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Metodologie artificiali per l’aumento della variabilità

Stefano Pavan DiS.S.P.A

E-mail: [email protected]

•  Ibridazioni controllate (intra e interspecifica)

•  Poliploidia indotta

•  Mutagenesi sperimentale

•  Ingegneria genetica

•  Etc. Nota: i metodi ripropongono i meccanismi evolutivi principali che hanno portato alla biodiversità naturale. Devono essere considerati complementari ad azioni di salvaguardia delle risorse genetiche

Metodologie artificiali per l’aumento della variabilità genetica di specie coltivate (e/o per creare nuove specie coltivate)

Sul concetto di specie

•  Specie: una definizione comune è che la specie è un gruppo di individui

interfertili e in grado di dare progenie illimitatamente feconda. Tale definizione implicherebbe tuttavia che specie diverse non possono assolutamente incrociarsi o, se lo fanno, danno progenie non fertili.

•  In realtà per essere precisi, bisognerebbe dire che le specie sono: gruppi di individui che, in condizioni naturali, si incrociano normalmente tra loro a dare progenie fertile. Ciò implica che:

1) incroci naturali tra specie diverse possono occasionalmente avvenire, come dimostrato dalla storia evolutiva di molte specie coltivate e non; 2) In condizioni artificiali, le barriere riproduttive che ostacolano gli incroci interspecifici possono essere superate

•  Incroci interspecifici permettono di sfruttare i pool genici

secondario e terziario, e dunque aumentare la variabilità genetica di specie coltivate su cui poi fare selezione. Molto spesso, geni utili sono stati trasferiti attraverso successivi reincroci con la specie coltivata

•  Ibridi interspecifici e intergenerici artificiali sono stati in alcuni casi impiegati direttamente in coltivazione (si sono create in tal modo nuove specie ibride)

•  In alcuni casi, ibridi interspecifici e intergenerici artificiali hanno permesso, per raddoppiamento cromosomico artificiale, di ottenere nuove specie poliploidi

Incroci interspecifici

Incroci interspecifici

Resistance sources to O. neolycopersici

Name Source Ol-1 S. habrochaites G1.1560 ol-2 S. lycopersicum var. cerasiforme Ol-3 S. habrochaites G1.1290 Ol-4 S. peruvianum LA2172 Ol-5 S. habrochaites PI247087 Ol-6 Unknown origin Ol-qtl1,Ol-qtl2, Ol-qtl3 S. parviflorum G1. 1601

Ibridi direttamente impiegati in coltivazione:es. tangelo

C. reticulata x C. paradisiaca

Ibridi direttamente impiegati in coltivazione:es. mapo

C. reticulata x C. grandis

Ibridi direttamente impiegati nella coltivazione

Barriere riproduttive agli incroci interspecifici e intergenerici

•  Barriere pre-zigotiche: isolamento geografico, isolamento ecologico

(habitat diversi), isolamento stagionale (differente epoca di fioritura, isolamento meccanico (es. differenti specie di pronubi), incompatibilità genetica che impedisce la formazione dello zigote (es. il polline non riesce a germinare sullo stimma)

•  Barriere post-zigotiche: non vitalità o scarsa vigoria degli ibridi, sterilità degli ibridi (es. mancato appaiamento degli omologhi in meiosi, che determina una anormale distribuzione dei cromosomi nei gameti)

Come superare le barriere riproduttive

•  Individuare genotipi adatti: la variabilità esistente nelle specie gioca

un ruolo fondamentale sulla possibilità di ottenere ibridi interspecifici. Es. accessioni italiane di Trifolium negrescens si incrociano più facilmente con T. repens rispetto ad accessioni turche

•  Incroci reciproci

•  Incroci con specie “ponte”: es. Nicotiana repanda, N. tabacum e N. sylvestris (ponte) per il trasferimento di resistenza a nematodi


