GLICOGENOSI DI TIPO III: GLICOGENOSI DI TIPO III:

RIVALUTAZIONE DELLE RIVALUTAZIONE DELLE

CARATTERISTICHE CLINICHE E CARATTERISTICHE CLINICHE E

GENETICHE DEI PAZIENTI E STATO GENETICHE DEI PAZIENTI E STATO

DELL’ARTE SUL MODELLO MURINO DELL’ARTE SUL MODELLO MURINO

KNOCK-OUTKNOCK-OUT

Giacomo P. Comi, Sabrina Lucchiari, Serena Pagliarani, Giacomo P. Comi, Sabrina Lucchiari, Serena Pagliarani,

Domenico Santoro Domenico Santoro

Centro Dino Ferrari, Dipartimento di Scienze Neurologiche, Centro Dino Ferrari, Dipartimento di Scienze Neurologiche,

Università degli Studi di Milano, Fondazione I.R.C.C.S. Ospedale Università degli Studi di Milano, Fondazione I.R.C.C.S. Ospedale

Maggiore Policlinico, Mangiagalli e Regina Elena, Milano, ItaliaMaggiore Policlinico, Mangiagalli e Regina Elena, Milano, Italia

Collaborazioni con:Collaborazioni con:

Istituto G. Gaslini, Genova: Istituto G. Gaslini, Genova: Mirella Mirella FilocamoFilocamo

Maja Di RoccoMaja Di Rocco

Dipartimento di Neuroscienze, Messina: Dipartimento di Neuroscienze, Messina: Carmelo Carmelo RodolicoRodolico

Antonio ToscanoAntonio Toscano

Ist. Pediatrico, Univ. Federico II , Napoli: Ist. Pediatrico, Univ. Federico II , Napoli: Daniela Daniela MelisMelis

Michelina SibilioMichelina Sibilio

Pediatria, Ospedale S. Gerardo, Monza: Pediatria, Ospedale S. Gerardo, Monza: Rossella PariniRossella Parini

Pediatria Ospedale San Paolo, Milano: Pediatria Ospedale San Paolo, Milano: Sabrina PaciSabrina Paci

Marta Marta Torcoletti Torcoletti

Ospedale Pediatrico Meyer, Firenze: Ospedale Pediatrico Meyer, Firenze: Maria Maria Alice DonatiAlice Donati

Studio Internazionale sulla Studio Internazionale sulla Glicogenosi di tipo IIIGlicogenosi di tipo III

progetto multicentrico di ricerca progetto multicentrico di ricerca

retrospettivo che riguarda la diagnosi, il retrospettivo che riguarda la diagnosi, il

decorso clinico ed il trattamento della GSDIII decorso clinico ed il trattamento della GSDIII

descrizione di ciascun paziente tramite dati descrizione di ciascun paziente tramite dati

clinici raccolti in un questionario clinici raccolti in un questionario

appositamente elaboratoappositamente elaborato

analisi dei dati complessivi per una analisi dei dati complessivi per una

valutazione più fine della malattiavalutazione più fine della malattia

G.P.A. Smit, Beatrix Childern’s Clinic, University Medical Center, Groningen, NL

Dati Dati generaligenerali

Gravidanza/nascitaGravidanza/nascita

Primi sintomiPrimi sintomi

Diagnosi: Diagnosi:

istologicaistologica

enzimaticaenzimatica

analisi di mutazionianalisi di mutazioni

Dieta e trattamenti Dieta e trattamenti farmacologicifarmacologici

Crescita Crescita

Parametri ematochimici e dati cliniciParametri ematochimici e dati clinici

IpoglicemiaIpoglicemia

IperlipidemiaIperlipidemia

Complicanze epaticheComplicanze epatiche

OsteopeniaOsteopenia

Aspetti psicosocialiAspetti psicosociali

CardiomiopatiaCardiomiopatia

Disordini neuromuscolariDisordini neuromuscolari

Disordini endocrinologiciDisordini endocrinologici

Funzionalità renaleFunzionalità renale

Documento di Microsoft Word

44 pts: 3 mesi-30 anni (0-3, 3-6, 6-12, 12-18, >18)

