LE SCIENZESCIENTIFICAMERICAN

numero 44aprile 1972anno vvolume viti

Il microscopio elettronicoa scansione

L'esplorazione di un campione con un sottile fascio di elettronisincronizzato col fascio elettronico di uno schermo a raggi catodiciconsente di ottenere eccezionali immagini a tre dimensioni

di Thomas E. Everhart e Thomas L. Hayes

TA

e immagini ottenute col microsco-pio elettronico a scansione han-no avuto negli ultimi anni una

grande diffusione nelle pubblicazioniscientifiche, come pure in periodici adalta tiratura. La caratteristica premi-nente di queste immagini è la loro ec-cezionale tridimensionalità: esse offro-no un senso di realtà che per solitomanca nelle microfotografie eseguitecon altri metodi, sia che si tratti del-l'occhio di una mosca o di un globulorosso o di un primo piano di un fram-mento di pelle umana.

Le microfotografie normali ottenutecon un microscopio di tipo ottico o ditipo elettronico convenzionale (spessochiamato anche microscopio elettroni-co a trasmissione) sono immagini adue dimensioni. Ciò che vi si scorge èun disegno formato da aree chiare escure prodotte dal passaggio della luceo degli elettroni attraverso un sottilestrato del campione. Il microscopio ot-tico presenta un'immagine a due di-mensioni perché possiede una profon-dità di campo estremamente limitata, ilche vuol dire che esso può essere mes-so a fuoco con precisione solo su unpiano. Se il campione è sufficiente-mente trasparente è possibile metternea fuoco strati situati a varie profondi-tà; poiché però il materiale al tdi soprae al di sotto del piano focale iiduce laluminosità rendendo confusa l'imma-gine, al microscopio ottico si lavora di

preferenza con campioni sottili visti intrasparenza o con campioni piatti vi-sti in luce riflessa. Questo tipo di mi-croscopio è utilizzabile per mostrarela forma di un campione in profonditàsolo con piccoli ingrandimenti (grossomodo al di sotto di 200 diametri).

Il microscopio elettronico a trasmis-sione richiede campioni ancora piú sot-tili del microscopio ottico poiché sologli elettroni che emergono dal campio-ne col medesimo livello di energia pos-sono essere focalizzati dal campo ma-gnetico dell'obiettivo su un solo pianoimmagine. Nella maggior parte dei ca-si, quindi, vengono utilizzati per la for-mazione dell'immagine gli elettroni chesono stati deflessi, ma che non hannosubito variazioni nel livello energetico.Se gli elettroni emergessero con unampio spettro di livelli energetici, su-birebbero deflessioni differenti nel pas-saggio attraverso le lenti magnetiche el'immagine risulterebbe confusa.

Se una discreta frazione degli elet-troni deve emergere mantenendo inal-terata la propria energia è necessarioche il campione sia molto sottile an-che quando si usano fasci di elettronicon energie dell'ordine di 50 000 o100 000 elettronvolt. I campioni per imicroscopi elettronici a trasmissionehanno quindi uno spessore che di nor-ma non supera i 500 angstrom, ovverocirca un millesimo del diametro di unacellula vivente.

Caratteristiche del microscopio

Il microscopio elettronico a scansio-ne è in grado di fornire immagini tri-dimensionali di oggetti perché, nel mo-do normale di funzionamento, non re-gistra gli elettroni che attraversano ilcampione, bensí quelli secondari chene vengono emessi a seguito dell'urtodel fascio di elettroni contro di esso.Il campione può quindi avere qualsiasigrandezza e spessore purché sia com-patibile con le dimensioni della came-ra a vuoto dello strumento. Non è ne-cessario che gli elettroni secondari ven-gano focalizzati essendo sufficiente rac-coglierli; inoltre, poiché l'inviluppo delraggio incidente ha la forma di un sot-tile ago, lo strumento possiede unagrande profondità di campo. Anche ilmicroscopio elettronico a trasmissionepresenta tale caratteristica, ma la suaprofondità di campo effettiva è forte-mente limitata dalla sottigliezza delcampione.

Col microscopio elettronico a scan-sione si può ottenere un'ampia gamma'di ingrandimenti: da quelli ottenibilicon un normale microscopio ottico ocon una comune lente di ingrandimen-to, fino ai più spinti ingrandimenti diun microscopio elettronico a trasmis-siDne. Il microscopio ottico possiede unpotere risolutivo massimo compreso fra2000 e 3000 angstrom, cioè non è ingrado di distinguere due punti la cui

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GENERATOREDI SCANSIONE

VAVF

CATODO

GRIGLIA

FASCIO TUBO A RAGGI CATODICI

LENTEMAGNETICA

///

CAMPIONE

AMPLIFICATOREVIDEO

I cD \InNN

///

LENTEMAGNETICA -

SORGENTE DI ELETTRONI SORGENTE DI ELETTRONI

LENTI MAGNETICHE

APERTURA

CAMPIONE

COLLETTORE DEGLI ELETTRONI

TUBO A RAGGI CATODICISCHERMO

APERTURA

BOBINE DISCANSIONE

Negli schemi qui riportati vengono messi a confronto i due tipi di microscopio elettro-nico. Il microscopio elettronico a trasmissione (a sinistra) assomiglia assai da vicino aun microscopio ottico convenzionale. Il campione è illuminato con continuità su tuttal'area da un fascio collimato di elettroni, che viene diffuso passando attraverso il cam-pione e poi focalizzato da una lente magnetica per produrre un'immagine del campionestesso su uno schermo fluorescente. Nel microscopio elettronico a scansione la sorgenteè riflessa sul campione da una lente magnetica; il piccolo pennello di elettroni formatoin questa maniera viene deflesso da bobine di scansione per illuminare il campionepunto per punto in tempi successivi (Ti , T2, T3 ). Gli elettroni secondari che si gene-rano nel punto ove il fascio primario colpisce il campione, vengono raccolti da uncollettore per produrre un segnale elettrico. Questo a sua volta modula l'intensità di unfascio elettronico su uno schermo televisivo percorso in sincronia col fascio primario.

distanza relativa è inferiore a 2000 o3000 angstrom (pari a mezza lunghez-za d'onda della luce blu o arancione).L'ingrandimento massimo effettivo delmicroscopio ottico è di circa 1000 dia-metri e anche se è possibile ottenereingrandimenti più forti, l'immagine di-viene indistinta e non fornisce maggio-ri informazioni.

