IL MICROSCOPIO: principi e componenti di base

Che cos’è un microscopio?

Il microscopio è uno strumento che rende visibili i dettagli più piccoli

Il microscopio compie tre operazioni: 1) Ingrandimento: l’immagine del campione è ingrandita 2) Risoluzione: i dettagli nell’immagine sono separati

3) Contrasto: i dettagli sono resi visibili all’occhio umano o ad altri strumenti atti a rilevarli

Relazioni tra il microscopio e l’occhio umano

L’occhio umano percepisce i colori del visibile e le differenze di intensità luminosa (intensità che varia dal nero al bianco e tra tutte le tonalità di grigio)

Sezione occhio umano Sezione retina

I recettori dei colori sono le cellule coniche (cone cells) e quelle che rilevano l’intensità luminosa sono le cellule a bastoncino (rod cells). Entrambi presenti

nella retina. La retina è situata nella parte posteriore dell’interno dell’occhio.

La cornea e le lenti determinano il meccanismo di far entrare e di focalizzare la luce verso la retina.

Da qui, parte ilo messaggio elettrochimico verso il cervello

L’occhio distingue chiaramente i dettagli di un immagine quando questa è diffusa sulla retina con un sufficiente angolo

visuale

Oggetto posto lontano dall’occhio

Oggetto posto vicino dall’occhio

Il microscopio semplice

A causa della limitata capacità delle lenti dell’occhio di modificare la propria forma, gli oggetti molto vicini all’occhio non possono avere una immagine

focalizzata sulla retina

Lenti convesse (spesse al centro) sono stati utilizzati come lente d’ingrandimento o microscopio semplice

Il campione è focalizzato sulla retina grazie ad una lente d’ingrandimento posta tra

l’oggetto e l’occhio

Limiti Posizionamento del campione

Illuminazione Aberrazione delle lenti

costruzione

Microscopio di Von Leeuwenhoek

Il microscopio composto (Galileo) Il microscopio composto mostra

1. due lenti convesse allineati in serie: una lente vicino all’oggetto (obiettivo) e una lente vicino all’occhio (oculare)

2. Mezzi che permettono il movimento delle lenti e del campione

Il microscopio composto determina un ingrandimento a due stadi:

1. l’obiettivo proietta un’immagine ingrandita del campione nel tubo del microscopio

2. l’oculare ingrandisce ulteriormente tale immagine

Ad esempio: se si utilizza un obiettivo 10X ed un oculare 15X, l’ingrandimento totale sarà di 150X

Funzionamento di un microscopio

1. la luce di una lampada passa attraverso un condensatore;

2. quindi attraversa il vetrino con il campione posto su un’apertura della

piastra porta­oggetti 3. la luce è poi raccolta dall’obiettivo 4. l’obiettivo insieme alle lenti posti nel

tubo, focalizzano l’immagine del campione a livello del diaframma dell’oculare

5. l’immagine è poi vista dall’osservatore come se essa è posizionata a 250 mm

dall’occhio

L’immagine non deve essere solamente ingrandita ma deve essere anche chiara.

Considerazioni sulla formazione dell’immagine

Risoluzione

Apertura numerica

Quando la luce dai vari punti del campione passa

attraverso l’obiettivo, questi punti sono visti

nell’immagine come piccoli dischi e non punti. Questo è

causato dalla diffrazione e diffusione della luce.

Tali dischi sul piano dell’immagine, consistono di piccoli

cerchi concentrici luminosi e bui.

Più piccoli sono questi dischi, meno si sovrappongono e

maggiore saranno i dettagli dell’immagine.

La capacità di distinguere chiaramente i dettagli più minuti del campione è conosciuta con il nome di potere di risoluzione

Il potere risolvente del microscopio è misurato dalla minima distanza che separa due punti o due linee vicine ma ancora distinguibili.

Se si riduce l’apertura del diaframma di apertura del condensatore, il contrasto aumenta ma diminuisce il potere risolvente.

