I giovedì della cultura scientificaI giovedì della cultura scientifica“Etica e sperimentazione animale nella ricerca biomedica”“Etica e sperimentazione animale nella ricerca biomedica”

Genomica e modelli animalidi malattie umaneMariateresa Mancuso

BIOTEC-MED

Piccole dimensioni: facile da manipolare,

bassi costi di mantenimento

Similarità fisiologica e

genetica con l’uomoAlto tasso di fertilità: Alto tasso di fertilità:

progenie multipla progenie multipla ottenibile ogni 9 ottenibile ogni 9

settimane settimane

Mus Musculus : organismo modello nella ricerca biomedica

Organismo Organismo complessocomplesso

Confronto tra il genoma del topo e dell’uomo

14% più piccolo (2.5 bilioni di basi versus 2.9)

> 90% di sintenia

350 regioni conservate

Topo UomoCromosomi di topo Cromosomi umani

Entrambi contengonoEntrambi contengono circa 30.000circa 30.000 geni codificanti proteinegeni codificanti proteine

80%80% dei genidei geni inin omologiaomologia

Il genoma del topo è facilmente manipolabile

TOPI INBRED

Accoppiamento tra Accoppiamento tra fratellofratello--sorella per 20sorella per 20--30 generazioni successive30 generazioni successive

98.6% di omozigosi a tutti i loci

Minima variabilità genetica in una popolazione

Possibilità di fissare uno specifico fenotipo

Suscettibilità o resistenza

allo sviluppo di tumori spontanei

La suscettibilità e/o la resistenza all’insorgenza di un particolare tumore può essere

ottenuta tramite un programma di accoppiamento selettivo bidirezionale mediante

applicazione di un protocollo di cancerogenesi chimica a due stadi

Selezione genetica delle linee Car-S e Car-R

F0

C a r-R ( F1 6 )C ar-S ( F1 9 )

A D BA /2 P SWR SJL C B A BA L B /c C57BL/ 6

F 1 F 1 F 1 F 1

F 2 F 2

DMBA-TPA-

Basse dosi

DMBA-TPA-

Alte dosi

Differenza in termini di suscettibilità > di 100 volte

Alcuni geni coinvolti nella suscettibilità e nella resistenza sono stati identificati

…primi tentativi di manipolazione genetica del genoma murino

Mutazioni multiple casuali introdotte nella linea germinale mediante l’utilizzo di cancerogeni chimici permettono di identificare singole

mutazioni responsabili dell’insorgenza di un determinato fenotipo

Topi Topi MinMin (Multiple (Multiple intestinalintestinal neoplasia) neoplasia)

Ottenuti mediante mutagenesigerminale con ENU

C57Bl/6

Adenocarcinomi intestinali

Fenotipo primario trasmesso alla progenie

Poliposi adenomatosa familiare

Ch18. Mutazione non-senso nel codone 850 del gene murino Apc

Mutazione Min

Mutazione eterozigote del gene APC (oncosoppressore)

Topi Topi MinMin (Multiple (Multiple intestinalintestinal neoplasia) neoplasia)

Ottenuti mediante mutagenesigerminale con ENU

C57Bl/6

Adenocarcinomi intestinali

Fenotipo primario trasmesso alla progenie

Poliposi adenomatosa familiare

Ch18. Mutazione non-senso nel codone 850 del gene murino ApcMutazione Min

Mutazione eterozigote del gene APC (oncosoppressore)

Primo modello animale utilizzato per studi quantitativi e meccanicistici dell’induzione di neoplasie intestinali

Impossibilità di controllare i geni bersaglio da modificare

Necessità di vasti programmi di allevamento

Difficoltà di identificare i fenotipi recessivi

Lo sviluppo delle nuove metodologie per manipolare il genoma murino

ha rivoluzionato la capacità di generare modelli animali di malattie umane

Animali geneticamente modificati

Knockout

patologie dovute ad assenza di funzione

Transgenici

patologie dovute adalterazione di funzione

TOPI TRANSGENICI Patologie dovute ad alterazione di funzione

Promotore ATG

P(A)

Gene/cDNA di interesse Microiniezione

TOPI FONDATORI

Possono differire per numero di copie inserite (2-50)Effetto posizionaleAlterazione dell’espressione di un gene endogeno

Femmina balia

In grado di trasmettere il carattere per via ereditaria

Analisi del DNA

Il modello che meglio rappresenta la malattia umana deve essere selezionato osservando la progenie di vari topi fondatori

TOPI KNOCKOUT Patologie dovute ad assenza di funzione

Neo

Costrutto

Microiniezione

Knockout omozigote(-/-) Impianto in

una femmina balia

Chimera

Knockout eterozigote

(+/-)