•  Tecniche particolari di impollinazione, es. 1.  Rimozione dello stigma 2.  Applicazione di sostanze ormonali alla pianta portaseme, allo

scopo di favorire l’allungamento del tubetto pollinico all’interno dello stilo

3.  Impollinazione successiva o contemporanea ad impollinazione con polline intraspecifico devitalizzato

•  Modificazione del livello di ploidia. Es. da colture di granuli pollinici di patata tetraploide si ottengono individui diploidi che possono essere facilmente incrociati con specie selvatiche di patata (anch’esse diploidi). Dopo l’introgressione di geni utili, lo stadio tetraploide può essere ripristinato attraverso l’induzione del raddoppiamento cromosomico


•  Coltura in vitro (coltura in vitro di embrioni): viene generalmente

fatto nei casi in cui all’incrocio interspecifico segue la degenerazione dell’endosperma)

•  Fusione di protoplasti (derivanti da cellule somatiche per degradazione della parete cellulare)


Fusione di protoplasti

•  Può essere un valido strumento per superare barriere di

incompatibilità interspecifiche ed intergeneriche. In questo caso, si creeranno nuove specie poliploidi

•  Ancora, può essere sfruttata per sfruttare direttamente gli effetti della poliploidia:

•  Maggiori dimensioni delle parti vegetative e riproduttive (importante per specie da fiore). In realtà sembra che la maggiore eterosi dei poliploidi, più che la poliploidia in sé, sia responsabile di questi fenotipi (linee inbred poliploidi sono inferiori alle corrispondenti linee diploidi)

•  Sterilità : es.banano e anguria (triploidi senza semi)

Poliploidia indotta

Poliploidia indotta: colchicina

Poliploidi artificiali

•  Semina contemporanea triploidi e diploidi

•  Impollinazione favorisce la formazione di frutti partenogenici da parte della varietà triploide, di per sè sterile


•  Mutation breeding: ha incominciato ad affermarsi dopo la

seconda guerra mondiale, in concomitanza con l’interesse verso le applicazioni pacifiche dell’energia nucleare

•  Vantaggio: può essere applicato per creare variabilità

riguardo una o poche caratteristiche in materiali genetici di pregio (es. genotipi già utilizzati nella coltivazione)

•  Svantaggi: mutazioni sfavorevoli accanto a quelle favorevoli ed effetti pleiotropici

Mutagenesi sperimentale

•  Organi vegetali sottoposti ad agenti mutageni: semi,

polline, organi di propagazione vegetativa

•  Agenti mutageni

•  Fisici (raggi UV, X e γ)

•  Chimici (EMS)



Sostituzione GC/AT e mutazione puntiforme

•  M1: prima generazione dopo il trattamento mutageno

(ottenuta da organi mutagenizzati)

•  La maggior parte delle mutazioni sono recessive, per cui il loro effetto fenotipico non è osservabile in M1

•  Alcune eccezioni

•  Tranne che nel caso di trattamenti al polline, le piante M1 presentano una s ituazione chimerica (tessuti geneticamente diversi in un individuo)


Manifestazione della mutazione nella generazione M2

Solo se le cellule mutate danno origine al tessuto sporigeno la mutazione si manifesta in M2

•  Perché l’evento di mutazione sia osservabile in M2 (ottenuta per

autofecondazione della M1) è necessario che:

•  Le cellule mutate non perdano vitalità o rapidità di moltiplicazione. Se ciò avviene, si verifica competizione con cellule non mutate nella chimera per la formazione del tessuto sporigeno

•  Le cellule mutate diano origine alle cellule sporigene

•  Ordine di grandezza: 20000-40000 piante M2

•  Le mutazioni in M2 vengono poi confermate in M3

Dalla M1 alla M2 alla M3

• Trattamento con EMS

• 2000 piante M1

• 27000 piante M2

• Screening in M2 attraverso inoculo artificiale

• Conferma della mutazione in M3

Esempio applicativo di mutagenesi sperimentale

Siamo nell’era post-genomica…

Questo significa che, in molti casi, conosciamo le sequenze di geni e loro funzione

