione di un protocollo di prevenzione

Protocollo di gestione delle risorse microbiche per la riduzione di B. bruxellensis e di fenoli volatili (etil-derivati) da esso prodotti.

Protocollo di utilizzo delle scorze cellulari di lieviti per la riduzione dei fenoli volatili (etilderivati) prodotti da B. bruxellensis in vino.

D254 D254+VP41 D254+VP41 pFA D254+MLOne D254+MLOne pFA Red Fruit

mg*L-1 ±Ds mg*L-1 ±Ds mg*L-1 ±Ds mg*L-1 ±Ds mg*L-1 ±Ds mg*L-2 diethyl malate 0,57 0,11 0,84 0,17 ? 0,83 0,41 0,98 0,10 0,40 diethyl succinate 1,01 0,85 1,09 0,34 3,78 1,70 1,01 0,18 1,20 0,32 0,46 ethyl lactate 3,41 1,28 3,62 1,47 4,32 1,12 2,87 0,74 5,35 0,41 2,10 monoethyl succinate 1,17 0,58 4,83 0,09 10,90 4,33 4,71 2,34 5,46 2,47 1,66 Σ esters malolactic 6,16 10,37 19,00 9,43 12,99 4,61 2-phenylethylacetate 0,05 0,01 0,65 0,09 1,20 0,53 0,32 0,06 0,45 0,12 0,40 3-hydroxy-ethylbutanoate 0,17 0,06 0,28 0,02 0,61 0,27 0,27 0,00 0,27 0,03 0,31 ethyl butanoate 0,28 0,03 0,64 0,45 0,80 0,56 0,46 0,24 0,60 0,05 0,25 ethyl decanoate 0,24 0,01 0,45 0,20 0,88 0,44 0,27 0,07 0,19 0,01 0,05 ethyl hexanoate 0,28 0,01 0,85 0,43 1,68 0,52 0,49 0,25 0,53 0,03 0,38 ethyl octanoate 0,27 0,02 0,56 0,06 1,97 0,89 0,55 0,18 0,76 0,16 0,05 ethyl vanillate 0,03 0,01 0,07 0,04 0,06 0,02 0,07 0,05 0,07 0,06 0,03 isoamyl acetate 0,28 0,03 0,57 0,01 0,75 0,32 0,30 0,05 0,42 0,03 0,28 Σ esters 7,76 14,42 26,95 12,16 16,28 6,37 1-butanol 0,41 0,22 0,46 0,25 2,28 1,13 0,47 0,28 0,33 0,04 0,37 2,3 butanediol 3,32 0,02 1,59 0,63 2,96 0,91 3,10 2,96 0,26 2,3 butanediol 1,20 0,18 1,41 0,28 1,21 0,46 1,25 0,38 0,07 2-phenylethanol 17,21 2,56 36,51 2,11 40,61 21,21 29,39 4,29 34,55 1,33 12,49 3-hexen-ol (E) 0,01 0,01 0,02 0,01 0,07 0,02 0,15 0,19 0,02 0,00 0,02 3-hexen-ol (Z) 0,02 0,01 0,03 0,01 0,66 0,18 0,03 0,01 0,03 0,00 0,04 hexanol 0,16 0,01 0,15 0,05 0,35 0,14 0,19 0,02 0,16 0,01 0,17 isoamylalcohols 85,34 9,81 128,62 13,60 132,40 5,92 128,55 13,12 137,63 11,11 80,18 isobutanol 2,80 0,07 8,97 1,86 13,60 3,71 6,65 0,23 8,67 2,44 1,43 propanol 14,15 2,87 19,87 8,89 19,20 5,88 12,54 9,42 3,21 Σ alcohols 105,96 193,44 212,86 188,81 198,30 98,25 2-methylpropanoic acid 0,11 0,05 0,18 0,08 0,51 0,22 0,17 0,04 2,12 0,23 0,13 3-methyl butanoic acid 0,54 0,12 0,73 0,03 1,66 0,67 0,67 0,05 0,67 0,02 0,59 benzoic acid 0,16 0,12 0,24 0,20 0,60 0,24 0,26 0,16 0,28 0,16 0,17 butanoic acid 0,24 0,03 0,58 0,24 0,15 0,06 0,54 0,13 0,32 0,02 0,36 decanoic acid 0,03 0,00 0,58 0,48 0,80 0,28 0,25 0,21 0,14 hexanoic acid 0,37 0,06 0,49 0,05 0,38 0,16 0,63 0,05 0,42 0,02 0,42 octanoic acid 0,31 0,20 0,36 0,25 0,40 0,16 0,31 0,04 0,36 0,01 0,48 phenylacetic acid 0,07 0,02 0,17 0,13 0,16 0,05 0,18 0,06 0,18 0,12 0,05 propanoic acid 0,60 0,24 0,05 0,03 0,23 0,05 Σ acids 1,83 3,31 5,27 3,05 4,58 2,35 acetoin 0,43 0,12 1,52 0,59 0,68 0,28 2,94 0,62 acetovanillone 0,04 0,01 0,07 0,02 0,08 0,04 0,08 0,05 0,08 0,05 0,06 benzaldehyde tr 0,20 0,05 0,38 0,14 tr butyrolactone 0,26 0,02 0,91 0,21 1,84 0,69 0,32 0,04 1,25 0,08 0,32 Σ other compounds 0,30 1,60 3,83 1,07 4,26 0,38

OR 2 – Strumenti di Controllo Innovativi per la Determinazione di Contaminanti in Uva e Vino

• OS 2.2: Messa a punto di una metodica multi-analita LC-MS(MS) e sviluppo di metodi rapidi per la determinazione di allergeni nel vino

Partner: ISPA-CNR (Bari)


Avanzamento OS 2.2

OS 1.1

OS 2.1

OS 2.2

OS 2.3

OS 3.1

OS 3.2

OS 4.1

OS 5.1

OS 5.2

OS 5.3

OS 5.4

OS 6.1

OS 6.2

OS 7.1

OS 7.2

OS 7.3

OS 8.1

OS 8.2

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€ 71,385.32

€ 347,875.68




OR Mesi Attività 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36

OR 2

OS 2.2

A2.2.1.a X X X X A2.2.1.b X X X X X X X X A2.2.1.c X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X A2.2.1.d X X X X X X X X X X X XA2.2.2.a X X X X X X X X X X X X A2.2.2.b X X X X X X X X X X X X A2.2.2.c X X X X X X X X X X X X

Task 2.2.1: Messa a punto di una metodica multi-analita LC-MS(MS) e sviluppo di metodi rapidi per la determinazione di allergeni in vini chiarificati (M1-36)

- stato: in corso (60% di completamento)

Task 2.2.2: Sviluppo di un immunosaggio basato su SPR per la determinazione di allergeni di latte e uova in vini chiarificati (M7-36)

- stato: in corso (20% di avanzamento)

Risultati Principali - Task 2.2.1 (ISPA-CNR)Task 2.2.1: Messa a punto di una metodica multi-analita LC-MS(MS) e sviluppo di metodi rapidi per la determinazione di allergeni in vini chiarificati

Attività 2.2.1.a - Sviluppata con successo una metodica sensibile e affidabile per la simultanea estrazione e purificazione di allergeni di latte e uovo in vini bianchi chiarificati con caseinati (chiarificante A) e bianco d’uovo (chiarificante B)Attività 2.2.1.b - Ottimizzate le condizioni di separazione ed analisi dei peptidi derivanti dall’idrolisi enzimatica della componente allergenica tramite HPLC-spettrometria di massa ad alta risoluzione Attività 2.2.1c - Almeno due proteine allergeniche rivelate (alfa caseina e beta caseina per agente A; ovalbumina e lisozima per agente B) ed almeno due peptidi identificati per ciascun allergene in campioni di vino chiarificato. Limiti di rivelabilità raggiunti con il metodo HPLC-MS/MS sviluppato: < 1 µg/mL

Monaci et al, Multiallergen quintification of fining-related egg and milk proteins in white wines by high-resolution-mass-spectrometry. Rapid Commun. Mass. Spec. 2013,27,2009-18.