Iperlipidemia e rischio cardiovascolare early onset

ipercolesterolemia Ipertrigliceridemia correlazione con

ipoglicemia

importante in pts <3 aa

raccogliere dati sulla dieta

Pazienti GSDIII:

Maschi 26

Femmine 25

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

N. Pts

1 2 3 4 5 6 7 8

Decades

0

5

10

15

20

25

30

35

1-5 6-10 11-15 16-20 21-25 26-30 >31

Age groups (years)

Num

ber

of p

atie

nts

Età alla diagnosiEtà alla diagnosi

00,050,1

0,150,2

0,250,3

0,350,4

0,450,5

CONTROLS GSD 3 muscle

nM

ol/m

in/m

g

0

5

10

15

20

25

30

35

CONTROLS GSD 3 Eritrocites

U/ g

Hb

Attività enzimatica in muscolo e Attività enzimatica in muscolo e globuli rossiglobuli rossi

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

0 10 20 30 40 50 60 70

Age (yrs)

AST

(UI/

L)Correlazione tra età e transaminasiCorrelazione tra età e transaminasi

0

200

400

600

800

1000

1200

0 10 20 30 40 50 60 70

Age (Years)

AST

ALT

147107182387Media

U/L

>3021-3011-20<10Classi di età

AST and Age groups

0100200

300400500

<10 11-20 21-30 >30

Age groups

Mea

n v

alu

e

ALT age groups

0100200300400

<10 11-20 21-30 >30

Age groupsM

ean

val

ue

12381278337Media

U/L

>3021-3011-20<10Classi di

età

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

<10 11-20 21-30 >=31NormalHepatomegaly, diffuse homogeneous hyperechogenicityHepatomegaly, dishomogeneous hyperechogenicityHepatic involution, Cirrhosis - Transplant

Ecografia Ecografia epaticaepatica

Compromissione muscolatura respiratoria, tetraplegia.Compromissione muscolatura respiratoria, tetraplegia.Grado 10Grado 10

Impossibile mangiare, bere o restare seduto senza aiuto.Impossibile mangiare, bere o restare seduto senza aiuto.Grado 9Grado 9

Deambulazione impossibile senza sostegno.Deambulazione impossibile senza sostegno.Grado 8Grado 8

Non si alza da una sedia.Non si alza da una sedia.Grado 7Grado 7

Non sale le scale.Non sale le scale.Grado 6Grado 6

Non si alza in piedi se seduto sul pavimento.Non si alza in piedi se seduto sul pavimento.Grado 5Grado 5

Segno di Gowers.Segno di Gowers.Grado 4Grado 4

Ipostenia, marcia steppante, sale le scale con corrimano.Ipostenia, marcia steppante, sale le scale con corrimano.Grado 3Grado 3

Difficoltà a camminare su punte dei piedi, difetto di postura o marcia.Difficoltà a camminare su punte dei piedi, difetto di postura o marcia.Grado 2Grado 2

Deambulazione normale, mialgie, atrofia, non corre.Deambulazione normale, mialgie, atrofia, non corre.Grado 1Grado 1

Tutte le funzioni normali, IperCK asintomatica.Tutte le funzioni normali, IperCK asintomatica.Grado 0Grado 0

Scala modificata di Gardner–Medwin e Walton Scala modificata di Gardner–Medwin e Walton

per la valutazione della severità della per la valutazione della severità della

patologia muscolarepatologia muscolare

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Nostri riscontri

Evoluzione clinica dell'iposteniaEvoluzione clinica dell'ipostenia

Correlazione diretta tra età e progressione Correlazione diretta tra età e progressione

dell'ipostenia.dell'ipostenia.

Limitazione funzionale lieve in pazienti minori di 40 Limitazione funzionale lieve in pazienti minori di 40

anni (Punteggio Scala di Walton < 2).anni (Punteggio Scala di Walton < 2).

Ampia variabilità negli adulti maggiori di 40 anni Ampia variabilità negli adulti maggiori di 40 anni

(Punteggio Scala di Walton da 3 a 10).(Punteggio Scala di Walton da 3 a 10).