Possiamo mutare specifici geni con funzione nota…

MLO loss of function mutation leads to powdery mildew resistance

•  TILLING: Targeting Induced Local Lesions IN Genomes

•  Il TILLING permette di identificare, in una popolazione sottoposta a trattamento mutageno, individui recanti mutazioni in geni specifici di interesse

•  A differenza del mutation breeding, in cui i mutanti desiderati sono selezionati analizzando il fenotipo…

•  …con il TILLING si identificano i mutanti desiderati attraverso l’analisi del genotipo

•  Oltre che per scopi applicativi (miglioramento genetico), il TILLING costituisce un approccio di genetica inversa importante per studi di base

Mutagenesi mirata a geni specifici: TILLING

TILLING

TILLING

PCR amplification with fluorescently tagged, gene-specific primers

Amplicons are denaturated and re-annealed, resulting in heteroduplexes between the mutated sequence and its wild-type counterpart

Heteroduplexes are specifically cut by the endonuclease activity of the enzyme CEL1

Different labeled fragments for LiCOR analysis

Strategie cutting-edge per il knock-out genico: TALEN

Le proteine TAL (transcriptional activator-like) sono effettori prodotti dal genere Xanthomonas, che promuovono la patogenesi attraverso specifico legame con il DNA, che a sua volta risulta nella regolazione positiva di specifici geni della pianta Le proteine TAL hanno 12-27 ripetizioni a tandem di 33-35 aa Due aa all’interno della ripetizione determinano legame specifico con un nucleotide e, dunque, permettono di legare specifiche sequenze

Cermak et al. 2011

Per la mutagenesi, si utilizzano vettori che codificano per effettori TAL fusi con la nucleasi Fok1 (da cui il nome TALEN) Poiche Fok1 operata come dimero, i TALENs sono disegnati su strand opposte delle regioni target Durante il processo di riparazione si generano piccole delezioni/inserzioni, con conseguente knock-out genico

Cermak et al. 2011

Strategie cutting-edge per il knock-out genico: TALEN

ZF sono fattori di trascrizione eucariotici La specificità dei ZF si basa sui domini zinc finger, che riconoscono 3 bp ZF chimerici legati alla nucleasi Fok1 (ZFN) sono customizzati e usati per il taglio del gene di interesse, così come visto per I TALENs

Urnov et al. 2010

Strategie cutting-edge per il knock-out genico: ZFN

ZFN and TALEN

Kiefer 2011

ZFNs and TALENs can be also used for gene editing

Curtin et al. 2012

Keep in mind:TILLING is not transgenic,ZFNs, TALEN might be not

•  Argomento propedeutico a comprendere le tecniche che

portano all’ottenimento di piante transgeniche:

•  Permette di clonare (produrre un gran numero di copie) specifiche porzioni di DNA (es. geni)

•  Due enzimi fondamentali:

–  Enzimi di restrizione (endonucleasi di restrizione)

–  DNA ligasi

Tecnologia del DNA ricombinante

•  Si trovano in natura prodotti da batteri per osteggiare infezioni virali (EcoRI: E. coli, HindIII: Haemophilus influezae, etc.)

•  Riconoscono specifiche sequenze di coppie di basi (sito di restrizione) del DNA dove operano un taglio (idrolisi del legame zucchero/fosfato)

•  Il taglio avviene tra il carbonio al 3’ ed il gruppo fosfato del legame fosfodiesterico

Enzimi di restrizione

•  Gli enzimi di restrizione comunemente riconoscono sequenze di DNA che sono palindromiche: sequenze di nucleotidi che si leggono allo stesso modo da sx a dx e da dx a sx

•  Il taglio degli enzimi di restrizione può dar luogo ad

estremità sporgenti (protruding) a singolo filamento oppure estremità piatte (blunt). Le estremità sporgenti sono anche dette coesive