Vino chiarificato Pretrattamento Allergene Idrolisi enzimatica Trattamento bioinformatico

Analisi HPLC-HRMS

http://www.ionsource.com/Instrumentation/ThermoFisher/Exactive.htm

Task 2.2.2: Sviluppo di un immunosaggio basato su SPR per la determinazione di allergeni di latte e uova in vini chiarificati

Valutazione di chip diversamente modificati e di diverse tipologie di anticorpi (mono e policlonali) mirati alla messa a punto di un immunosensore SPR per la rivelazione di allergeni di uovo

Ottimizzazione delle condizioni d’immobilizzazione (pH, forza ionica) dell’anticorpo biotinilato prescelto per la sua immobilizzazione indiretta su biochip di oro modificati con streptavidina.

Risultati Principali - Task 2.2.2 (ISPA-CNR)

Prism

Metal

Incidentlight

Reflectedlight

Reflectance

θ1 θ2Angle

(A)

RU

Time

RU1

RU2

(B) DIRECT

(C) SANDWICH

(D) COMPETITIVE

(E) INHIBITION

Immunosensore SPR

OR 2 – Strumenti di Controllo Innovativi per la Determinazione di Contaminanti in Uva e Vino

OS 2.3: Messa a punto di una metodica analitica per la determinazione di fitofarmaci in uva e vino e produzione di materiali di riferimento

OS 5.1: Messa a punto di una metodica analitica per la determinazione di fitofarmaci in cereali, produzione di miscele standard e materiali di riferimento

Partner: Lab. Instruments srl ISPA-CNR (Bari)


LE ATTIVITA’ DELL’OS 2.3 SONO SVOLTE CONGIUNTAMENTE A QUELLE DELL’OS 5.1

OR 3 – Strumenti Correttivi Innovativi per la Rimozione di Metaboliti Microbici Indesiderati nel Vino

OS 3.1: Messa a punto di un prototipo per la rimozione dell’ocratossina A (OTA) nel vino mediante la tecnica del ripasso continuo su vinacce/buccette

Partner: ISPA-CNR (Bari) Industrie Fracchiolla srl


Avanzamento OS 3.1

OS 1.1

OS 2.1

OS 2.2

OS 2.3

OS 3.1

OS 3.2

OS 4.1

OS 5.1

OS 5.2

OS 5.3

OS 5.4

OS 6.1

OS 6.2

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OS 7.2

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OS 8.1

OS 8.2

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€ 148,591.71

€ 664,053.29




Task 3.1.1 – Reperimento di vinacce esenti da OTA e di partite di mosti/vini naturalmente contaminati da OTA


Task 3.1.2 – Stabilizzazione delle vinacce


Task 3.1.4 – Sviluppo di un prototipo per il ripasso in continuo su vinacce e/o loro componenti


OR Mesi Attività 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36

OR 3

OS 3.1

A3.1.1.a X X X X X X X X X X X X X X X X A3.1.1.b X X X X X X X X X X X X X X X X A3.1.1.c X X X X X X X X X X X X X X X X A3.1.2.a X X X X X X X X X X X X A3.1.2.b X X X X X X X X X A3.1.3.a X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X A3.1.3.b X X X X X X X X A3.1.4.a X X X X X X X X A3.1.4.b X X X X X X X

Risultati Principali

Task 3.1.1: Reperimento di vinacce esenti da OTA e di partite di mosti/vini naturalmente contaminati da OTA

Task 3.1.2: Stabilizzazione delle vinacceTask 3.1.4: Sviluppo di un prototipo per il ripasso in continuo su vinacce

• Le vinacce (cv amarone) sono state reperite presso il centro di ricerca per la viticoltura di Conegliano (CRA).

• È stata stimata la carica microbica batterica e fungina iniziale mediante conta in piastra: 3,2·105 UFC/g (concentrazione batterica) 2,2·106 UFC/g (concentrazione fungina)• È stato valutato l’effetto delle diverse condizioni di stabilizzazione (°C, SO2, tempo) sulla carica batterica e

fungina• È stata misurata la concentrazione di OTA: 3,1 ± 0,2 µg/kg OTA

• È stato ideato (ISPA, Ind. Fracchiolla e consulente enologo) e realizzato (Ind. Fracchiolla) il primo prototipo per le prove di ripasso

Risultati Principali – Task 3.1.2 (ISPA-CNR)

Popolazione batterica presente nelle vinacce conservate a differenti temperature ed in presenza o assenza di SO2


Popolazione fungina nelle vinacce conservate a differenti temperature ed in presenza o assenza di SO2

Risultati Principali – Task 3.1.4 (Industrie Fracchiolla, ISPA-CNR)

• Sono stati condotti incontri di lavoro tra personale dell’ISPA-CNR, dell’Industrie Fracchiolla e dell’enologo coinvolto nell’attività progettuale per l’ideazione, la progettazione e la realizzazione di un miniprototipo da laboratorio per le prove di ottimizzazione delle condizioni e modalità di ripasso di vino contaminato da OTA su vinacce incontaminate

OR 3 – Strumenti Correttivi Innovativi per la Rimozione di Metaboliti Microbici Indesiderati nel Vino

OS 3.2: Sviluppo di metodologie bio-molecolari per la decontaminazione/degradazione dell’ocratossina A (OTA) nei mosti-vini

Partner: ISPA-CNR (Bari) ISPA-CNR (Lecce) IBBE-CNR


Avanzamento OS 3.2

OS 1.1

OS 2.1

OS 2.2

OS 2.3

OS 3.1

OS 3.2

OS 4.1

OS 5.1

OS 5.2

OS 5.3

OS 5.4

OS 6.1

OS 6.2

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€ 122,634.78

€ 541,305.22




Task 3.2.1: Isolamento e caratterizzazione di popolazioni microbiche in grado di degradare l'OTA (M1-24)

stato: in corso (65 % completamento)

Task 3.2.2: Identificazione di geni codificanti gli enzimi correlati alla degradazione di OTA in isolati microbici naturali (M7-34)

stato: in corso (40 % completamento)

OR Mesi Attività 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36

OR 3

OS 3.2

A3.2.1.a X X X X X X X X X X X X A3.2.1.b X X X X X X X X X A3.2.1.c X X X X X X X X X A3.2.2.a X X X X X X A3.2.2.b X X X X X X X X X X X X X X X A3.2.2.c X X X X X X X X X X X X X X X X X A3.2.3.a X X X X X X X X X X X XA3.2.3.b X X X X X X X X X X X X

Risultati Principali - Task 3.2.1 (ISPA CNR)

Attività 3.2.1.a - Individuazione dei campi e campionamento

Sono stati individuati 4 vigneti rappresentativi dell’areale di coltivazione delle varietà Negroamaro e Primitivo.

Sono stati effettuati campionamenti di terreno, tralci e grappoli.Attività 3.2.1.b - Analisi chimica

E’ stata messa a punto una metodica analitica per la determinazione simultanea di OTA e OTalpha nei diversi substrati liquidi mediante HPLC/FLD. Attività 3.2.1.c - Analisi microbiologica

Due fermentazioni spontanee, effettuate utilizzando le uve Negroamaro e Primitivo sono state campionate durante 5 fasi del processo.

E’ stata studiata la dinamica di popolazione di lieviti in vinificazione spontanee.

Sono stati isolati e identificati 35 ceppi di lievito per ciascuna delle 5 fasi

E’ stata indagata la capacità di degradare OTA da parte di 96 ceppi di batteri malolattici.