I migliori microscopi a trasmissionehanno una risoluzione compresa fra

due e cinque angstrom: il loro mas-simo ingrandimento effettivo superaquindi il milione di diametri. Il micro-scopio elettronico a scansione può es-sere usato con ingrandimenti compre-si fra 15 e circa 100 000 diametri, seb-bene l'immagine inizi a sfocarsi al disopra di 20 000 diametri. La maggiorparte dei costruttori garantisce un po-tere risolutivo di 200 angstrom, macon certi tipi di campione si può rag-

giungere un potere risolutivo molto vi-cino a 100 angstrom.

L'ampia gamma di ingrandimenti delmicroscopio elettronico a scansione,unita con la facilità di passare da unvalore di ingrandimento a un altro,rende facile « zoomare » da un'imma-gine di insieme a un'immagine che mo-stra i dettagli più particolareggiati. Alcontrario però degli obiettivi « zoom »che hanno la lunghezza focale e quin-di la profondità di campo variabile(come si può constatare nelle ripresetelevisive delle partite di calcio), l'o-biettivo del microscopio elettronico ascansione mantiene invariate lunghez-za focale e profondità di campo duran-te la transfocalizzazione. Gli oggetti os-servati al microscopio elettronico ascansione con un ingrandimento di 15diametri assomigliano molto a comeappaiono se visti attraverso una fortelente di ingrandimento o un microsco-pio a debole ingrandimento. Tuttavia,nel microscopio ottico la profondità dicampo diminuisce costantemente conl'aumentare dell'ingrandimento e,quando questo raggiunge circa 1000diametri, cessa l'aumento del potererisolutivo dei dettagli. Nel microsco-pio elettronico a scansione l'aumentodell'ingrandimento non è accompagna-to dalla diminuzione della profonditàdi campo e l'aumento della risoluzionedei dettagli cessa quando l'ingrandi-mento raggiunge i 20 000 diametri cir-ca. Per ingrandimenti più forti il se-gnale proveniente da una certa areadel campione ha un livello statistica-mente superiore, anche se di poco, al« rumore » proveniente dalla stessaarea: si possono raggiungere cosí nor-malmente ingrandimenti utili fino a100 000 diametri.

Per il microscopio elettronico a scan-sione la preparazione dei campioni elet-tricamente conduttori, non essendo ne-cessario che siano in strati sottili, è disolito assai più semplice che per il mi-croscopio ottico o per quello elettroni-co a trasmissione. Il campione condut-tore può essere semplicemente incolla-to al portaoggetto (spesso con una ver-nice conduttrice a essiccazione rapida)e piazzato all'interno del microscopio.Occorre una breve attesa di circa dueminuti per aspirare i gas contenuti nel-la camera.

I campioni non conduttori d'elettri-cità richiedono invece una preparazio-ne alquanto più complessa. Sul cam-pione, dopo il montaggio, viene fattoevaporare un sottile strato di metallo(di solito oro) che ha il compito dimantenere la superficie a potenzialeelettrico costante. Lo spessore del ri-vestimento metallico dipende dal tipo

di campione e dalla risoluzione deside-rata. Il rivestimento può essere para-gonato a uno strato di neve che copreil terreno: uno strato sottile nascondesolo i sassi di piccole dimensioni, unopiù spesso ricopre le pietre, e uno spes-sore molto forte può, in montagna,seppellire perfino la case. È possibileche uno strato sia troppo sottile, comeper esempio quando non riesce a co-prire zone leggermente protette (ana-loghe al terreno sotto gli alberi) chepossono però essere ugualmente espo-ste al raggio incidente di elettroni. Lospessore dello strato di rivestimentonecessario è compreso fra circa 50 ang-strom, per osservazioni con i maggioripoteri risolutivi, e poche centinaia diangstrom, per osservazioni con ingran-dimenti minori.

I tessuti biologici richiedono unapreparazione particolare. Il tessuto de-ve anzitutto essere fissato, per mante-nere le cellule e le altre parti in posi-zione durante le fasi successive dellapreparazione, deve poi essere disidra-tato ed essiccato, montato su un sup-porto e rivestito di metallo. A que-sto punto è pronto per l'esame almicroscopio.

Come si forma l'immagine

I primi microscopi elettronici a scan-sione vennero costruiti a metà deglianni '30 in Germania da M. Knoll epoco più tardi da Manfred von Arden-ne. All'inizio degli anni '40 VladimirZworykin e i suoi collaboratori dellaRCA ne costruirono una versione mi-gliorata. Questi strumenti non eranoin grado di rappresentare le immaginiin tre dimensioni, caratteristica degliattuali microscopi elettronici a scansio-ne, poiché la rivelazione del segnale ei processi di amplificazione non eranostati sufficientemente ben compresi.

Alla fine degli anni '40 DennisMcMullan, con la supervisione di C.W. Oatley, costruí all'Università diCambridge una versione assai perfezio-nata del microscopio elettronico ascansione. Egli dotò il sistema collet-tore di un moltiplicatore amovibile de-gli elettroni secondari e lo situò in unaposizione più efficace di quella sceltanel dispositivo della RCA. Il progettodi McMullan venne ulteriormente per-fezionato in seguito da altri ricercato-ri. Il primo microscopio elettronico ascansione di tipo commerciale fu svi-luppato sulla base dei progetti di Cam-bridge e il suo prototipo venne presen-tato nel 1963.