Ipostenia variabile prossimale e distale con Ipostenia variabile prossimale e distale con

prensione debole, marcia steppante…prensione debole, marcia steppante…

Frequente ipotrofia distale.Frequente ipotrofia distale.

Correlazione CPK/etàCorrelazione CPK/età

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

0 10 20 30 40 50 60

Age (years)

CPK

(IU/

L)

Valori normali < 180 I.U./L

0

2

4

6

8

10

<10 11-20 21-30 >=31

Normal Mild Hypertrophy Moderate Hypertrophy

Valutazione ecografica dell’ipertrofia cardiaca Valutazione ecografica dell’ipertrofia cardiaca (spessore del setto) in rapporto al BMS(spessore del setto) in rapporto al BMS

normalenormale <10 mm<10 mmmildmild 10-11 mm10-11 mmmoderatomoderato 12-13 mm12-13 mm

severosevero >14 mm>14 mm

Pt: donna, 42 aa, omozigosi R285X

•debolezza msc severa, ipotrofia, crampi

•segni miogenici diffusi

•dim. conduz nervi arti infer.

•no cardiomiopatia

Pt: uomo, 42 aa, omozigosi R285X

•Progressiva debolezza msc prox e dist

•LVH, ipertrofia del setto e parete posteriore ventricolo sin

1. Spessore del setto intervent.

2. Volume diastolico/sistolico

3. Frazione di eiezione

Una grossa percentuale (55%) di pazienti sviluppa una Una grossa percentuale (55%) di pazienti sviluppa una cardiomiopatia, ecocardiograficamente simile ad una iniziale cardiomiopatia, ecocardiograficamente simile ad una iniziale cardiomiopatia ipertrofica idiopatica (ref. Lee et al. 1997). cardiomiopatia ipertrofica idiopatica (ref. Lee et al. 1997).

L’ecocardio è in genere normale o mostra lieve ipertrofia cardiaca L’ecocardio è in genere normale o mostra lieve ipertrofia cardiaca asintomatica nella prima decade. asintomatica nella prima decade.

Tra i pazienti nella prima decade, 8 avevano un ecocardio Tra i pazienti nella prima decade, 8 avevano un ecocardio normale (47%), 9 avevano una lieve ipertrofia (53%), mentre normale (47%), 9 avevano una lieve ipertrofia (53%), mentre nessuno aveva un’ipertrofia cardiaca moderata o severa. nessuno aveva un’ipertrofia cardiaca moderata o severa.

Nel gruppo di età tra gli 11 e i 20 anni, un paziente aveva un Nel gruppo di età tra gli 11 e i 20 anni, un paziente aveva un ecocardio normale, 2 avevano lieve e uno moderata ipertrofia. ecocardio normale, 2 avevano lieve e uno moderata ipertrofia.

Tra i maggiori di 21 anni, abbiamo rilevato 5 pazienti (31%) con Tra i maggiori di 21 anni, abbiamo rilevato 5 pazienti (31%) con ecocardio normale, 9 (56%) con lieve e 1 (6%) con moderata ecocardio normale, 9 (56%) con lieve e 1 (6%) con moderata ipertrofia. ipertrofia.

Un paziente è stato sottoposto a trapianto cardiaco all’età di 45 Un paziente è stato sottoposto a trapianto cardiaco all’età di 45 anni.anni.

I nostri dati indicano globalmente un basso richio di scompenso I nostri dati indicano globalmente un basso richio di scompenso cardiaco e una lenta evoluzione del danno cardiaco, ma un attento cardiaco e una lenta evoluzione del danno cardiaco, ma un attento follow up annuale è necessario per identificare soggetti a richio.follow up annuale è necessario per identificare soggetti a richio.