Risultati Principali - Task 3.2.2 (ISPA CNR, IBBE CNR)

Attività 3.2.2.a - Messa a punto di metodiche estrazione di DNA e RNA dai campioni di mosto Il metodo di estrazione di DNA messo a punto consente, partendo da matrici complesse derivate dalla filiera vitivinicola, di ottenere materiale genetico appartenente a microrganismi anche molto distanti dal punto di vista tassonomico (procarioti ed eucarioti).

Sequenziamento su vasta scala dell’intero metagenoma o metatrascrittoma

Estrazione del DNA appartenente all’intera comunità microbica

Screening di particolari marcatori genetici di specie che sono selettivamente

sequenziati

CAMPIONE

Caratterizzazione bioinformatica della complessità genetica e tassonomica della comunità microbica

Il metodo sviluppato prevede l’associazione di un kit commerciale di estrazione del DNA da suolo (FAST DNA kit for soil della DBA Italia) con una serie di trattamenti sviluppati per eliminare le impurità e, quindi, aumentare la resa di estrazione e successiva amplificazione di marcatori genetici per la creazione di librerie di sequenziamento NGS.

Risultati Principali - Task 3.2.2 (ISPA CNR, IBBE CNR)

Mosto ad inizio fermentazione

Acqua di lavaggio dei grappoli

Campione Resa DNA (ng/μl) Purezza A260/A280

1 47.2 1.65

2 41.7 1.65

3 40.5 1.49

4 51.3 1.70

5 28.2 1.88

6 26.6 1.73

7 26.8 1.69

8 26.9 1.71

9 29.5 1.60

1500 bp1000

250

Estrazione del metagenoma

Acqua di lavaggio dei grappoli

Mosto

Attività 3.2.2.a - Messa a punto di metodiche estrazione di DNA e RNA dai campioni di mosto : RISULTATI

28S rDNA

its1

its4

5.8S

rDNAITS1 ITS218S rDNA

400-900 pb(variabile in relazione alla specie)

Amplificazione del marcatore tassonomico fungino: rDNA ITS1-5.8S-ITS2

M 11

1500 bo

1000 750 500

250

Dimensione attesa dell’amplicone

Amplificazione del marcatore tassonomico batterico:Gene codificante per l’rRNA 16S

1500 pb

Dimensione attesa dell’amplicone

M 11

16Sd 16Sr

Primers ITS1/ITS4: 5’-GTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3’/5’ TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’Cavalieri, D. et al (2003). J. Mol. Evol., 57, S226–S232.

Primers 16Sd/16Sr: 5’-GCTGGCGGCATGCTTAACACAT-3’/5’-GGAGGTGATCCAGCCGCAGGT-3’Ruiz, A. et al (2000 Int. J. Syst. Evol. Micr., 50, 1981-1987.

OR 5 – Strumenti di Controllo Innovativi per la Determinazione di Contaminanti in Cereali e Derivati

OS 2.3: Messa a punto di una metodica analitica per la determinazione di fitofarmaci in uva e vino e produzione di materiali di riferimento

OS 5.1: Messa a punto di una metodica analitica per la determinazione di fitofarmaci in cereali, produzione di miscele standard e materiali di riferimento

Partner: Lab. Instruments srl ISPA-CNR (Bari)


Avanzamento OS 2.3

OS 1.1

OS 2.1

OS 2.2

OS 2.3

OS 3.1

OS 3.2

OS 4.1

OS 5.1

OS 5.2

OS 5.3

OS 5.4

OS 6.1

OS 6.2

OS 7.1

OS 7.2

OS 7.3

OS 8.1

OS 8.2

OS 8.3

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

39%

3%

17%

76%

18% 18%

2%

48%

21%

39% 40%

9%

17%

40%

7%

25%

0% 0% 0%

€ 66,638.23

€ 20,501.77



Avanzamento OS 5.1

OS 1.1

OS 2.1

OS 2.2

OS 2.3

OS 3.1

OS 3.2

OS 4.1

OS 5.1

OS 5.2

OS 5.3

OS 5.4

OS 6.1

OS 6.2

OS 7.1

OS 7.2

OS 7.3

OS 8.1

OS 8.2

OS 8.3

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

39%

3%

17%

76%

18% 18%

2%

48%

21%

39% 40%

9%

17%

40%

7%

25%

0% 0% 0%

€ 64,686.47 € 70,809.53




Task 2.3.1 - Studio di fattibilità, sviluppo di materiali di riferimento (RM) e loro certificabilità per l’analisi multi residuale di fitofarmaci nella matrice vino mediante strumenti di controllo innovativi (M1-36)

stato: in corso (50% completamento)

Task 2.3.2 - Sviluppo e validazione di metodiche multiresiduali in alta risoluzione (LC-HRMS) per la determinazione di fitofarmaci untargeted nel vino (M7-36) stato: in corso (20% completamento)

OR Mesi Attività 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36

OR 2

OS 2.3

A2.3.1.a X X X X X X X X X X X X A2.3.1.b X X X X X X X X X X X X X X X X X X A2.3.1.c X X X X X X X X X X X X A2.3.1.d X X X X X X X X X X X X A2.3.1.e X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X A2.3.1.f X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X A2.3.1.g X X X X X X X X X X X X X X X X X XA2.3.2.a X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X A2.3.2.b X X X X X X X X X X X XA2.3.2.c X X


Task 5.1.1: Individuazione delle sottoclassi di fitofarmaci, studio dell’effetto matrice (frumento) sull’analisi strumentale di fitofarmaci, di solubilità, stabilità ed allestimento delle aliquote da destinare al proficiency test (M1-30)


Task 5.1.2: Sviluppo e confronto di metodiche di rivelazione basate sull’uso di spettrometri di massa ad alta risoluzione (untargeted analysis) e spettrometri a triplo quadrupolo (targeted analysis) (M7-36) stato: in corso (20% completamento)

OR Mesi

Attività 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36

OR 5

OS 5.1

A5.1.1.a X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X

A5.1.1.b X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X

A5.1.2.a X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X

A5.1.2.b X X X X X X X X X X X X

Risultati Principali – Task 2.3.1 e 5.1.1 (Lab.Instruments)

Task 2.3.1 e Task 5.1.1: studio di fattibilità e sviluppo di materiali di riferimento

Materiali di riferimento in soluzione standard

- Approvvigionamento - Allestimento di soluzioni di singoli fitofarmaci e caratterizzazione delle caratteristiche chimico-fisiche e

redazione di “schede prodotto” (circa 220)- Individuazione di sottoclassi da raggruppare in miscele - Allestimento di miscele - Avviamento dell studio di stabilità delle miscele

Risultati Principali - Task 2.3.2 e 5.1.2 (Lab.Instruments)

Task 2.3.2 e Task 5.1.2: studio di fattibilità e sviluppo di materiali di riferimento

Materiali di riferimento in matrice

- Raccolta di informazioni in merito all’utilizzo cultivar-specifico di fitofarmaci- Screening e caratterizzazione delle matrici “bianche” per l’allestimento di materiali di riferimento

Da un set di 20 campioni di VINO BIANCO (circa 2 L per campione) raccolti da produttori privati sono stati

selezionati 8 campioni con tenore di fitofarmaci inferiore al limite di rivelabilità E’ un corso la caratterizzazione di un set di 20 campioni di FRUMENTO (duro e tenero) provenienti dal mercato

locale


MISCELA ORGANOTIOFOSFORATI/ N-CARBAMOIL-OSSIME

AldicarbAldicarb sulfossido Aldicarb sulfone

Valutazione di N-carbamoil-ossime in solvente organico, monitoraggio delle potenziali variazioni temporali dei rapporti tra segnali relativi a differenti “metaboliti”, studio della sensitività della classe, valutazione della stabilità accelerata e temporale in matrice

Dimethoate Omethoate

Studio degli isosteri, eventuale interconversione in solvente

Formetanate hydroclorideMethamidophos MethomylOxamylPhosdrinMonocrotophosVamidothionFenthion o sulfossido Demeton-s-methyl sulfossido Demeton-s-methyl sulfone

Incusione di differenti organofosforati e di analoghi al fine di caratterizzare sul sistema analitico di riferimento le posizioni relative dei segnali (ottimizzazione della fase cromatografica), valutazione degli eventuali isomeri strutturali, scelta delle condizioni di ionizzazione ottimali che permettano un sufficiente grado di sensitività della miscela.