Cellule ES

ElettropolazioneRicombinazione

Cellula ES conun gene mutato

Selezione delle cellule KO mediante

trattamento con la neomicina

L’assenza di funzione di un gene è spesso incompatibile con la vita

La speranza è che il topo mutante esibisca sintomi simili ai soggetti umani e che la

patogenesi sia simile in entrambe le specie

Studiare gli stadi precoci prima della comparsa dei sintomi

Possibilità di individuare in vivo i bersagli di farmaci in viadi sperimentazione

Sono centinaia i modelli animali di malattie umane a carattere monogenico attualmente disponibili

RbApcp53Ptch

KKKK

Retinoblastoma familiarePoliposi adenomatasa del colonSindrome di Li-fraumeniSindrome di Gorlin

Sindromi familiari di predisposizione al tumore

AppAtmFmr1

K,TKK

Morbo di AlzheimerAtaxia telangiectasiaSindrome X fragile

Malattie neurologiche e neuromuscolari

TyrMitf mi

TK

Albinismo oculocutaneoSindrome di WaardenburgDisfunzioni della cresta neurale

RhoPrph2

TT

Retinite pigmentosaDegenerazioni della retinaMalattie della vista e dell’udito

C/8HbaHbb

KKK

Emofilia ATalessemia αTalessemia β

Malattie immunologiche ed ematologiche

CftrLdlrFmr1

KK,TK

Fibrosi cisticaIpercolesterolemia familiareArteriosclerosi

Malattie metaboliche e ormonali

Malattia ereditaria autosomica dominante con una incidenza stimata pari a 1/50.000-150.000. Difetto costituzionale in una delle due copie di un gene soppressore tumorale (Patched1)

SINDROME DI GORLINNumerose anomalie nello sviluppo

Ritardo mentaleCrescita eccessiva del corpo

Medulloblastoma (10%)SarcomiFibromi ovarici Basalioma (dopo irraggiamento)

Predisposizione alla tumorigenesi spontanea e radioindotta

Ptch1 -/- letalePtch1 +/- fenocopia della

sindrome di Gorlin

BASALIOMA

RIIdentificazione e caratterizzazione

molecolare delle lesioni preneoplasticheDipendenza dall’età al momento

dell’irraggiamentoPossibilità di identificare la cellula

bersaglioSperimentare terapie farmacologiche

e geniche

MEDULLOBLASTOMA

TOPI KNOCKOUT CONDIZIONALI: il sistema Cre/lox PQuesta strategia viene utilizzata per produrre modelli knockout

condizionali in cui è possibile accendere o spegnere l’espressione di un gene in un determinato tipo cellulare.

Estremamente vantaggiosa quando sono coinvolti geni la cui mutazione risulterebbe letale.

Cre è una ricombinasi sito-specifica che riconosce la sequenza lox P del fago P1.

Quando due siti lox P vengono inseriti nel DNA, la proteina Cre promuove la rimozione del frammento di DNA compreso tra i lox P.

Incrociando un topo che porta il gene di interesse,

fiancheggiato da due sequenze lox P, con uno in cui il

gene Cre si trova sotto il controllo di un promotore

tessuto-specifico, si ottiene un organismo in cui il gene

verrà rimosso solo nelle cellule che esprimono Cre.

MUTANTI CONDIZIONALI PER LO STUDIO DEL TUMORE MAMMARIO

Nel 50% dei casi di tumore mammario familiare sono state riscontrate mutazioni del gene Brca1.

La mancanza di Brca1 causa una precoce mortalità embrionale

Mutante condizionale in cui si determina la rimozione dell’esone 11 di Brca1 solo nelle

cellule epiteliali del tessuto mammario

Bassa frequenzaLunga latenzaTumore mammario

Quali altri geni sono coinvolti nello sviluppo del tumore mammario ?

Mutanti condizionali per Brca1 e p53 +/- : il 73% sviluppa il tumore

La perdita di p53 accelera lo sviluppo tumorale delle ghiandole mammarie di topi che presentano una specifica delezione di Brca1

CONCLUSIONI

La progressione della malattia può essere seguita in ambiente altamente controllato

Ci permettono di studiare la malattia in numerosi individui con un background omogeneo.

Anche quando il modello animale non ricapitola pienamente la malattia umana, può comunque fornire importanti indicazioni delle differenze interspecifiche e della suscettibilità individuale

Disporre di un modello animale premette di testare l’azione di nuovi farmaci e pone le basi per una possibile terapia genica

Malattie a carattere poligenico: obiettivo primario nel futuro della ricerca biomedica

Come fareste senza di me?