Comunemente si trova un compromesso fra i due estremi

La capacità di un obiettivo di comprendere i vari raggi della luce provenienti da ciascuna parte illuminata del campione, è direttamente

relativa all’apertura angolare dell’obiettivo

Apertura numerica = n * siin µ

n= indice di rifrazione del materiale presente nello spazio tra il campione e la lente frontale

µ = grado di apertura angolare dell’obiettivo

L’apertura numerica del microscopio è data da quella dell’obiettivo più quella del condensatore

Comparazione di un microscopio a bassa ed alta apertura numerica

I dettagli dell’immagine possono essere rilevati anche con obiettivi di bassa apertura numerica.

Infatti, gli obiettivi a bassa apertura numerica hanno una maggiore profondità di campo e quindi una maggiore distanza tra l’obiettivo e il

campione rispetto agli obiettivi di alta apertura numerica

Comparazione della profondità di campo di un sistema a bassa ed alta apertura numerica

Correzione dell’aberrazione cromatica: i principali colori sono proiettati in un unico punto di focalizzazione

Correzione dell’aberrazione sferica: i raggi di luce che passano in posizioni

diverse attraverso la lente sono proiettati in un punto di focalizzazione

1. La sua funzione di base è acquisire la luce che passa attraverso il campione ed proiettare un’immagine invertita del campione nel corpo del

microscopio

2. Dovrebbe avere la capacità di ricostruire i vari punti del campione in corrispondenti punti dell’immagine chiamati “ anti.punti” (disco circolare di

diametro definito)

3. Deve essere costruito in modo tale che possa fuocalizzare ad una distanza più vicina possibile al campione e quindi proiettare un immagine

ingrandita nel microscopio

4.Dovrebbe avere la parte frontale della lente ritraibile in modo da proteggerla nel caso in cui l’obiettivo richiede di focalizzare molto vicino al

campione

Componenti ottici di un microscopio L’obiettivo è il più importante componente ottico del microscopio ed è costituito da una serie di lenti

Tipi di obiettivi 1. Acromatico A) Meno costoso

B) Sono corretti cromaticamente per la luce blu e rossa C) Sono corretti per le aberrazioni sferiche per il colore

verde D) Migliori risultati sono ottenuti con luce che passa

attraverso un filtro verde e con immagini in bianco e nero 2. Fluorite

A) Più costoso dell’acromatico B) Sono corretti crormaticamente per la luce blu, rossa ed anche verde

C) Sono corretti per le aberrazioni sferiche per il blu ed il rosso D) Sono uitili per la fotomicrogrsfis a colori

3. Apocromatico A) Più costosi

B) Sono corretti cromaticamente per il blu profondo, blu, verde e rosso C) Sono corretti sfericamente per il blu profondo, blu e verde

D) Sono i migliori obiettivi per la registrazione e l’osservazione a colori E) Maggiore numero di aperture

Al fine di ottenere immagini piane e non curve esistono degli

obiettivi chiamati “ Acromatico piano” o (Fluorite piano” o

“ Apocromatico piano”

La correzione della curvatura di campo è indispensabile per la registrazione delle

immagini

Complessità del sistema delle lenti che costituiscono un obiettivo apocromatico all’incrementare dell’ingrandimento

Descrizione delle caratteristiche sull’obiettivo

1. Ingrandimento (10X, 20X, 40X, ecc.)

2. Il segno ∞ la correzione per l’infinito

3. lo spessore del copri vetrino (0.17 mm)

4. Il tipo di obiettivo

5. Se l’obiettivo è costruito per operare in immersione

6. apertura numerica (0.04­1.4)

7. Banda colorata per distinguere l’ingrandimento

L’oculare

Gli obiettivi devono essere utilizzati in combinazione con gli

oculari per ottenere i migliori risultati

Caratteristiche funzionali dell’oculare

1. La sua funzione base è “ guardare” l’immagine ingrandita proiettata

dall’obiettivo ed ingrandire una seconda volta l’immagine (immagine

virtuale);

2. Un piccolo oculare serve per acquisire l’immagine (quella proiettata

dall’obiettivo) mediante sistemi fotografici o video.