ESEMPIO: miscela formulata per essere inclusa nella matrice VINO

Risultati Principali - Task 2.3.2 e 5.1.2 (Lab.Instruments)

Task 2.3.2 e Task 5.1.2: sviluppo di metodiche multiresiduali basate sulla spettrometria di massa ad alta risoluzione (LC-HRMS)

Ottimizzazione delle condizioni strumentali (rivelazione in HRMS e MS/MS) mediante analisi delle soluzioni di fitofarmaci allestite nell’ambito delle Tasks 2.3.1 e 5.1.1.

Sviluppo di procedure di preparazione del campione (QuEChERs sviluppati dalla Lab Instrument s.r.l.)


OS 5.2: Messa a punto di una metodica multi-micotossina in cereali e derivati e produzione di materiali di riferimento

Partner: ISPA-CNR (Bari) Lab. Instruments srl


Avanzamento OS 5.2

OS 1.1

OS 2.1

OS 2.2

OS 2.3

OS 3.1

OS 3.2

OS 4.1

OS 5.1

OS 5.2

OS 5.3

OS 5.4

OS 6.1

OS 6.2

OS 7.1

OS 7.2

OS 7.3

OS 8.1

OS 8.2

OS 8.3

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

39%

3%

17%

76%

18% 18%

2%

48%

21%

39% 40%

9%

17%

40%

7%

25%

0% 0% 0%

€ 78,616.61

€ 291,261.39




Task 5.2.1: Produzione di materiali di riferimento (farine di frumento e mais) multi-micotossina (M1-36) stato: in corso (50% completamento)

Task 5.2.2: Sviluppo di metodiche multianalita LC-MS(MS) per micotossine in cereali e prodotti derivati (M1-36) stato: in corso (50% completamento)

OR Mesi Attività 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36

OR 5

OS 5.2

A5.2.1.a X X X X X X A5.2.1.b X X X X X X A5.2.1.c X X X X X X A5.2.1.d X X X X X X A5.2.1.e X X X X X X X X X X X X A5.2.1.f X X X X X X X X X X X XA5.2.2.a X X X X X X A5.2.2.b X X X X X X X X X A5.2.2.c X X X X X X X X X X X X A5.2.2.d X X X X X X A5.2.2.e X X X X X X X X X X X X

Risultati Principali- Task 5.2.1 (ISPA-CNR)

Livelli desiderati (µg/kg)

MAIS FRUMENTO

DON 750 750

ZEA 100 75

FB1 + FB21000 n.a.

T-2 + HT-2 100 50

Aflatossine totali 4 4

OTA 3 3

Per i livelli target ci si è riferiti ai regolamenti 1881/2006/EC (aflatossine e OTA), 1126/2007/EC (DON, ZEA, fumonisine) e alla raccomandazione 2013/165/EU (somma di T-2 e HT-2) delle quali sono stati considerati i limiti massimi stabiliti per frumento e mais destinati al consumo umano diretto.

Task 5.2.1: Produzione di materiali di riferimento (farine di frumento e mais) multi-micotossina


MAIS naturalmente contaminato da DON, FB1, FB2 (30 kg)

Estratti da colture di F. sporotrichioides (T2-HT2)F. gramienarum (DON-ZEA)A. flavus (AFs)A. parasiticus (AFs) A. ochraceous (OTA) Miscelazione e

omogeneizzazioneSuddivisione in aliquote da 80 g

Studio di OMOGENEITA’STABILITA’

La stessa strategia è stata utilizzata per la produzione del FRUMENTO contaminato da tossine di Fusarium e OTA


Micotossine sottoposte a regolamentazione Riferimento normativo

Deossinivalenono (DON) Regolamento 1126/2007/ECZearalenone (ZEA) Regolamento 1126/2007/EC

Fumonisine(FB1 + FB2) Regolamento 1126/2007/EC

Tossine T-2 e HT-2 Raccomandazione 2013/165/EU

Aflatossine totali (AFB1 + AFB2 AFG1 + AFG2) Regolamento 1881/2006/EC

Ocratossina A (OTA) Regolamento 1881/2006/ECMicotossine emergenti MotivazioneNivalenolo (NIV) Opinione EFSA (EFSA Journal 2013;11(6):3262)3 e 15-acetil DON Inclusi dal JECFA nel PMTDI insieme al DON (JECFA/72/SC)DON-3-glucoside Contaminante naturale insieme al DON, richiesti dati di incidenza (JECFA/72/SC)T-2 e HT-2 glucoside Contaminante naturale insieme a T-2 e HT-2, richiesti dati di incidenza (Raccomandazione

2013/165/EU)Fumonisine idrolizzate Contaminanti naturali del mais e/o prodotte durante il processamento del mais

Task 5.2.2: Sviluppo di metodiche multianalita LC-MS(MS) per micotossine in cereali e prodotti derivati


Estrazione sequenzialeacqua e metanolo

(4 min)

Purificazione su IACMULTI-ANTICORPO

FrumentoMais

Snack a base di mais Cereali per colazione

Analisi LC-MS/MS

NIVDONAFB1, B2, G1, G2

OTAFB1, FB2

OTAZEAT-2, HT-23-/15-AcDON

DON-3-glucoside

HT-2/T-2-glucoside

PHFBs, HFBs…altri metaboliti….

Analisi LC-HRMS

Purificazione sucolonnine SPE

APPROCCIO ALTERNATIVO


OS 5.3: Messa a punto di una metodica analitica unica per la determinazione di fitofarmaci e micotossine in cereali e derivati

Partner: BonassisaLab srl Università degli Studi di Foggia, Dipartimento Di Scienze Agrarie, degli Alimenti e

dell’Ambiente (SAFE)


Avanzamento OS 5.3

OS 1.1

OS 2.1

OS 2.2

OS 2.3

OS 3.1

OS 3.2

OS 4.1

OS 5.1

OS 5.2

OS 5.3

OS 5.4

OS 6.1

OS 6.2

OS 7.1

OS 7.2

OS 7.3

OS 8.1

OS 8.2

OS 8.3

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

39%

3%

17%

76%

18% 18%

2%

48%

21%

39% 40%

9%

17%

40%

7%

25%

0% 0% 0%

€ 227,691.29

€ 354,686.71




OR Mesi

Attività 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36

OR 5

OS 5.3

A5.3.1.a X X X X

A5.3.1.b X X X X X X X X X X

A5.3.1.c X X X X

A5.3.1.d X X X X X X X X X X X X X X X X X X

Task 5.3.1: Sviluppo di una metodica unica per la determinazione di fitofarmaci e micotossine in cereali e derivati (M3-36)


Risultati Principali – Task 5.3.1 (BonassisaLab)

I principali risultati scientifici:

Implementazione, validazione e accreditamento di un metodo per la determinazione di micotossine su filiera cerealicola:

10 g campione – estrazione con miscela acetonitrile/acqua/acido acetico in rapporto 1:2– nessuna fase di purificazione – analisi in LCMSMS

Implementazione, validazione di un metodo per la determinazione di residui di fitofarmaci in cereali e derivati:

10 g campione – estrazione con acetonitrile acqua – purificazione con SPE – analisi LCMSMS e GCMSMS

Sviluppo di una metodica unica per la determinazione di micotossine e pesticidi

10 g campione estrazione con miscela acetonitrile/acqua formiata (5mMol ) – analisi LCMSMS e GCMSMS


Metodo multi-micotossina LC/MSMS: Determinazione di tutte le 11 micotossine normate nel REG CE 1881/2006(aflatossine, ocratossina A, deossinivalenolo, zearalenone, tossine T-2 e HT-2, fumonisine)

RISULTATI DELLA VALIDAZIONE In conformità al Reg. CE 401/2006 sono stati valutati i criteri di rendimento del metodo per ciascuna micotossina, pertanto è stata calcolata sia la deviazione standard relativa (RSDr ), calcolata a partire dai risultati ottenuti in condizione di ripetibilità, sia il recupero attraverso un’aggiunta in matrice.