Il microscopio elettronico a trasmis-sione è del tutto analogo al normalemicroscopio ottico, ma raggiunge un

BOBINA DI DEFLESSIONE

COLLETTORI

Il microscopio elettronico a scansione è sostanzialmente un sistema televisivo a circui.to chiuso di una certa complessità nel quale il campione viene illuminato da un puntomobile di elettroni. Il fascio di elettroni viene prodotto da un catodo in tungsteno ri.scaldato dalla corrente JF e tenuto a un potenziale fortemente negativo. Gli elettroniemessi dal catodo sono accelerati da una griglia e da un anodo che è tenuto a massa.Questo sistema di elettrodi viene chiamato cannone elettronico. Un sistema di lenti ma.gnetiche rimpicciolisce il fascio elettronico (si veda l'illustrazione in alto nella paginaseguente). Facendo passare una corrente variabile 'CD nella bobina di deflessione si ot-tiene il movimento del fascio sul campione come in uno schermo televisivo. Il rappor-to fra la corrente ho e la corrente ID nella bobina di deflessione del tubo a raggi cato-dici determina l'ingrandimento del microscopio. Negli strumenti commerciali l'ingran-dimento può di solito variare con continuità all'incirca fra 15 e 100 000 diametri. Quan-do il fascio primario di elettroni colpisce il campione, genera degli elettroni secondariil cui numero dipende dalla geometria e da altre proprietà del campione stesso. Glielettroni secondari, raccolti da un collettore (a), sono di norma impiegati per produr-re una microfotografia elettronica a scansione. Tuttavia anche gli elettroni diffusi al-l'indietro e i fotoni emessi dal campione sotto il bombardamento elettronico possonoessere usati a loro volta per produrre un'immagine. Altri tipi di immagine possonoperò essere prodotti da elettroni trasmessi (b) e da correnti indotte nel campione (c).

14 15C)

CONDOTTO DELLA LUCE AMPLIFICATOREELETTRONICO

///

///

o

BOBINADELLA LENTE

ESPANSIONE

I POLAREII riI I

I II II II II II II I

ESPANSIONEPOLARE

A

BOBINADELLA LENTE

\ ESPANSIONE POLARE

CAMPIONE

La lente finale (simmetrica intorno all'asse che incorpora ilsistema di deflessione) è il cuore dell'ottica elettronica di unmicroscopio a scansione. Il fascio di elettroni che passa attra-verso la lente finale (a sinistra) viene allontanato dall'asse dauna bobina di deflessione (Y) e poi piegato nuovamente versol'asse da una seconda bobina (Y') in modo da incrociare l'assestesso in corrispondenza dell'apertura finale (A) con un ango-lo O. Lo stigmatore (S) corregge le asimmetrie residue. Il di.

segno a destra mostra come il fascio viene focalizzato sull'og-getto (linee tratteggiate) e poi deflesso e focalizzato contempo.raneamente (linee continue). Poiché l'angolo cz. di convergenzadel fascio è generalmente inferiore a mezzo grado, il diametrodel fascio non aumenta apprezzabilmente poco avanti o pocodietro il piano di migliore focalizzazione. Ciò assicura al siste-ma una profondità di campo tanto grande che le varie partidi un oggetto appaiono tutte pressoché ugualmente a fuoco.

ELETTRONI SECONDARI

COLLETTOREFOTOELETTRONE

ELETTRONI SECONDARI

FOTONI

AL TUBO ARAGGI CATODICI

A A A

//FOTOMOLTIPLICATORE

Il sistema di rivelazione e di amplificazione di un microscopioelettronico a scansione è a bassissimo rumore. L'intensità dicorrente associata col flusso degli elettroni secondari può esse-re di appena 10 ampere. Gli elettroni secondari vengono ac-

celerati fino a circa 10 000 voli prima di colpire lo scintillatore,dove ogni elettrone produce molti fotoni; questi sono portatia un fotomoltiplicatore in cui vengono emessi dei fotoelettroni.Ogni fotoelettrone eccita da 100 000 a 50 milioni di elettroni.

,SCINTILLATORE

Nel microscopio elettronico a scansione è necessario usare un'ottica elettronica atte-nuante per ridurre la dimensione della sorgente di elettroni da un diametro compre-so fra 25 e 50 micron (da 250 000 a 500 000 angstrom) al diametro di 100 angstrom delfascio. L'attenuazione viene ottenuta con l'ausilio di due o più lenti magnetiche in se-rie, ciascuna in grado di ridurre il fascio di un fattore compreso fra 20 e 100. Il risulta-to è analogo a quello che si ottiene guardando in un cannocchiale dalla parte sbagliata.Una gran parte delle radiazioni focalizzate da una lente non riesce a passare attraver-so la lente successiva, riducendo cosi il numero di elettroni che raggiunge il campione.

IMMAGINE 2DELLA

SORGENTE

SORGENTE IMMAGINE 1DELLA

SORGENTE

ASSE DEL FASCIO

ELETTRONI DIFFUSI ALL'INDIETRO

ESPANSIONE POLAREDELLA LENTE FINALE

\ COLLETTORE DEGLIELETTRONI DIFFUSIALL'INDIETRO

..., `... -....., '... ---....., ,-.., .., •••••...,..., `,..

......

CAMPIONE

ELETTRONI SECONDARI

COLLETTORE DEGLIELETTRONI SECONDARI

Nei microscopi elettronici a scansione si adoperano due tipi di collettori, uno per glielettroni diffusi all'indietro e l'altro per gli elettroni secondari. Gli elettroni diffusi al-l'indietro sono elettroni ad alto livello energetico appartenenti al fascio primario, madeviati dalla loro traiettoria all'interno del campione. Gli elettroni secondari, prodottiin prossimità della superficie del campione per l'urto del fascio primario e deglielettroni diffusi all'indietro, hanno un minor contenuto energetico e sono facil.mente attratti dal collettore mantenuto a un potenziale positivo di circa 200 voli.

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potere risolutivo di gran lunga maggio-re perché gli elettroni accelerati da unpotenziale di 100 000 volt hanno unalunghezza d'onda assai più breve (0,4angstrom) della luce visibile (4000 ang-strom). Un principio ben noto in mi-croscopia è che quanto più breve è lalunghezza d'onda impiegata, tanto piùalto è il potere risolutivo. Quest'ultimopuò anche essere limitato da aberra-zioni delle lenti e da altri effetti checonsentono di raggiungere nei migliorimicroscopi elettronici a trasmissioneun potere risolutivo compreso fra duee cinque angstrom.

Nel microscopio elettronico a tra-

smissione, come nel microscopio otti-co, il campione è illuminato contempo-raneamente in ogni suo punto. Il pe-riodo di tempo durante il quale il cam-pione può essere esaminato è limitatodal danno che gli può essere arrecatoe dalla variazione delle prestazioni del-lo strumento: l'immagine può però es-sere vista nella sua completezza inqualsiasi istante. Essa viene presentatasu uno schermo fluorescente o inviatadirettamente su una lastra fotograficaper ottenerne una microfotografia.