3. Nell’oculare alloggia un diaframma fisso. Ed è sul piano di questo

diaframma che sarà proiettata l’immagine dall’obiettivo;

4. Sulla montatura del diaframma fisso si può inserire un reticolo per le

Tipi di oculari Ramsden (oculare positivo) Huygenian (oculare negativo)

Nel tipo positivo, le lenti costituite da diversi elementi uniti insieme, sono

posti sopra il diaframma fisso. La porzione in basso dell’oculare si

può svitare per poi, a seconda dell’uso, porre un reticolo che serve

per conteggiare o misurare.

Nel tipo negativo sono presenti due lenti: la superiore e l’inferiore o lente di campo. Entrambe le lenti sono

piano­convessi con la parte convessa rivolta verso il campione A metà distanza tra queste due lenti

è presente il diaframma fisso

Il condensatore

Il condensatore è posto sotto la piastra portaoggetti ed, in particolare, tra la lampada per l’illuminazione ed il campione.

1. La sua funzione base è quella di “ raccogliere” la luce proveniente dal sistema di illuminazione e concentrarla a raggi paralleli sul campione e, attraversato questo, sul piano focale dell’obiettivo;

2. Esso è costruito in modo tale che la luce arrivi a focalizzarsi all’apertura del suo diaframma;

3. I nuovi modelli di condensatore sono provvisti sistemi di correzione delle lenti;

4. In alcuni microscopi, nel condensatore sono alloggiati gli accessori per il contrasto di fase

Caratteristiche funzionali dell’oculare

Condensatore di tipo Abbe Apertura numerica di 1.25

Non è ben corretto per le aberrazioni cromatiche e sferiche

Utilizzato per le osservazioni di routine

Condensatore di tipo Aplanatico­Acromatico

Le aberrazioni cromatiche e sferiche sono ben corrette

Utilizzato per l’osservazioni a colori

L’appropriato utilizzo dell’apertura del diaframma del condensatore è importante nel determinare l’ottimo livello di illuminazione e di

contrasto

L’apertura del diaframma controlla l’angolo dei raggi luminosi che passano attraverso il campione e vanno

nell’obiettivo

Considerazioni sull’utilizzo

Quando si utilizzano obiettivi di basso ingrandimento è preferibile svitare la lente superiore del condensatore oppure utilizzare un condensatore di

basso potere

L’altezza del condensatore è regolata da uno o due viti. L’aggiustamento di tale altezza è importante per

l’illuminazione (vedi dopo)

Altre componenti ottici del microscopio 1. Alla base del condensatore, sotto il condensatore, è presente

uno specchio (la superficie frontale è argentata) la cui

funzione è quella di riflettere la luce che arriva dal sistema di

illuminazione verso il condensatore. Prima dello

specchio è posto un diaframma definito diaframma di campo.

2. Nella parte più bassa del tubo di osservazione è incorporata una lente (tube lens) la cui funzione è

quella di raccogliere i raggi paralleli del proiettati dall’obiettivo e condurli al piano del diaframma

fisso dell’oculare

3. la base del microscopio contiene una lente (collector lens) che è posta di fronte il sistema di illuminazione e la sua funzione è

quella di indirizzare la luce, attraverso lo specchio, sul piano

Componenti meccanici/elettrici

1. la base del microscopio, a forma differente, permette una grande stabilità. Inoltre, in essa sono presenti i componenti

elettrici per azionare e controllare il sistema di

illuminazione. Questo è posto nella parte bassa e posteriore della base. La base inoltre presenta il diaframma di

campo.