CRITERIO DI IDONEITA’ ALLO SCOPOIl laboratorio ha verificato un’incertezza massima standard adeguata per tutte le micotossine


Metodo LC-MS/MS per la determinazione di 270 fitofarmaci

Validazione del metodo in accordo con:Document No. SANCO/10684/2009METHOD VALIDATION AND QUALITY CONTROL PROCEDURES FOR PESTICIDE RESIDUES ANALYSIS IN FOOD AND FEED


Multi GC/MSMS: metodo da 350 molecole


OS5.4: Sviluppo di metodi rapidi per la determinazione di micotossine in cereali e derivati

Partner: ISPA-CNR (Bari) Molini Tandoi Spa


Avanzamento OS 5.4

OS 1.1

OS 2.1

OS 2.2

OS 2.3

OS 3.1

OS 3.2

OS 4.1

OS 5.1

OS 5.2

OS 5.3

OS 5.4

OS 6.1

OS 6.2

OS 7.1

OS 7.2

OS 7.3

OS 8.1

OS 8.2

OS 8.3

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

39%

3%

17%

76%

18% 18%

2%

48%

21%

39% 40%

9%

17%

40%

7%

25%

0% 0% 0%

€ 187,958.26

€ 278,760.74




Task 5.4.1: Messa a punto di immunosaggi a polarizzazione di fluorescenza (FP) per la determinazione di OTA, DON e tossine T-2 e HT-2 in cereali e prodotti derivati (M1-30) stato: in corso (60% completamento)

Task 5.4.2: Messa a punto di un saggio lateral flow (LF) per la determinazione di OTA in cereali e prodotti derivati (M13-36) stato: in corso (15% completamento)

Task 5.4.3: Messa a punto di metodi di spettroscopia nel vicino infrarosso (FT-NIR) per la determinazione semi-quantitativa/qualitativa di DON e OTA in cereali e prodotti derivati (M3-36) stato: in corso (30% completamento)

Task 5.4.4: Messa a punto di un metodo basato sul naso elettronico con tecnologia MOS per la determinazione di DON e OTA in cereali e prodotti derivati (M5-36) stato: in corso (40% completamento)


Attività 5.4.1.a – Sintesi e isolamento di derivati fluorescenti (traccianti) delle micotossine: Sono stati sintetizzati, isolati e caratterizzati i traccianti (1 per il DON, 4 per T-2 e HT-2 e 1 per OTA).

Obiettivo intermedio a 12 mesi (almeno 1 tracciante per tossina): raggiunto

Attività 5.4.1.b – Studio dell’interazione tracciante-anticorpo e messa a punto di un metodo competitivo in soluzione

Sono stati sviluppati tre immunosaggi competitivi per la determinazione di DON, T-2+HT-2 e OTA in soluzione.

O

O

OHOH

O

OHN

O

O

OO

O

OH

B

B

OH

OH

NN

O

NN

NH2

O

O

OH

O OH

O

O

OHOH

O

O

O

NN

O

O

OO

O

OH

B

7,15-O-(butilboronil)-DON

DON 7,15-O-(butilboronil)-DON

O

O

OHOH

O

O

O

NN

O

O

OHOH

OO NH

O

O

O

OH

O OH

+

+

a) acetone anidro T.A.

b)

NaHCO3 0.1M

1,1'-carbonildiimidazolo 3-O-(imidazolcarbonil)-DON

3-O-(imidazolcarbonil)-DON 4'-(aminometil)-fluoresceina DON-FL

pH=8,2

+

T.A.agitazione

acido 1-butilboronico

H2O

NH2

O

O

OH

O OH

+

NaHCO3 0.1M

3-O-(imidazolcarbonil)-T2 4'-(aminometil)-fluoresceina T2-FL

pH=8.2O

CH3

CH3 O

O

OH

O

CH3

O

O CH3

O

HH

HCH3

CH3

O

O

NN

O

CH3

CH3 O

O

OH

O

CH3

O

O CH3

O

HH

HCH3

CH3

O

O

NH O

O

OH

O

OH

NN

O

NN+

a) acetone anidro

b) H2O

T-2 1,1'-carbonildiimidazolo 3-O-(imidazolcarbonil)-T2

O

CH3

CH3 O

O

O

OH

H

O

CH3

O

O CH3

O

HH

HCH3

CH3

O

CH3

CH3 O

O

OH

O

CH3

O

O CH3

O

HH

HCH3

CH3

O

O

NN

T.A.

1)

2)

0.1 1 10

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

No

rma

lize

d P

ola

riza

tion

[OTA] ng/mL

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

2.3 2.5 2.7 2.9 3.1 3.3

No

rma

lize

d P

ola

riza

tion

Log[OTA] pg/mL

r = 0.996

Po

lari

zzaz

ione

Nor

mal

izza

ta

Pol

ariz

zazi

one

Nor

mal

izza

ta

OH

NH

O

Cl

O

CH3

H

O

H

O

OH

D M FT.A .+

O TA N - id ross isuccin iim m ide 3 - O - succin il- O TA

N

O

O

OH + NNN

CH3

CH3

C

1- etil- 3 - ( 3 - d im etilam inoprop il) - carbod iim ide

NH

O

Cl

O

CH3

H

O

H

O

OHN

O

O

O

ag itaz ione .

3 - O - succin il- O TA

NH

O

Cl

O

CH3

H

O

H

O

OHN

O

O

O

NH2

O

O

OH

O OH

NH

O

O

OH

O OHN

HO

Cl

O

CH3

H

O

H

O

OH

+

4 '- am m inom etil fluoresce ina O TA - FL

M assa esatta de l p ro tonato= 747 .174551 D a

D M FT.A .


Attività 5.4.1.c – Sviluppo di un protocollo di estrazione compatibile con l’immunosaggio e valutazione delle performance analitiche dell’immunosaggio FP

E’ stato sviluppato e validato un immunosaggio FP per la determinazione di OTA in frumento.

y = -1.63+1.15xr = 0.995

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

[OTA

] µg

/kg

(FP

)

[OTA] µg/kg (HPLC)

Lippolis V., Pascale M., Valenzano S., Porricelli A.C.R., Suman M. and Visconti A. (2013), Food Analytical Methods, DOI 10.1007/s12161-013-9627-3

Sensibilità (LOD; LOQ) 0.8 µg/kg; 2.0 µg/kg

Accuratezza (media) 87% (range 3-10 µg/kg)

Precisione (CV %) - 6%

Intervallo di linearità 2 – 12.5 µg/kg

Tempo di analisi - 20 min


Attività 5.4.2.a - Messa a punto di un saggio LF basato sull’utilizzo dell’aptamero per la determinazione di OTA in soluzione

E’ stata valutata l’affinità di 7 diversi aptameri per l’OTA.