Nel microscopio elettronico a scan-sione il campione viene esplorato se-quenzialmente da un fascio focalizzato

di elettroni; l'immagine risultante vie-ne formata con una tecnica a divisio-ne di tempo analoga a quella impiega-ta nella televisione commerciale. Visono però due differenze sostanziali:in primo luogo l'immagine televisivastandard è costruita da 625 linee oriz-zontali, mentre quella prodotta dal mi-croscopio elettronico a scansione puòcontenere un numero di linee variabi-le da 100 a oltre 1000. L'esplorazionepiù dettagliata è usata per le microfo-tografie. In secondo luogo la velocitàdi scansione è spesso molto inferiorea quella della televisione; il motivo èda ricercare nel fatto che è difficile fo-calizzare un gran numero di elettroniin un'area del diametro di appena 100angstrom. Il pennello di elettroni devequindi soffermarsi su ciascuno dei pun-ti del campione (circa un milione) perun tempo sufficiente a formare un se.gnale di elettroni secondari tanto for-te da generare un'immagine effettiva-mente esente da rumore. Pertanto ciòche si fotografa sullo schermo del mi-croscopio per ottenere una microfoto-grafia è un'immagine prodotta da unfascio di elettroni che si muove a bas-sa velocità e che rende possibile, incorrispondenza di ogni punto, una de-terminazione statisticamente significa-tiva del segnale generato. Quantunquesia possibile aumentare per i controllivisivi la velocità di scansione fino aivalori usati in televisione, occorre untempo di esposizione di parecchi mi-nuti per ottenere microfotografie ad al-ta risoluzione e della migliore qualità.

Anatomia del microscopio

Il microscopio elettronico a scansio-ne è costituito da quattro parti princi-pali: un sistema ottico-elettronico cheproduce il pennello di elettroni che ser-ve all'esplorazione; un campione nelquale l'azione reciproca fra il materia-le di cui è costituito e il fascio di elet-troni produce l'informazione; un siste-ma rivelatore che raccoglie gli elettro-ni portatori di informazioni emessi dalcampione e amplifica il segnale elettri-co risultante, e infine il sistema di pre-sentazione che colloca sequenzialmen-te l'informazione all'« indirizzo)> cor-retto nell'immagine (si veda l'illustra-zione nella pagina precedente).

Il fascio di elettroni di un microsco-pio elettronico a scansione viene di so-lito generato da un catodo di tungste-no a riscaldamento diretto, mantenu-to a un potenziale negativo il cui va-lore normale è di 20 000 volt sotto ilpotenziale di massa. Il fascio viene ac-celerato e focalizzato da campi elettri-ci e magnetici di forma molto ben de-

Queste microfotografie ottenute con un microscopio elettronicoa scansione rappresentano l'occhio del tenebrione della farina,Tribolium confusum, con un ingrandimento di circa 4500 dia.metri. Le strutture arrotondate sono le singole lenti dell'occhiodell'insetto. Il microscopio usa un sistema di scansione analogoa quello della televisione per produrre delle immagini sulloschermo di un tubo a raggi catodici. Nell'immagine superiorele variazioni dell'intensità del segnale sono rappresentate da to-nalità di grigio, mentre in basso è stato introdotto il colore as-

sociando una tinta a ogni particolare intensità di segnale. Il co.lore aiuta a individuare le aree in cui il segnale ha la medesi.ma intensità: in questo modo le ripetute piccole variazioni nel-le scaglie che circondano l'occhio dell'insetto sono piú evidentia colori che in bianco e nero. Queste due microfotografie elet-troniche a scansione e quelle riportate nell'articolo sono stateeseguite dagli autori all'Università della California a Berkeley.Il tenebrione della farina è uno dei pochi insetti che può esse-re osservato vivente col microscopio elettronico a scansione.

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FASCIO PRIMARIO DI ELETTRONI

SUPERFICIE DEL CAMPIONE

CURVE DI UGUALEDISSIPAZIONE DI ENERGIA

AMPEROMETRIGIUNZIONE p-n

ELETTRONI FASCIO PRIMARIO DI ELETTRONIDIFFUSI ALL'INDIETRO

FOTONI

CONTATTO METALLICO

n-

ELETTRONISECONDARI

STRATO DI OSSIDO

finita. Esso deve anche essere ridotto didiametro: senza tale operazione infat-ti il fascio, all'uscita del cannone elet-tronico, avrebbe un diametro compre-so fra 250 000 e 500 000 angstrom. Lariduzione a 100 angstrom circa vieneottenuta con delle lenti elettroniche(ossia con dei campi magnetici) dispo-ste in modo da riprodurre l'effetto chesi osserva guardando in un cannocchia-le dalla parte sbagliata (si veda l'illu-strazione in alto a pagina 16): con-seguenza inevitabile di questa riduzio-ne è che una gran parte degli elet-troni che escono dal cannone elettro-nico non raggiunge il campione, ma èintercettata da aperture necessarie perminimizzare le aberrazioni delle lenti.La corrente del fascio elettronico èquindi ridotta da circa 10- 4 ampere al-l'uscita del cannone elettronico, a 10-1°o 10- 12 ampere sul campione (un fasciodell'intensità di 10-4 ampere fornisceall'incirca 1015 elettroni al secondo,mentre con intensità di 10- 12 amperene fornisce appena 6 X 106 al secondo).

Altre limitazioni fondamentali del-l'ottica elettronica e dell'emissione elet-tronica determinano le principali pre-stazioni del sistema di formazione del-la sonda. Per esempio, le lenti elettro-niche simmetriche intorno all'asse so-no associate con aberrazioni intrinse-che, le principali delle quali sonol'aberrazione sferica e quella cromati-ca, che impongono al progettista distabilire un angolo di convergenza delfascio non troppo ampio (si veda l'il-lustrazione in alto a pagina 17). Au-mentando l'angolo di convergenza, au-menta la corrente della sonda; questacaratteristica è desiderabile per miglio-rare il rapporto segnale-disturbo, maindesiderabile poiché, contemporanea-mente, aumenta la dimensione del pun-to esplorante e diminuisce la profondi-tà di campo. D'altra parte diminuendol'angolo di convergenza diminuisce an-che la corrente del fascio; inoltre sel'angolo di convergenza è abbastanzapiccolo il potere risolutivo viene limi-tato da effetti di diffrazione.