2. Il piano del microscopio presenta un’apertura che

permette il passaggio della luce e dove è posto il vetrino con il campione. Inoltre sono presenti delle manopole che muovono il

campione (sopra/sotto e sinistra/destra);

3. Sulla parte destra e sinistra del sostegno del microscopio sono presenti le manopole per la messa a fuoco sia grossolana (vite macrometrica) sia fine (vite

micrometrica)

4. sotto il piano o piastra è posto un contenitore per

l’alloggiamento del condensatore. Questo contenitore può essere svitato e potrebbe avere delle viti per centrare il

condensatore all’asse ottico del microscopio

5. sul supporto del microscopio è posto un portaobiettivi (nosepiece) che è fissato o rimovibile, e su esso sono montati gli

obiettivi di diverso

6. Tubi rimovibili, sia

binoculari sia trinoculari,

sono attaccati al sostegno

del microscopio sopra il

portaobiettivi. Il binoculare è

utilizzato solo per vedere

mentre il trinoculare è

utilizzato anche per

fotografare. Essi sono

posizionati ad un angolo di

30° per facilitare

l’osservazione

L’intelaiatura del microscopio ha le seguenti funzioni:

1. Assicurare la stabilità e rigidità al microscopio; 2. Fornire il supporto per alloggiare gli obiettivi e l’oculare;

3. Contenere il campione su una superficie piana e permettere il movimento di questo campione mediante apposite manopole

4. Fornire il supporto al condensatore, al sistema di illuminazione ed al sistema elettrico

I moderni microscopi hanno le caratteristiche di essere ergonomici ed modulari

Diversi componenti

sono

intercambiabili:

condensatori,

obiettivi, oculari,

lampade, tubi di

osservazione, ecc.

A) Le viti per la messa a fuoco sono concentrici e posti sulla parte superiore del microscopio facilitando così

l’operatore (le mani o le braccia non devono essere in alta posizione);

B) La base frontale è stretta per permettere un facile accesso agli accessori;

C) L’angolo per l’osservazione permette lunghi periodi di lavoro senza affaticarsi;

D) Il portaobiettivi è costruito in modo tale che, quando un obiettivo è utilizzato, gli altri due non ostacolano le dita

dell’operatore.

Sistema di illuminazione

Inizialmente, la sorgente di luce era costituita dalla luce solare mentre

successivamente sono state adottate delle lampade elettriche di vario

tipo.

Queste sorgenti luce erano focalizzate direttamente sul campione

mediante un condensatore.

Problemi: Scarsa uniformità di illuminazione determinata da:

1. Limitata dimensione della sorgente di luce (poca luce);

2. L’immagine della luce era inopportunamente sovrapposta sull’immagine del campione

Nei primi anni del 1900, August Kohler progettò un sistema di

illuminazione (Illuminazione Koehler) che superò tali problemi

Illuminazione Koehler Metodo:

Una lente (collector lens) è posta di fronte

alla sorgente di illuminazione e proietta

un’immagine allargata della luce verso il

diaframma di apertura del condensatore

1. Poiché la luce è focalizzata di fronte al piano focale del condensatore, la

luce emergente attraversa il campione per raggi paralleli;

2. Poiché la luce non è focalizzata sul piano del campione, essa si presenta

estesa e non sgranata

La regolazione del diaframma di apertura

del condensatore controlla l’angolo del

cono di luce che raggiunge il campione;

Un secondo diaframma (diaframma di

campo) invece controlla il diametro (e non

l’angolo) della luce che attraversa il

campione.

Manipolando questi due diaframmai si

raggiunge il miglior compromesso tra

risoluzione e contrasto

Procedura per settare l’illuminazione di Koehler

1. Accendere la lampada del microscopio, aprire totalmente entrambi i diaframmi (diaframma di apertura e diaframma di campo);

2. Ruotare il portaobiettivi per portare l’obiettivo 10X sulla il percorso della luce.

3. Porre il campione sulla piastra e focalizzare mediante le viti;

4. Chiudere totalmente il diaframma di campo. Quindi, salire il condensatore e focalizzare l’immagine del diaframma di campo (forma poligono) su quella del

campione; Se l’immagine del diaframma di campo non è centrata, usa la manopole del condensatore per centrarla. Poi aprire il diaframma di campo fino alla sua

scomparsa dalla vista;

5. Tirare fuori un oculare e guarda dentro il tubo. Nel guardare, aprire e chiudere il diaframma di apertura del condensatore ed aggiustare la sua apertura che sia aperta di 2/3 o ¾ (miglior compromesso tra risoluzione e

contrasto). Quindi riporre l’oculare;