0 1 000 2 000 3 000 4 000 5 0000

50

100

150

200

250

300

Concentrazione aptamero (nM)

Val

ote

FP

(m

P)

kd

Bmax

Kd = 125 ± 23 nMBmax = 265 ± 12%

Aptamero #1: 5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3’ 36 basi, PM = 11311 Da

Aptamero #2: 5’-CTGGGTGTGGGGTGATCAAGGGAGTAGACT-3’ 30 basi, PM = 9423 Da

Aptamero #3: 5’-CGGGTGTGGGTGCCTTGATCCAGGGAGTCT-3’ 30 basi, PM = 9326 Da Aptamero #4: 5’-GGGAGGACGAAGCGGAACCGGGTGTGGGTGCCTTGATCCAGGGAGTCTCAGAAGACACGCCCGACA-3’

66 basi, PM = 20569 Da Aptamero #5: 5’-AGCCTCGTCTGTTCTCCCGGCAGTGTGGGCGAATCTATGCGTACCGTTCGATATCGTGGGGAAGACAAGCAGACGT-3’

76 basi, PM = 23507 Da Aptamero #6: 5’-GGCAGTGTGGGCGAATCTATGCGTACCGTTCGATATCGTG-3’

40 basi, PM = 12399 Da Aptamero #7: (T)22-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-(T)3

61 basi, PM = 18916 Da

Risultati Principali – Task 5.4.3 (ISPA-CNR, Molini Tandoi)

Attività 5.4.3.a - Selezione di campioni di cereali e prodotti derivati naturalmente contaminati previa analisi con metodo analitico di riferimento

Sono stati analizzati mediante metodi HPLC di riferimento : 186 campioni di frumento duro naturalmente contaminati da DON (105 selezionati att. 5.4.4.a); 37 campioni di crusca di frumento duro naturalmente contaminati da DON; 9 campioni di farinaccio di frumento duro naturalmente contaminati da DON; 20 campioni di frumento duro naturalmente contaminati da OTA.

Attività 5.4.3.b - Sviluppo di rette di calibrazione e di modelli discriminanti FT-NIR specifici per ciascuna micotossina e matrice selezionata

Sono stati costruiti un modello quantitativo (retta PLS) e un modello qualitativo (modello discriminante) per la predizione del contenuto di DON in campioni di crusca di frumento duro.

y = 0,82x + 129R² = 0,82r = 0,91

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

[DO

N]

µg/k

g (

FT

-NIR

)

[DON] µg/kg (HPLC)


Attività 5.4.4.a - Calibrazione del naso elettronico per la classificazione di campioni di cereali e prodotti derivati a differente contenuto di DON e OTA

E’ stato sviluppato un modello di calibrazione per la discriminazione di campioni di frumento duro a differente contenuto di DON mediante naso elettronico a tecnologia MOS.

Analisi (n=525)

Analisi DFA*

105 campioni (macinato)

Classe A ([DON, µg/kg]<1000) - Campioni conformi

Classe B (1000 ≤ [DON, µg/kg] ≤ 2500) - Campioni all’analisi di conferma

Classe C ([DON, µg/kg]>2500) - Campioni non conformi

OR 6 – Strumenti Innovativi per la Prevenzione del rischio di Contaminazione di Prodotti Freschi

OS 6.2: Impiego di compost e strategie agronomiche innovative per ridurre il contenuto di metalli pesanti nelle produzioni orticole da consumo fresco

Partner: ISPA-CNR (Bari) Università degli Studi di Bari – Dipartimento di Scienze del Suolo, della Pianta e

degli Alimenti (DiSSPA)


Avanzamento OS 6.2

OS 1.1

OS 2.1

OS 2.2

OS 2.3

OS 3.1

OS 3.2

OS 4.1

OS 5.1

OS 5.2

OS 5.3

OS 5.4

OS 6.1

OS 6.2

OS 7.1

OS 7.2

OS 7.3

OS 8.1

OS 8.2

OS 8.3

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

39%

3%

17%

76%

18% 18%

2%

48%

21%

39% 40%

9%

17%

40%

7%

25%

0% 0% 0%

€ 37,766.46

€ 178,291.54




Task 6.2.1: Individuazione e valutazione di differenti compost idonei all’impiego come substrati di coltivazione e/o ammendanti in orticoltura (M13-35) stato: in corso (60% completamento)

OR Mesi

Attività 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36

OR 6

OS 6.2

A6.2.1.a X X X X X X X

A6.2.2.a X X X X X X X X X X X X






A6.2.4.c X X X X X X X X X X X X

Risultati Principali – Task 6.2.1 (ISPA-CNR, UNIBA)

Task 6.2.1: Individuazione e valutazione di differenti compost idonei all’impiego come substrati di coltivazione e/o ammendanti in orticoltura

Saggi di fitotossicità su compost: 4/10 – ISPA.I saggi di fitotossicità, al momento della presentazione del report, hanno presentato

tutti valori > 60 % di germinabilità (valore imposto dalla legge).Analisi fisiche sui compost: 4/10 – ISPA.

Risultati Principali Task 6.2.1 (ISPA-CNR, UNIBA)

CompostElementi 1 2 3 4 5 6 7 8Fe° 8032 5031 13955 8375 10180 13249 7161 4774Mn° 314 115 400 219 310 425 435 131Cu° 98 43 92 112 293 155 167 42Zn° 196 229 197 201 600 457 336 173Ti° 616 308 1968 973 1325 2290 740 368Pb* 24 5.9 46 40 109 35 41 6.0Ni* 9.7 8.5 40 9.8 13 19 9.4 6.2Co* 3.0 1.5 5.3 1.9 2.1 3.7 2.3 1.3Cr* 15 5.3 63 33 72 39 19 6.2Cd* n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.

* Determinati mediante ICP-OES; °determinati mediante XRF; n.d.: non rilevabile

Contenuto medio di metalli nei compost analizzati (mg kg-1 peso secco)

Analisi chimiche dei metalli pesanti sui compost: 8/10 – DiSSPA

OR 7 – Strumenti di Controllo Innovativi per la Determinazione di Metalli Pesanti e Microrganismi Patogeni in Prodotti Freschi

OS7.1: Sistemi innovativi per la diagnosi rapida di metalli pesanti in prodotti freschi

Partner: ISPA-CNR (Lecce) Università del Salento, Dipartimento di Scienze e Tecnologie Biologiche e

Ambientali (DiSTeBA) Biotecgen s.r.l.


Avanzamento OS 7.1

OS 1.1

OS 2.1

OS 2.2

OS 2.3

OS 3.1

OS 3.2

OS 4.1

OS 5.1

OS 5.2

OS 5.3

OS 5.4

OS 6.1

OS 6.2

OS 7.1

OS 7.2

OS 7.3

OS 8.1

OS 8.2

OS 8.3

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

39%

3%

17%

76%

18% 18%

2%

48%

21%

39% 40%

9%

17%

40%

7%

25%

0% 0% 0%

€ 128,069.10

€ 191,665.90




Task 7.1.1: Messa a punto di sistemi innovativi per la rivelazione di metalli pesanti in matrici alimentari mediante la spettroscopia ATR-FTIR e microbilance piezoelettriche (M1-36) stato: in corso (50% completamento)

OR Mesi

Attività 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36

OR 7

OS 7.1

A7.1.1.a X X X X X X X X X X X X X X X X X

A7.1.1.b X X X X X X X X X X X X X X X X X X X

A7.1.1.c X X X X X X X X X X X X X X X X X X

Risultati Principali – Task 7.1.1 (UNISALENTO, ISPA-CNR)

Attività 7.1.1.a - Spettroscopia IR su prodotti freschi Sono state condotte misure atte a testare la validità del protocollo per l’estrazione di metalli pesanti da matrici alimentari messo a punto dall’unità di ricerca del CNR ISPA di Lecce al fine di effettuare le indagini mediante spettroscopia IR per lo studio dei segnali differenziali derivanti dalla decomplessazione dei gruppi ligandi.

• Sono stati testati diversi protocolli sperimentali per la definizione della composizione chimica, della temperatura e del pH delle soluzioni per il trattamento di alimenti da sottoporre ad analisi ATR-FTIR differenziale.