Il valore ottimale dell'angolo di con-vergenza del fascio è compreso fra0,005 e 0,01 radianti, il che vuol direche il rapporto fra la lunghezza focalee il diametro di apertura del sistema diottica elettronica è compreso fra 100e 50. Nelle normali macchine fotogra-fiche questo rapporto, indicato con f,è per lo più compreso fra 1,4 e 22. Co-me sa la maggior parte dei fotografi,quanto più f è alto, tanto maggiore èla profondità di campo.

La quantità di corrente che può es-sere focalizzata nel punto mobile fina-

6il

SUPERFICIEDEL CAMPIONE

—5-50 ANGSTROM

1,2,3.4

Le traiettorie degli elettroni all'interno del campione sono statistiche e possono esserequindi previste solo nel loro andamento medio. Nel disegno in alto alcune tipichetraiettorie sono contrassegnate da 1 a 5. Le varie curve di livello indicano le profondi.tà alle quali gli elettroni diffusi perdono uguale quantità di energia. La linea di livel.lo piú esterna, nota come livello di Bohr-Bethe (R B ) indica la massima distanza chepuò essere coperta da un elettrone primario all'interno del campione. La traiettoria 5rappresenta un elettrone diffuso all'indietro. La probabilità di diffusione all'indietroaumenta col numero atomico del materiale di cui è costituito il campione. Gli elettronisecondari possono essere generati in qualsiasi punto lungo il percorso di un elettroneprimario: però solo gli elettroni secondari generati in prossimità della superficie delcampione hanno energia sufficiente per sfuggire (6 e 7 nel disegno in basso) e contri-buire cosi alla costruzione dell'immagine ottenuta in un microscopio elettronico a scan-sione. Gli elettroni secondari prodotti da elettroni diffusi all'indietro (7) possono emer-gere a una distanza che può anche raggiungere uno o due micron dal punto di ingres-so del fascio primario: essi tendono quindi a degradare la risoluzione dell'immagine.

CONNESSIONE CON LA REGIONE p

Se il campione è un dispositivo elettronico che comprende un semiconduttore o un iso.lante possono essere generati segnali che contengono informazioni addizionali. Il dise-gno mostra il tipo di segnale che può essere misurato se il campione è un transistorecontenente una giunzione p-n. Come altri campioni, produrrà elettroni secondari, elet-troni diffusi all'indietro e fotoni a varie frequenze (raggi X, radiazioni ultraviolette,luce visibile, radiazioni infrarosse). Oltre a questo i semiconduttori e gli isolanti su-biscono una netta variazione di conducibilità quando vengono colpiti da elettroni.Nel silicio ogni elettrone incidente può produrre 5000 o più portatori di carica sot-to forma di coppie elettrone-buca. Lo strumento superiore indica la corrente indot-ta nella giunzione p-n; quello inferiore la corrente fra il dispositivo e la massa.

19

7

FASCIO PRIMARIO DI ELETTRONI A ISTANTI SUCCESSIVI

UPERFICIC

PRINCIPALE DEL CAmpioNe

Y–kS

Nell'interpretazione delle immagini prodotte da un microscopio elettronico a scansioneoccorre rendersi conto che gli elettroni secondari possono essere generati in regioni auna certa distanza dall'area direttamente colpita dal fascio primario di elettroni. Il di-segno mostra ciò che accade quando il fascio colpisce fibre di dimensioni diverse: unamolto più piccola della penetrazione media M, una il cui diametro è pari al 60 per cen-to circa di questo valore (2) e una molto più grande. Nel primo caso gli elettroni pri-mari penetrano con facilità nella fibra e vengono diffusi, generando in tal modo elet-troni secondari (in colore) su tre superfici: quelle superiore e inferiore della fibra equella del campione. La fibra appare quindi più brillante di quanto sarebbe se gli elet-troni secondari venissero generati solo in corrispondenza della superficie superiore. Laseconda fibra assorbe la maggior parte degli elettroni incidenti, tuttavia gli elettronisecondari escono da tutta la sua superficie, rendendo anche questa fibra più luminosadi quanto non ci si potrebbe aspettare. La terza fibra è tanto grande da fermare tuttigli elettroni che la colpiscono al centro; quelli che invece la colpiscono alla periferiatendono a rimbalzare verso un'area di notevoli proporzioni sulla superficie del campio-ne. Questo effetto rende spesso i bordi di una grossa fibra particolarmente brillanti.

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Lo schema di scansione adoperato nel microscopio elettronico a scansione è del tuttoanalogo a quello della televisione; tuttavia in una microfotografia il quadro contienecirca 1000 linee, mentre nella televisione commerciale sono 625. Nell'illustrazione lecoordinate del quadro sono indicate con X e Y, mentre il segnale è indicato con S. Laconfigurazione del segnale S in ogni intervallo di tempo rappresenta la spaziatura deilivelli del bianco occorrenti per produrre una delle dieci linee per la rappresentazione diuna grande X in carattere stampatello (in basso a sinistra). La X apparirebbe natural-mente continua se fossero usate 1000 linee. La figura a sinistra è una presentazione amodulazione di intensità. È anche passibile deflettere il fascio di elettroni dalla normaleposizione di scansione Y di una quantità proporzionale al livello del segnale (Y –kS),dando luogo a una presentazione a modulazione di deflessione (in basso a destra).

le è direttamente proporzionale alladensità di corrente disponibile al cato-do, i cui valori normali sono compresifra 1 e 10 ampere al centimetro qua-drato. Allo scopo di realizzare elevatirapporti segnale-disturbo con la mag-gior risoluzione possibile, sono statesviluppate delle speciali sorgenti ad al-ta efficienza per aumentare la densitàdi corrente disponibile al cannone elet-tronico. Alec N. Broers ha sviluppato,presso il Centro di ricerche Thomas J.Watson della IBM, un catodo in esa-boruro di lantanio che risulta circa 100volte migliore del normale catodo ditungsteno. Il suo catodo è stato adot-tato in diversi microscopi elettronici ascansione di tipo commerciale.