Enzimi di restrizione

La DNA ligasi normalmente catalizza la formazione di legame fosfodiesterico tra i frammenti di Okazaki

DNA ligasi

•  Isolamento del DNA di un organismo

•  Taglio del DNA dell’organismo mediante enzima/i di restrizione

•  Taglio del DNA di un vettore di clonaggio (molecola di DNA capace di replicarsi in un organismo ospite, es. una cellula batterica) con lo stesso enzima/i di restrizione

•  Ligazione dei frammenti di DNA dell’organismo all’interno del vettore di clonaggio (più facile per enzimi che generano estremità sporgenti coesive) e ottenimento di una molecola di DNA ricombinante (ovvero DNA ottenuto dall’unione di frammenti da differenti fonti)

•  Trasformazione (inserimento del vettore ricombinante all’interno di cellule dell’organismo ospite, es. con elettroporazione o metodi chimici) e recupero delle molecole di DNA ricombinante

Tecnologia del DNA ricombinante

•  I plasmidi sono i più diffusi vettori di clonaggio •  I plasmidi sono molecole di DNA a doppia elica

extracromosomiche, presenti nei batteri

•  I plasmidi si replicano prima della divisione cellulare batterica in modo tale che le cellule figlie contengono anch’esse almeno una copia del plasmide

•  Hanno una relazione parassitaria e simbiontica con il

batterio

Vettori di clonaggio

I plasmidi oggi utilizzati nella tecnologia del DNA ricombinante non sono naturali ma costruiti artificialmente e si replicano nel batterio E. coli. Gli elementi fondamentali del vettore di clonaggio sono:

• Sequenza ori (origine della replicazione)

• Un marcatore selettivo (per selezionare le cellule di E. coli trasformate con il plasmide, es. gene di resistenza all’antibiotico ampicillina) • Siti unici di taglio per diversi enzimi di restrizione (sito di clonaggio multiplo o polilinker)

Vettori di clonaggio

Vettori di clonaggio plasmidici

Se il DNA esogeno è inserito nella regione polilinker non si produce beta-galattossidasi funzionale. Quindi, le colonie di E. coli, piastrate in terreno di coltura contenente la sostanza chimica X-gal, appariranno bianche quando contengono DNA esogeno, altrimenti blu.

•  Organismi transgenici: organismi caratterizzati dall’introduzione

artificiale di transgeni, ossia geni diversi da quelli presenti nella specie cui l’organismo appartiene

•  La possibilità di ottenere piante transgeniche permette dunque di superare le barriere riproduttive tra le specie e aumentare la variabilità a disposizione del miglioramento genetico

•  Organismi geneticamente modificati

•  Caratteristiche oggetto di trasformazione: resistenza ad erbicidi ed insetti di natura monogenica

•  Colture oggetto di trasformazione: quelle economicamente più importanti. Al momento, 4 specie agrarie hanno varietà transgeniche coltivate su larga scala

Organismi transgenici

Global area of biotech crops, 1996-‐2011

Source: Clive James, 2012

13ο Συνέδριο, Ελληνική Επιστημονική Εταιρεία Γενετικής Βελτίωσης Φυτών Καλαμάτα, Οκτώβριος 2010


Global area of Biotech crops, 1996-‐2011

§  By crop (million hectares)



Global adop9on rates (%) for principal

§  Biotech crops 2011 (million hectares)


•  Diversi sono i metodi che permettono di ottenere piante transgeniche

(metodi di trasformazione). Tutti si basano sulla totipotenza delle cellule vegetali, oltre che, naturalmente, sulle tecniche di clonaggio del DNA

•  Per totipotenza si intende la possibilità di (quasi) tutti i tipi di cellule vegetali di rigenerare, in opportune condizioni, un organismo intero (talee, micropropagazione)