6. Osservare i suddetti steps ogniqualvolta si cambia l’obiettivo

Procedura per focalizzare il microscopio

1. Accendere la lampada e settare l’intensità di luce per un’osservazione confortevole

2. Guardando attraverso l’oculare, afferrare i due tubi con le mani ed avvicinarli o allontanarli fino a che si osserva un solo cerchio di visione;

3. Porre un vetrino con il campione sulla piastra ed aumentare o diminuire l’altezza della piastra utilizzando la vite macrometrica. Portare a fuoco e quindi utilizzare la vite micrometrica per una perfetta messa a fuoco;

4. Se si desidera utilizzare un altro obiettivo, la nuovo messa a fuoco sarà eseguita solamente con la vite micrometrica

Tipi di microscopio

Microscopio ottico:

1. Per luce trasmessa (quando all’obiettivo giunge la luce che

attraversa il campione)

2. Per luce diffusa (quando il campione è illuminato in modo che all’obiettivo giunge solo la

luce da esso diffusa)

3. Per luce riflessa (quando l’obiettivo raccoglie la luce riflessa dalla superficie

dell’oggetto)

Campioni opachi

Campioni trasparenti colorati (metodo della colorazione

Per campioni trasparenti sui quali la colorazione può interferire con i processi oggetti di studio (ad esempio, cellula vivente o amebe), si utilizza

Microscopio a contrasto di fase

Converte in differenze di intensità le differenze di fase che si producono tra la luce che attraversa le parti interne del campione e la luce diretta

proveniente dal piano su cui questo è posto Come si forma un’immagine? L’immagine si forma in quanto

l’onda elettromagnetica (luce) che attraverso un oggetto opaco è

costituita da due onde (incidente e diffratta) sfasate di mezza

lunghezza d’onda. Per questo motivo le due onde interferiscono

tra loro dando luogo ad un immagine meno luminosa

In un mezzo trasparente ci sono sempre due onde, delle quali quella diffratta non è sufficientemente sfasata tale da modificare la lucentezza dell’immagine.

Nel microscopio a contrasto di fase, l’onda diffratta viene separata e

modificata in modo che si propaghi sfasata con mezza lunghezza

d’onda rispetto a quella incidente. Essa interferisce con l’onda

incidente cosicché il campione trasparente viene evidenziato in tutti i

suoi particolare come se fosse un oggetto opaco

Diaframma circolare

Disco ritarda­fase

Funzionamento del microscopio a contrasto di fase

Diaframma circolare

Disco ritarda­fase

Microscopio a fluorescenza

Il campione, illuminato con

luce ultravioletta, viene

trattato con opportune

sostanze coloranti che

emettono per fluorescenza

nel campo del visibile

Immagine al m. a fluorescenza

Microscopio polarizzatore

Il campione è posto tra due nicol (funzionanti

rispettivamente da polarizzatore e da

analizzatore).

Utilizzato soprattutto in mineralogia,

nell’osservazione di strutture microcristalline,

identificabile in base agli effetti cromatici

Cristallo al microscopio polarizzatore

Microscopio invertito

Il sistema di illuminazione ed il

sistema ottico sono rovesciati

rispetto a quelli di un normale m.

ottico, il che permette di esaminare la

parte inferiore del preparato (colture

cellulari)

Stereomicroscopio

Lo stereomicroscopio è uno strumento che vi permette di

vedere in tre dimensioni gli oggetti

osservando il campione da due

angoli leggermente diversi e ottenendo le due

immagini necessarie per la visione stereoscopica.

Stereomicroscopio

E' un microscopio adatto all'entomologia, alla mineralogia,

alla botanica, quindi è largamente impiegato in numerosi campi di

ricerca,

Microscopio elettronico

Particolare tipo di microscopio

in cui l’osservazione

dell’oggetto è realizzata tramite

un fascio di elettroni . Questo

permette di ingrandire l’oggetto

più di 100.000 volte ad un

potere risolvente dell’ordine

dell’angstrom