All'Università di Chicago, Albert V.Crewe e i suoi collaboratori, hanno in-corporato in un microscopio elettroni-co a scansione una sorgente a emissio-ne di campo con una corrente di emis-sione anche più elevata. Sebbene que-sto tipo di catodo richieda, per un fun-zionamento stabile, un ambiente a vuo-to ultra spinto, col microscopio di Cre-we è possibile una risoluzione di cir-ca cinque angstrom, lavorando comequando si opera secondo la scansione--trasmissione su campioni ultrasottili.Con questo strumento sono stati rive-lati singoli atomi di uranio in preparatispeciali (si veda l'articolo Un micro-scopio elettronico a scansione ad altarisoluzione di Albert V. Crewe in « LeScienze », n. 35, luglio 1971).

In un microscopio elettronico ascansione, sebbene la sonda che esplo-ra il campione debba essere focalizza-ta con precisione, non altrettanto ènecessario per gli elettroni secondariche producono l'immagine effettiva.Questo paradosso apparente scomparese si ricorda che l'immagine è compo-sta da una serie di elementi disposti insuccessione. I punti dell'oggetto e del-l'immagine corrispondono fra loro per-ché vengono colpiti allo stesso istantedal fascio elettronico del microscopio eda quello del tubo a raggi catodici.

La raccolta degli elettroni secondari

Quando gli elettroni della sonda col-piscono un campione di un certo spes-sore possono succedere diverse cose (siveda l'illustrazione in alto nella paginaprecedente). Quando gli elettroni pene-trano nel campione, perdono energia erallentano, possono essere diffusi adampio angolo e alcuni infine possonoanche fuoriuscire dalla superficie supe-riore, viaggiando in una direzione piùo meno opposta a quella del raggio in-cidente. Raccogliendo questi elettroni

« diffusi all'indietro » è possibile otte-nere informazioni sui tipi di atomi con-tenuti nel campione. Tuttavia, in lineadi principio, qualsiasi segnale generatoquando il raggio colpisce un determi-nato punto dell'oggetto, indipendente-mente dalla sua forma, può essere usa-to per produrre un'immagine.

L'immagine che si adopera normal-mente è quella prodotta dagli elettronisecondari, cioè dagli elettroni eccitatiall'interno del campione dagli elettro-ni ad alta energia contenuti nel raggioprimario. La probabilità che gli elet-troni secondari possano uscire dal cam-pione diminuisce esponenzialmente conl'aumentare della distanza del loropunto di origine dalla superficie. Diconseguenza, quelli che emergono pro-vengono da uno strato superficiale dispessore compreso fra cinque e cin-quanta angstrom per i metalli e qual-cosa di più per gli isolanti. Si può pen-sare a questi elettroni secondari comese scaturissero dalla superficie in variedirezioni; il livello energetico a essi as-sociato è di pochi elettronvolt.

Gli elettroni secondari vengono atti-rati da un collettore mantenuto a unpotenziale positivo rispetto a massa dicirca 200 volt (si veda l'illustrazione inbasso a pagina 17). Non è necessariofocalizzare gli elettroni secondari per-ché tutti quelli raccolti a un dato istan-te provengono dalle immediate vici-nanze del punto in cui la sonda è pe-netrata nel campione. Per i poteri ri-solutivi più alti solo gli elettroni ecci-tati dal raggio primario penetrato nelcampione forniscono un segnale utile:quelli eccitati da elettroni diffusi al-l'indietro producono un rumore di fon-do che degrada la qualità dell'imma-gine. L'intensità del segnale prodottoal sollettore è proporzionale al numerodi elettroni secondari che Io raggiun-gono. Il segnale viene inviato a un tu-bo a raggi catodici ove modula il fa-scio di elettroni del tubo stesso che simuove sullo schermo in sincronia conla sonda elettronica sulla superficie delcampione. Si produce cosí l'immaginedel microscopio elettronico a scansio-ne; la fotografia dell'immagine che sipresenta sullo schermo del tubo è unamicrofotografia elettronica a scansione.

Informazione e immagine

quesiti da porre, e che richiedonouna risposta nella microscopia elettro-nica a scansione, sono fra gli altri i se-guenti: quanto è grande la regione dacui proviene l'informazione quando ilfascio colpisce il campione? Con qua-le velocità è possibile generare l'infor-

Questo è l'aspetto del sangue umano fatto coagulare in aria umida, poi fissato in for-maldeide e osservato al microscopio elettronico a scansione. Le immagini, dall'altoverso il basso, sono state ottenute con ingrandimenti rispettivamente di 1500, 5000 e15 000 diametri. I dischi sono globuli rossi trattenuti da un reticolato di fibrina. I glo-buli appaiono leggermente disseccati. Le immagini sono state riprese da L. McDonald.

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Zoomata » su una Drosophila melanogaster eseguita col mi-croscopio elettronico a scansione. La mosca della frutta può es-

sere osservata vivente al microscopio: non sono quindi neces-sari né rivestimenti metallici né altre preparazioni tecniche. Da

sinistra a destra le tre microfotografie sono state eseguite coningrandimenti rispettivamente di 180, 450 e 4500 diametri. La

prima microfotografia rappresenta l'intera testa della mosca;le due successive il solo occhio via via in maggior dettaglio.

mazione e con quale rendimento? Qua-li proprietà geometriche, fisiche, chimi-che o di altra natura del campione de-terminano l'informazione?

Se l'immagine è fornita da elettronisecondari, come normalmente avviene,

si sa che tali elettroni hanno nei soli-di un cammino libero medio assai bre-ve: circa 10 angstrom nei metalli e cir-ca 50 angstrom negli isolanti. Moltielettroni secondari emergono da uncerchio il cui diametro non supera di

20 angstrom il diametro della sondaelettronica che li ha generati.