Piante transgeniche

Rigenerazione tramite callo

Trattamento della foglia con disinfettanti

Espianto fogliare su terreno a bassa concentrazione di fitormoni

Formazione di callo

Sub-coltivazione del callo

Induzione di germogli su terreno a basso rapporto auxina/citochinina Induzione di radici su terreno ad alto rapporto auxina/citochinina

Rigenerazione tramite protoplasti

Si pone lo strato di epidermide su terreno contenente cellulasi e pectinasi

Centrifugazione e recupero dei protoplasti

Coltura dei protoplasti

Coltura di callo

Rigenerazione

Filtrazione della miscela attraverso un filtro con porosità di 100 µm

Si disinfetta la superficie di una foglia e si pela uno strato di epidermide

Coltura di cellule in sospensione

Metodi di trasformazione

Agrobacterium-mediatedParticle Gun

PEG+Electrop.

nda21%

7% 7% 64%

A. tumefaciens

A. tumefaciens

1.  La formazione di galle dipende dalla presenza del plasmide Ti (tumor inducing).

2.  Elementi del plasmide Ti: 1.  Regione ori 2.  T-DNA, integrato casualmente all’interno del genoma

vegetale. Contiene i geni oncogeni (Tum) e i geni Nos, che permettono la sintesi di opine. Delimitato da sequenze border di 25 bp (LB e RB)

3.  Geni vir (necessari per il riconoscimento delle sequenze border e il trasferimento del T-DNA). Attivati da sostanze rilasciate in corrispondenza di ferite, come l’acetosiringone

4.  Geni Noc (catabolismo delle opine)

A. tumefaciens

Per il trasferimento del T-DNA, sono determinanti LB, RB e i geni vir, ma non altri geni, che possono essere rimossi per applicazioni biotecnologiche

A. tumefaciens

Sistema binario: due vettori plasmidici: 1.  Plasmide helper:

¡  sequenza ori ¡  geni vir

2.  Vettore binario: ¡  sequenza ori ¡  T-DNA comprendente LB, RB, gene marcatore per

selezione vegetale (es. KanR) e polilinker (MCS) in cui inserire il transgene

¡  Poiché il vettore binario prima di essere trasferito in Agrobacterium viene clonato in E. coli, è presente anche una sequenza ori specifica per E. coli e un marcatore di selezione batterica (es. AmpR)

A. tumefaciens: vettore binario

Rigenerazione cellule trasformate

• Eliminazione di A. tumefaciens (es. con carbenicillina)

• Sfruttamento della totipotenza e rigenerazione piante transgeniche

¡  I protocolli di trasformazione con A. tumefaciens riguardano in massima parte le dicotiledoni

¡  Metodi alternativi

Altri metodi di trasformazione

Il DNA di interesse viene legato a microproiettili, che, accellerati da macroproiettili, impattano sulle cellule target ad alta velocità

Metodo biolistico

Metodo biolistico

Control plate – cells were shot with tungsten particles without DNA

Cells of a mutant of Chlamydomonas that had a deletion in the atpB gene for photosynthesis was bombarded with the intact atpB gene. Then, the cells were transferred to minimal medium so that only photosynthetically competent cells could grow

Metodo biolistico

•  Utilizzato su cellule senza pareti cellulari (cellule animali, protoplasti)

•  Scariche elettriche provocano la formazione di pori nella membrana, attraverso cui penetra il DNA

Elettroporazione

Il dibattito sulle piante transgeniche

•  Incremento delle produzioni

•  Miglioramento della qualità nutrizionale dei prodotti

•  Sostenibilità ambientale

•  Vantaggi economici per i produttori e i consumatori, oltre che per il costitutore varietale

•  Effetto positivi sulla biodiversità, in considerazione di rese maggiori e la minore sottrazione di habitat naturali

•  Molecular farming e produzione di biofuel

•  Etc.