• Messa a punto di un dispositivo per le indagini mediante spettroscopia IR in modalità differenza sui campioni ottenuti. In questo modo è stato possibile ottenere ciclicamente la decomplessazione dei metalli e la contemporanea acquisizione di spettri differenza (legato meno non legato), in maniera tale da evidenziare i segnali IR associati ai cambiamenti di singoli gruppi funzionali coinvolti nel binding.

A B

Risultati Principali – Task 7.1.1 (UNISALENTO, ISPA-CNR)

Attività 7.1.1.b - Spettroscopia IR su materiali idrofobici ad alta affinità per gli ioni metallici tossici : Le attività hanno riguardato lo studio di materiali ad alta affinità e selettività per ioni metallici tossici (nichel, cobalto, cromo, cadmio), idonei alla preparazione di strati attivi stabili e la definizione di parametri analitici (sensibilità, selettività, ecc.) di sensori chimici a trasduzione ottica nel range IR basati sugli strati attivi selezionati.

• Sono state eseguite indagini per l’identificazione degli strati attivi caratterizzati dai migliori parametri di sensibilità, stabilità, rapidità, riutilizzabilità e selettività.

• In particolare è stato visto che i leganti azotati, quali NH e CN piridinici, possono essere utilizzati nel binding specifico di nichel e cadmio, monitorato mediante spettroscopia IR. Sono in corso altre analisi per l’individuazione di ulteriori strati attivi per il legame con il piombo, il cromo e il cobalto.

Risultati Principali – Task 7.1.1 (UNISALENTO, Biotecgen)

Attività 7.1.1.c - Funzionalizzazione di cristalli di quarzo con specifici ligandi per l’analisi degli ioni metallici con microbilance piezoelettriche

Le attività hanno riguardato lo studio e l’individuazione dei materiali, della tipologia di deposizione e dello spessore degli strati attivi scelti. Questi sono stati impiegati come sensori piezoelettrici mostrando risultati promettenti per la messa a punto definitiva.• Sono state condotte prove sperimentali per la definizione della tipologia di deposizione su quarzo

piezoelettrico e dello spessore dello strato attivo in grado di garantire le migliori prestazioni nell’analisi di metalli pesanti in mezzo acquoso.

• È stato possibile dimostrare che ligandi tiofenici mostrano buone potenzialità per il sensing del piombo e del cadmio.

Struttura chimica del polimero tiofenico utilizzato nel sensore.

OR 7 – Strumenti di Controllo Innovativi per la Determinazione di Metalli Pesanti e Microrganismi Patogeni in Prodotti Freschi

OS 7.3: Sviluppo di sistemi di allerta rapidi per la presenza di Listeria e Salmonella in tagli bovini prima della destinazione d’uso

Partner: ISPA-CNR Lecce Biotecgen srl Industria Ciullo Carni srl


Avanzamento OS 7.3

OS 1.1

OS 2.1

OS 2.2

OS 2.3

OS 3.1

OS 3.2

OS 4.1

OS 5.1

OS 5.2

OS 5.3

OS 5.4

OS 6.1

OS 6.2

OS 7.1

OS 7.2

OS 7.3

OS 8.1

OS 8.2

OS 8.3

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

39%

3%

17%

76%

18% 18%

2%

48%

21%

39% 40%

9%

17%

40%

7%

25%

0% 0% 0%

€ 104,437.56

€ 321,669.44




Task 7.3.1: Analisi bioinformatica e progettazione e sperimentazione di DNA arrays (M1-18) stato: in corso (100% completato)

Task 7.3.2: Analisi su matrice complessa (M1-22) stato: in corso (65% completato)

Task 7.3.3: Messa a punto di sistemi di rilevamento dei patogeni tramite protein chip biosensori, DNA microarrays, e immunosensori lateral flow (M4-28)

stato: in corso (40% completato)

OR Mesi Attività 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36

OR 7

OS 7.3

A7.3.1.a X X X X A7.3.1.b X X X X X X A7.3.1.c X X X X X A7.3.1.d X X X X X X A7.3.2.a X X X X A7.3.2.b X X X X X X X X X X X A7.3.2.c X X X X X X X X X X A7.3.2.d X X X X X X X X X X X A7.3.3.a X X X X A7.3.3.b X X X X X X A7.3.3.c X X X X X X X X X X X X A7.3.3.d X X X X X X X X A7.3.3.e X X X X X X X X X X


Messa a punto del protocollo per il Lateral Flow ImmunoAssay

Messa a punto del protocollo per i protein chip Immunoassay

Lateral Flow Immuno Assays: risultati

Risultati preliminari mostrano l’attuale limite di detection del metodo è di 10.000 UFC/ml di Salmonella

HF240 HF 180

Alta Porosità ottima mobilitàLateral Flow Assay: complessi batteri-anticorpi-goldQD migrano per capillarità fino a incontrare l’anticorpo fissato alla membrana

Scelta della membrana

Protein-chips per Salmonelle: risultati di ibridazione

A: con anticorpi fluorescenti (anti-Salmonelle)

B: colorante lipidico fluorescente,

C: marcatore di membrana fluorescente

Protein Chip Assays

A B C

Protein-chips per Listeria

1a, 1b: Campioni di Listeria catturati, rilevati in fluorescenza blu

Limite di detection: 1000 UFC/ml

Ab control

Diluizioni scalari

L L L L

Ab control

OR 8 – Scale Up Industriale degli Strumenti Preventivi, di Controllo e Correttivi Messi a Punto nel Progetto

Avanzamento OS 8.1 – 8.2 – 8.3

OS 1.1

OS 2.1

OS 2.2

OS 2.3

OS 3.1

OS 3.2

OS 4.1

OS 5.1

OS 5.2

OS 5.3

OS 5.4

OS 6.1

OS 6.2

OS 7.1

OS 7.2

OS 7.3

OS 8.1

OS 8.2

OS 8.3

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

39%

3%

17%

76%

18% 18%

2%

48%

21%

39% 40%

9%

17%

40%

7%

25%

0% 0% 0%

OS 8.1

OS 8.2

OS 8.3

€ - € 50,000.00 € 100,000.00 € 150,000.00 € 200,000.00 € 250,000.00 € 300,000.00

€ 198,684.00

€ 240,361.00

€ 131,057.00

Rendicontato Budget

% Rendicontato Progetto di Ricerca

24%

76%

Ricerca Industriale

5%

95%

Sviluppo Sperimentale

21%

79%

Totale Ricerca

% Rendicontato

% Budget

Rendicontazione Ricerca Industriale

Spese di Personale Costi degli Strumenti e delle attrezzature

Consulenze Costi dei fabbricati e dei terreni

Spese generali Altri costi di esercizio TOTALE

Budget 2687991 645500 129000 9200 1118479 1311795 5901965

Rendicontato 860686.93 8612.36999999998 6000 6496.31 370214.285 186944.22 1438954.115

€ 500,000.00

€ 1,500,000.00

€ 2,500,000.00

€ 3,500,000.00

€ 4,500,000.00

€ 5,500,000.00

€ 6,500,000.00

€

Rendicontazione Sviluppo Sperimentale




Budget 625614 2700 102300 9200 281711 315937 1337462

Rendicontato 32282.46 0 0 0 16141.23 23330.13 71753.82

€ 100,000.00

€ 300,000.00

€ 500,000.00

€ 700,000.00

€ 900,000.00

€ 1,100,000.00

€ 1,300,000.00

€ 1,500,000.00

€

Rendicontazione Totale Progetto di Ricerca




Budget 3313605 648200 231300 18400 1400190 1627732 7239427

Rendicontato 892969.39 8612.36999999998 6000 6496.31 386355.515 210274.35 1510707.935

€ 500,000.00

€ 1,500,000.00

€ 2,500,000.00

€ 3,500,000.00

€ 4,500,000.00

€ 5,500,000.00

€ 6,500,000.00

€ 7,500,000.00

€

Soggetti Partner coinvolti nei SAL I-II-III

Enti di Ricerca

ISPA CNR IBBE CNR Università degli Studi di Foggia: - Dipartimento SAFE Università degli Studi di Bari: - Dipartimento di Medicina Veterinaria - Dipartimento DISSPA Università del Salento: - Dipartimento DiSTeBA

Aziende

BonassisaLab srl Lab.Instruments srl Industrie Fracchiolla srl Molini Tandoi spa Biotecgen srl

% Avanzamento Rendicontazione per Partner SAL I – II - III

D.A.Re.