Altri elettroni secondari, prodotti daelettroni diffusi all'indietro che esconodal campione, emergono da altri puntisituati all'interno di un cerchio piú

grande, il cui diametro, per i normalilivelli di energia del fascio, è compre-so fra uno e cinque micron. Gli elet-troni secondari sono generati in menodi 10- 1° secondi; non vi sono quindi inpratica elettroni emessi in ritardo che

renderebbero confusa l'immagine quan-do la sonda si muove verso il puntosuccessivo da esplorare. Per ogni diecielettroni primari che colpiscono uncampione vengono generati da uno aventi elettroni secondari, a seconda del

materiale di cui è costituito il campio-ne e dell'angolo che il fascio primarioforma con la superficie colpita. I raggiX, che possono essere raccolti anch'es-si per produrre un'immagine, sono ge-nerati con un rendimento molto più

Il microscopio elettronico a scansione con un ingrandimento di2500 diametri rivela l'architettura dei recettori degli stimoli lu-minosi di una salamandra: i bastoncelli appaiono come cilin-

dri mentre i coni si presentano affusolati. Con un microscopioconvenzionale la struttura completa di queste cellule è diffi-cilmente osservabile in quanto è impossibile vederle intatte.

Si ritiene che i nodi lungo le cellule nervose della lepre dimare (Aplysia) siano associati con le giunzioni sinaptiche, ovegli impulsi nervosi passano da una cellula all'altra. Questo

ingrandimento di 11 000 diametri fornisce da solo piú infor-mazioni su certi aspetti del tessuto nervoso di quanto si potreb-be raccogliere da centinaia di sezioni dello stesso campione.

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basso: occorrono da 1000 a 100 000elettroni primari per dare origine a unsolo fotone di raggi X, il numero esat-to dipendendo anche qui dal materialedi cui è costituito il campione. I raggiX forniscono però un segnale la cuiutilità consiste nella possibilità di rive-lare gli elementi contenuti nel campio-ne: per questa ragione nella microsco-pia elettronica a scansione stanno tro-vando vasta applicazione i rivelatori diraggi X ad alta sensibilità.

Se il campione è un seniconduttoreo un isolante, il bombardamento colraggio di elettroni determinerà un net-to aumento della conducibilità elettri-ca. 11 microscopio elettronico a scan-sione è pertanto utilissimo nell'esamedei circuiti integrati, che comprendo-no spesso migliaia di transistori o di al-tri elementi circuitali nello spazio dipoco più di mezzo centimetro quadra-to. Per esempio un raggio incidente di18 000 elettronvolt produce nel siliciocirca 5000 elettroni e 5000 « buche ».Questi portatori di carica sono prodot-ti a coppie e se vengono rivelati da unagiunzione p-n nel circuito integrato, lacorrente del segnale può essere moltopiù intensa della corrente del raggioincidente. Il progettista del circuitopuò sapere da tali segnali se il disposi-tivo funziona come è stato progettato,se i singoli elementi sono stati dispostientro le tolleranze previste, e cosí via.Può anche controllare l'aspetto super-ficiale del circuito per vedere se i con-duttori metallici hanno la purezza e laqualità desiderata (si veda l'illustrazio-ne nella pagina a fronte).

Col microscopio elettronico a scan-sione si può naturalmente raggiungereuna risoluzione molto più elevata checol microscopio ottico, che serviva inpassato come strumento standard dicontrollo. Per la nuova generazione diapparecchi elettronici il raggio del mi-croscopio elettronico a scansione vie-ne usato per realizzare i modelli dei di-spositivi stessi. Le dimensioni di questimodelli sono molto più piccole di quel-le dei loro predecessori, ottenuti conmetodi ottico-luminosi.

Come si spiega la distribuzione dizone chiare e di zone scure che dannol'impressione, in una tipica microfoto-grafia elettronica a scansione, di unasuperficie tridimensionale? In primoluogo il campione di solito non è tenu-to perpendicolare al fascio esplorato-re, ma inclinato di un angolo compre-so fra 30 e 60 gradi. Ciò spesso non ènecessario per i campioni biologici concontorni fortemente marcati. La pro-babilità che vengano generati elettronisecondari aumenta con l'aumentaredell'angolo fra il raggio incidente e la

perpendicolare alla superficie nel pun-to di incidenza. In altre parole il fa-scio genera un maggior numero di elet-troni secondari quando colpisce unasuperficie inclinata o un margine chepiega bruscamente anziché una super-ficie piatta. Vi sono anche altri effettipiù complessi che dipendono dal mo-do in cui le strutture che si trovano aldi sotto della superficie principale as-sorbono o deflettono gli elettroni delfascio primario. Una piccola fibra, peresempio, può apparire più luminosa diquanto ci si potrebbe attendere tenen-do conto delle sue sole dimensioni (siveda l'illustrazione in alto a pagina 20).

Questi effetti danno all'osservatorel'impressione di una struttura tridimen-sionale pur trattandosi di una micro-fotografia bidimensionale. Per stabili-re se la deduzione è esatta o meno, sipossono creare con facilità coppie diimmagini stereoscopiche riprendendodue microfotografie nelle quali l'ango-lo fra il campione e il raggio incidentedifferisca di parecchi gradi. L'osserva-zione delle due microfotografie con unvisore stereoscopico fornisce una veraimmagine tridimensionale.

I campioni biologici, che costituisco-no una grande percentuale degli ogget-ti esaminati al microscopio elettronicoa scansione, possono essere preparatiin diverse maniere. Un tipo di campio-ne è costituito da un organismo o daun tessuto biologico completo e nonsezionato; l'acqua deve essere accura-tamente asportata poiché il campionedeve essere piazzato nella camera sot-to vuoto dello strumento. Le tecnicheche vengono più spesso impiegate pertogliere l'acqua senza provocare seridanneggiamenti sono la essiccazione al-lo stato congelato e l'essiccazione alpunto critico. Se il campione è resi-stente alla deformazione o se si desi-dera il collasso della superficie per met-tere in evidenza le strutture sottostan-ti si può anche impiegare la sempliceessiccazione all'aria. Nella preparazio-ne dei campioni si adoperano talvoltaanche la fissazione, la coloritura, il la-vaggio, l'essiccazione e il rivestimento.Poiché spesso l'informazione desiderataè costituita dalle relazioni topologichefra le parti che costituiscono un mi-crosistema anziché dalle dimensioniprecise di una determinata parte, sipossono tollerare artifici come peresempio la contrazione, soprattuttoquando sono disponibili metodi micro-scopici sostitutivi per stabilire le di-mensioni effettive.