Ipertrofia cardiaca nei pazienti GSDIIIIpertrofia cardiaca nei pazienti GSDIII

Elettromiografia

Normal

19%

Myopathic

19%Neurogen

48%

Both

14%

Normal Myopathic Neurogen Both

Dati elettromiografici di 21 pazienti

Scariche pseudomiotoniche in 4 pts con segni di miopatia e in 10 pts con denervazione neurogenica cronica

NormaleNormale 44

MiopaticoMiopatico 44

NeurogenNeurogenoo 1010

EntrambiEntrambi 33

Mutation Type % on Characterized Alleles

Exon Skipping 40.3IVS21+1 A/ G In Frame 23.4IVS6+3 A/ G In Frame 11.7IVS4+2 T/ A Out of Frame pmIVS26+1 G/ C Out of Frame pm

Stop 23.4R1218X 5.2T1398X pmR34X pmR864X pmW1327X pmS530X pmR977X pmR285X pmR91OX pmK422X pm

Missense 15.6R675W pmC234R pmR428K pmT38A pmR524H pmA1120P pmG1087R pmA253P pm

Microdeletions 10.4676DelG 2.62547DelG pm442DelA pm8bpDel pm753-6DelGACA pm3963DelG pm

Microinsertions 10.41072insT pm4724insAA pm4312insA pm

Macroinsertion 1.338bpDup pm

Mutation Effects GSD TypeN°Pts

Geographic Origin Author

17 delAG frameshift IIIb 10 Caucasian Shen, 1996. J Clin InvestQ6X stop IIIb 1 Caucasian "

W680X stop IIIa 1 Caucasian "R864X stop IIIa 1 Caucasian "

R1228X stop IIIa 1 Caucasian "

4529 insA frameshift IIIa 1 ? Shen, 1996. Hum Mut

IVS32 -12 A/ G exon-skip IIIa 1 J apanese Okubo, 1998. Hum Gen" 1 Caucasian Shaiu, 2000. Mol Gen Metab

G1448R missense IIIa 1 J apanese Okubo, 1999. Hum Mut2399 delC frameshift IIIb ? 1 J apanese Okubo, 2000. Am J Med Gen

IVS33 +5 G/ A exon-skip IIIb ? 1 Chinese "IVS14 +1 G/ C exon-skip IIIa 1 J apanese Okubo, 2000. Hum Gen

L124X stop IIIa 2 J apanese "IVS29 -1 G/ C exon-skip IIIa 2 J apanese "

587 delC frameshift IIIa 1 J apanese "4216 del AG frameshift IIIa 2 J apanese "2072 insA frameshift IIIa 1 J apanese "

4735 insTAT frameshift IIIa 2 J apanese "

2725_19delTCAG frameshift IIIa 2 Hong Kong Chinese Lam, 2004. Mol Genet MetabR408X stop IIIa 1 Chinese "R408X stop IIIa 6 Faroe Islands Santer, 2001. Eur J Hum Genet

4455 delT frameshift IIIa 12 North African J ewish Parvari, 1997. Eur J Hum Gen

Biochem Diagn 3 Inuit Zimakas, 2005. Canad Med Ass J

3904 insA frameshift IIIa 1 Ashkenazi J ewish Parvari, 1998. J Inh Met Dis4214 insA frameshift IIIa 1 Ashkenazi J ewish "

3964 delT frameshift IIIa 1 African American Shaiu, 2000. Mol Gen Metab

Q32X stop IIIa ? ? Shaiu, 2000. Mol Gen MetabQ86X stop IIIa ? ? "

3014 delG frameshift IIIa ? ? "3665 delC frameshift IIIa ? ? "V647del frameshift IIIa ? ? "

Modello animale

Targeting vector completato ma non è stato possibile trovare una sonda specifica per rilevare le ES positive al K.O. dell’esone

3

1

collocare la cassetta Neo nell’esone 4esone 4 ripetendo l’intera procedura per la costruzione del vettore e il disegno della sonda

2

metodica del gene gene traptrap con l’acquisto di cloni di cellule ES 129SvEv che contengono già il gene interrotto.