UNIFG - Dip. S

AFE

UNIBA - DISSPA

UNIBA - Dip. M

edicina Veterin

aria

UNISALENTO - D

ISTEBA

CNR ISPA

CNR IBBE

BONASSISALAB

LABIN

STRUMENTS

MOLINI T

ANDOICDP

COOP LAV PR AGR

CIULLO

CARNI

FRACCHIOLLA

AZ INCORONATA

CANTELE

CENTRO LATTE STASI

AGRIPLAN

BIOTECGEN

TOTALI0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

61%

13%

6% 8%

42%

19%

12%

36%

61%

10%

0% 0% 0%

27%

0% 0% 0% 0%

43%

21%

Conclusioni

I risultati scientifici fino ad ora conseguiti confermano la possibilità di perseguire gli obiettivi di ricerca ambiti in fase di progettazione iniziale.

Le difficoltà nell’espletamento di alcune attività progettuali sono dovute all’impossibilità, da parte di Amministrazioni di alcuni Partner, di effettuare anticipazioni.

Per il buon esito del progetto si rendono, pertanto, necessarie:- Proroga - Rimodulazione dei costi e di alcune attività progettuali a causa di criticità emerse

soprattutto alla luce della rinuncia, da parte di 3 aziende partner, alla partecipazione al progetto.

S.I.MI.S.A.

PROPOSTA DI RIMODULAZIONE PROGETTO

DI RICERCA

Proposta di Rimodulazione

Principali modifiche richieste:

Proroga al 30/06/2013 e aggiornamento GANTT Riduzione/Azzeramento della voce di costo «Strumenti e Attrezzature» per taluni partner e

ridistribuzione del budget tra le altre voci di costo Rinuncia alla partecipazione di progetto da parte dell’azienda Centro Latte Stasi srl e sostituzione

con l’azienda Sanguedolce srl Rinuncia alla partecipazione di progetto da parte di Azienda Viti-vinicola Incoronata e Coop.

Lavorazione Prodotti Agricoli e ri-attribuzione dei relativi budget a D.A.Re. Sostituzione del task 2.1.2 relativo alla messa a punto di biosensori per la determinazione

simultanea di glucosio ed alcol nelle uve con un task di maggiore coerenza con l’obiettivo generale del progetto SIMISA. Tale task riguarderà lo sviluppo e validazione di una metodica analitica ICP-OES per la determinazione simultanea di potassio e metalli pesanti nelle uve e vino.

S.I.MI.S.A.

PROPOSTA DI RIMODULAZIONE PROGETTO

FORMAZIONE

RAZIONALI DELLA RIMODULAZIONE

La rimodulazione che si intende proporre rispetto al capitolato approvato deriva dall’esigenza di adeguare gli obiettivi inizialmente previsti rispetto alla nuova pianificazione temporale e ai vincoli formali conseguenti all’attivazione dei percorsi formativi.

• L’obiettivo formativo A (ricercatori) non prevede più che i destinatari siano inseriti in un programma di Dottorato di Ricerca, non essendoci le condizioni amministrative e regolamentari per l’inclusione di dottorati nei programmi universitari in corso nel periodo del progetto, ma che siano laureati selezionati in base procedure di evidenza pubblica, dove il titolo di Dottore di Ricerca verrà valutato con un punteggio aggiuntivo nella griglia di valutazione dei titoli prevista dalla procedura selettiva stessa;

• Sia l’obiettivo A che l’obiettivo B (tecnici) saranno esplicati mediante due corsi di formazione, senza titolo legale, banditi dal CNR in partenariato con i partner di progetto.


• E’ stato ridotto il numero di ore di didattica passando da 2.884 ore della proposta iniziale approvata a 1888 ore dell’attuale. Tale riduzione è dovuta alla sopravvenuta esigenza di non effettuare due edizioni del corso dell’obiettivo A. Si prevede infatti di realizzare solo una edizione di tale percorso didattico, non essendo possibile rispettare la tempistica inizialmente prevista, a causa dell’allungamento dei tempi di finanziamento del progetto e della conclusione delle procedure burocratiche di avvio dello stesso

• Il numero dei formandi è rimasto invariato per entrambi i corsi (10 per corso)

• Il valore della borsa di studio nell’obiettivo A è stato diminuito in modo tale da veicolare le risorse ottenute all’aumento del valore della borsa nell’obiettivo B

• È stato innalzato il limite di età per i formandi portandolo ai 32 anni o 35 anni se in possesso di dottorato di ricerca

• A causa dei ritardi dovuti all’iter di approvazione del progetto stesso si rende necessaria una proroga con slittamento della scadenza del progetto a giugno 2015


• Si è previsto l’ingresso di due partner del progetto di ricerca (Bonassisa e Labinstruments) anche nel progetto di formazione per le attività del modulo B-affiancamento on the job con spostamento di risorse dal partner CNR-ISPA

• Per adeguamento alle sopravvenute esigenze organizzative, sono state attribuite ore di docenza al partner UNIFG sia nell’ambito dell’obiettivo A che nell’ambito dell’obiettivo B

• Il costo complessivo del progetto è stato mantenuto come da decreto.

• I costi totali dei partner UNIFG e D.A.Re sono rimasti invariati, mentre il costo totale del partner CNR-ISPA è diminuito per l’attribuzione di risorse ai nuovi partner di progetto.

• In tutti i partner presenti da capitolato tecnico approvato, si sono apportate variazioni alle interno delle singole voci di costo, in alcuni casi anche attivando nuove voci di costo, a causa di una più efficiente allocazione delle risorse rispetto alle attuali necessità e durata delle attività.

RIMODULAZIONE FINANZIARIA

TOTALE COSTI DA DECRETO PROGETTO

CAMPANIA PUGLIA 87.3C ITA UE X UE TOT

COSTO PERSONALE DOCENTE

452.175 452.175

SPESE DI TRASFERTA DEL PERSONALE DOCENTE E DEI DESTINATARI DELLA FORMAZIONE

47.000 47.000

ALTRE SPESE CORRENTI 58.000 58.000

STRUEMNTI ED ATTREZZATURE

COSTI DI SERVIZI DI CONSULENZA

30.000 70.000 100.000

COSTO DEI DESTINATARI 380.000 380.000

TOTALE 1.037.175 1.037.175

TOTALE COSTI RIMODULATI

CAMPANIA PUGLIA 87.3C ITA UE X UE TOT

COSTO PERSONALE DOCENTE

429.900 429.900

SPESE DI TRASFERTA DEL PERSONALE DOCENTE E DEI DESTINATARI DELLA FORMAZIONE

37.000 37.000

ALTRE SPESE CORRENTI

85.880 85.880

STRUMENTI EDATTREZZATURE

6.395 6.395

COSTI DI SERVIZI DI CONSULENZA 30.000

70.000 100.000

COSTO DEI DESTINATARI

378.000 378.000

TOTALE 1.037.175 1.037.175

S.I.MI.S.A.

STATO AVANZAMENTO LAVORI SAL I – II - IIIGrazie per l’a

ttenzione!

Il Progetto BUDGET Ricerca Industriale: 5.901.965 € Sviluppo Sperimentale: 1.337.462 €...

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