Volendo confrontare le immaginifornite da un microscopio ottico e daun microscopio elettronico a scansio-ne, si può montare facilmente il cam-

pione su un vetrino da inserire in en-trambi gli strumenti. Con l'uso atten-to di tecniche di sezionamento è pos-sibile esporre strati profondi di cam-pioni spessi per studiarne la topologiacol microscopio elettronico a scan-sione. È anche possibile esaminarecampioni sezionati secondo i metodidella normale microscopia ottica oelettronica.

Può sembrare sorprendente che esi-stano perfino alcuni organismi, per lopiù insetti, che possono essere osserva-ti viventi al microscopio elettronico ascansione. Uno di tali organismi è iltenebrione della farina (Tribolium con-fusum) (si vedano le figure a pagina18). Questo insetto in tutti gli stadidel suo ciclo vitale (uovo, larva, pupae adulto) è in grado di trattenere perun'ora tanta acqua da riuscire a so-pravvivere all'alto vuoto della cameradel microscopio. Poiché i campioni vi-venti, sotto il bombardamento di elet-troni a bassa intensità di corrente sicomportano come conduttori, non ènecessario rivestirli con metallo o trat-tarli in alcun altro modo.

La qualità più notevole delle imma-gini presentate dal microscopio elettro-nico a scansione è la facilità di inter-pretazione. Un insetto, per esempio,appare come tale; crediamo quindi ainostri occhi vedendo l'insetto come civiene presentato dal microscopio elet-tronico a scansione. Quando sono glieiettroni secondari a fornire l'immagi-ne questa fiducia è solitamente giusti-ficata per un gran numero di oggetti.Se però due parti del campione si tro-vano a potenziali differenti, gli elettro-ni secondari vengono raccolti in mododiverso per le due parti, producendonell'immagine contrasti poco abituali.È necessario familiarizzarsi con questevariazioni e forzare coscientemente ilproprio sistema visivo per interpretarel'immagine in modo nuovo. Se il se-gnale usato per produrre l'immaginenon è generato da elettroni secondari,ma da raggi X o da correnti prodottedal fascio primario di elettroni, puòmancare nell'immagine risultante qual-siasi rapporto topografico con l'origi-nale e occorre imparare di nuovo l'in-terpretazione di informazioni non fa-miliari.

Il segnale può inoltre essere codifi-cato artificialmente attribuendo peresempio ai vari livelli di intensità colo-ri differenti. Poiché l'occhio è più sen-sibile alle differenze cromatiche che al-le leggere variazioni delle tonalità digrigio, un'immagine codificata a coloripuò rivelare importanti informazioniche altrimenti sfuggirebbero. Allo stes-so tempo occorre fare attenzione a non

dare un'interpretazione errata all'im-magine leggendo in essa caratteristi-che basate su esperienze visive prece-denti e non pertinenti.

Tenendo presenti questi concetti,confrontiamo le informazioni ottenibi-li dal microscopio ottico, dal micro-scopio elettronico a trasmissione e dalmicroscopio elettronico a scansione. Iprimi due strumenti forniscono, me-diante una serie di lenti, immagini ot-tenute tramite radiazioni passanti at-traverso l'oggetto (o da questo riflesse).Il contrasto nell'immagine è provoca-to dalla dispersione o dall'assorbimen-to di fotoni o elettroni, oppure, per lerisoluzioni più alte, da variazioni di fa-se delle funzioni d'onda che rappresen-tano i fotoni o gli elettroni. Il fotoneassociato con la luce ha un livelloenergetico di pochi elettronvolt e puòquindi reagire con i legami chimici delcampione, che possiedono livelli ener-getici dello stesso ordine. Queste rea-zioni forniscono l'informazione croma-tica, preziosa per il biologo e il patolo-go, che possono cosí codificare gli ele-menti costitutivi della cellula coloran-doli in varie maniere. Nella microsco-pia elettronica a trasmissione si pos-sono codificare parti selezionate delcampione con colori costituiti da me-talli pesanti i cui pesanti nuclei disper-dono gli elettroni incidenti molto piùfortemente dei leggeri nuclei presentinella maggior parte dei campioni bio-logici.

Il microscopio elettronico a scansio-ne si differenzia da entrambi gli stru-menti precedenti in quanto la forma-zione dell'immagine non è limitata dal-la radiazione incidente; non è nemme-no necessario alcun sistema di focaliz-zazione dopo l'urto del fascio di elet-troni sul campione. I punti corrispon-denti del campione e dell'immagine so-no messi in correlazione nel tempo,consentendo cosí a qualsiasi segnalegenerato dal fascio primario di essereutilizzato come sorgente potenziale del-l'immagine. I segnali possono inoltreessere facilmente memorizzati su na-stri o dischi magnetici per presentazio-ni differite o per essere elaborati da uncalcolatore. L'elaborazione mediantecalcolatore delle immagini ottenute colmicroscopio elettronico a scansione èancora nella fase di sviluppo: si pre-senta però assai promettente. Poiché ivari tipi di microscopio forniscono in-formazioni di genere diverso, essi siintegrano a vicenda anziché farsi con-correnza. Ciascuno ha caratteristichesingolari che forniscono informazionisulla microstruttura del mondo in cuiviviamo.

La microfotografia di un transistore ottenuta con gli elettroni secondari in un microsco-pio elettronico a scansione mostra (in alto) che un terminale in oro si è spezzato eche si è formata una lega oro-alluminio fra il terminale e l'alluminio depositato sullasuperficie del transistore per formare il contatto. La lega è visibile come una zona bril-lante adiacente al terminale d'oro. Anche se il terminale è spezzato la corrente può es-sere ugualmente iniettata sul catodo mediante il fascio del microscopio elettronico.La corrente iniettata provoca un flusso di corrente fra l'emettitore e il collettore deltransistore, che può essere presentato come una traccia di deflessione. Molte tracce dideflessione di questo tipo possono concorrere alla composizione di un'immagine modu-lata per deflessione. Per un'analisi quantitativa delle prestazioni di un transistore è pre-feribile impiegare un'immagine che contenga solo poche tracce (al centro). Un'imma-gine con molte tracce (in basso) simula una superficie complessa la cui altezza èproporzionale al flusso di corrente fra emettitore e collettore. Immagini di questotipo consentono di studiare la relazione fra la corrente indotta e la struttura fisica.

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