“Piazza Cavour”, Rimini 1940

1 Lucchiari S, Santoro D, Pagliarani S, Comi GP. Clinical, 1 Lucchiari S, Santoro D, Pagliarani S, Comi GP. Clinical, biochemical and genetic features of glycogen debranching biochemical and genetic features of glycogen debranching enzyme deficiency. Acta Myol. 2007;26(1):72-4.enzyme deficiency. Acta Myol. 2007;26(1):72-4. 2 Lucchiari S, Pagliarani S, Salani S, Filocamo M, Di Rocco 2 Lucchiari S, Pagliarani S, Salani S, Filocamo M, Di Rocco M, Melis D, Rodolico C, Musumeci O, Toscano A, Bresolin M, Melis D, Rodolico C, Musumeci O, Toscano A, Bresolin N, Comi GP. Hepatic and neuromuscular forms of N, Comi GP. Hepatic and neuromuscular forms of glycogenosis type III: nine mutations in AGL. Hum Mutat. glycogenosis type III: nine mutations in AGL. Hum Mutat. 2006 Jun;27(6):600-12006 Jun;27(6):600-1

3 Lucchiari S, Donati MA, Melis D, Filocamo M, Parini R, 3 Lucchiari S, Donati MA, Melis D, Filocamo M, Parini R, Bresolin N, Comi GP. Mutational analysis of the AGL gene: Bresolin N, Comi GP. Mutational analysis of the AGL gene: five novel mutations in GSD III patients. Hum Mutat. five novel mutations in GSD III patients. Hum Mutat. 2003;22(4):337. 2003;22(4):337.

4 Lucchiari S, Donati MA, Parini R, Melis D, Gatti R, 4 Lucchiari S, Donati MA, Parini R, Melis D, Gatti R, Bresolin N, Scarlato G, Comi GP. Molecular Bresolin N, Scarlato G, Comi GP. Molecular characterisation of GSD III subjects and identification of six characterisation of GSD III subjects and identification of six novel mutations in AGL. Hum Mutat. 2002;20(6):480. novel mutations in AGL. Hum Mutat. 2002;20(6):480. 5 Lucchiari S, Fogh I, Prelle A, Parini R, Bresolin N, Melis 5 Lucchiari S, Fogh I, Prelle A, Parini R, Bresolin N, Melis D, Fiori L, Scarlato G, Comi GP. Clinical and genetic D, Fiori L, Scarlato G, Comi GP. Clinical and genetic variability of glycogen storage disease type IIIa: seven variability of glycogen storage disease type IIIa: seven novel AGL gene mutations in the Mediterranean area. Am J novel AGL gene mutations in the Mediterranean area. Am J Med Genet. 2002 1;109(3):183-90. Med Genet. 2002 1;109(3):183-90. 6 Comi GP, Fortunato F, Lucchiari S, Bordoni A, Prelle A, 6 Comi GP, Fortunato F, Lucchiari S, Bordoni A, Prelle A, Jann S, Keller A, Ciscato P, Galbiati S, Chiveri L, Torrente Jann S, Keller A, Ciscato P, Galbiati S, Chiveri L, Torrente Y, Scarlato G, Bresolin N. Beta-enolase deficiency, a new Y, Scarlato G, Bresolin N. Beta-enolase deficiency, a new metabolic myopathy of distal glycolysis. Ann Neurol. metabolic myopathy of distal glycolysis. Ann Neurol. 2001;50(2):202-7. 2001;50(2):202-7.

7 Hadjigeorgiou GM, Comi GP, Bordoni A, Shen J, Chen YT, 7 Hadjigeorgiou GM, Comi GP, Bordoni A, Shen J, Chen YT, Salani S, Toscano A, Fortunato F, Lucchiari S, Bresolin N, Salani S, Toscano A, Fortunato F, Lucchiari S, Bresolin N, Rodolico C, Piscaglia MG, Franceschina L, Papadimitriou A, Rodolico C, Piscaglia MG, Franceschina L, Papadimitriou A, Scarlato G. Novel donor splice site mutations of AGL gene Scarlato G. Novel donor splice site mutations of AGL gene in glycogen storage disease type IIIa. J Inherit Metab Dis. in glycogen storage disease type IIIa. J Inherit Metab Dis. 1999;22(6):762-3. 1999;22(6):762-3.