Potenziali vantaggi dall’utilizzo di piante transgeniche

Vantaggi dall’utilizzo di piante transgeniche

•  Partiamo da un presupposto: l’agricoltura, per sua definizione, ha un’azione distruttiva sull’ambiente e sugli ecosistemi naturali. Tale azione distruttiva è maggiore nel caso si ricorra a sistemi intensivi, che fanno ampio ricorso a input esterni

•  Pertanto, i rischi ambientali dovuti alla coltivazione delle piante transgeniche dovrebbe essere sempre relazionato ai benefici che esse determinano se sono capaci di diminuire l’utilizzo di pesticidi, erbicidi, etc.

Potenziali rischi per l’ambiente

•  Rischi ambientali sono: 1.  Effetto sull’ecosistema: es. il mais Bt è stato messo da alcuni autori in

relazione ad effetti nocivi nei confronti di organismi non target (che dire dei pesticidi utilizzati in alternativa?)

2.  Il trasferimento genico di resistenze ad erbicidi verso specie infestanti (via incrocio o trasferimento genico orizzontale) potrebbe portare allo sviluppo di super-infestanti. Attenzione dovrebbe essere dunque posta soprattutto in zone in cui sono presenti specie selvatiche affini

3.  Perdita di biodiversità dovuto alla sostituzione di varietà locali con altre GM (varietà migliorate non transgeniche hanno però avuto in passato lo stesso effetto)

•  Sarebbe dunque giusto, così come per qualsiasi innovazione tecnologica, testare

accuratamente l’impatto ambientale di piante transgeniche prima della loro commercializzazione (e metterlo in relazione con le pratiche agricole che andrebbero a sostituire). Istituzioni no profit

•  In ogni modo: non è possibile, con le conoscenze attuali, dire se una pianta transgenica è sicura per l’ambiente al 100%...

•  E’ sicuro che l’utilizzo di antiparassitari ed erbicidi, così come la sottrazione di habitat naturali e l’agricoltura in generale non sono attività environmental friendly

Potenziali rischi per l’ambiente

•  In tanti anni, nessuna ricerca ha dimostrato con certezza un effetto avverso derivante dal consumo di prodotti GM.

•  In ogni modo, non è dato sapere con assoluta certezza l’effetto dei singoli eventi di trasformazione sulla salute umana…

•  …comunque sia molte varietà oggi in commercio sono il risultato di trattamenti a raggi X e gamma, o incroci con specie selvatiche non alimentari

•  Potenziali rischi: •  Sostanze capaci di provocare allergie •  Presenza di marcatori selettivi che conferiscono resistenza agli

antibiotici (si potrebbe avere trasferimento di tali geni in organismi patogeni per l’uomo)

•  Anche in questo caso, è ovvio che Istituzioni non mosse da interessi economici dovrebbero attentamente valutare ogni singolo evento di trasformazione

Potenziali rischi per la salute umana

•  Non si può a priori prendere posizioni sulle piante transgeniche…

•  Andrebbero valutati i singoli eventi di trasformazione sulla base dei rischi e benefici…

•  Si potrebbe incentivare il rilascio di varietà transgeniche con chiari effetti positivi sulla salute umana e sull’ambiente e che presentino rischi non ovvii.

•  Ricerca pubblica su piante transgeniche potrebbe garantire maggiori benefici per la comunità e gli agricoltori locali, rispetto a quelli derivanti dalla ricerca di multinazionali (es. Golden Rice)

•  In un mondo perfetto, non sovrappopolato, non inquinato, con accesso al cibo per tutti, si potrebbe anche fare a meno degli inevitabili rischi correlati alla produzione di piante transgeniche…

•  Considerazioni economiche particolari relative all’Italia: in considerazione dell’opinione pubblica negativa, della vocazione turistica, della qualità delle produzioni locali e dell’incapacità di essere competitivi con tipi di agricoltura intensiva, forse potremmo fare a meno delle piante transgeniche

•  La ricerca non può farne a meno!!!

In conclusione..

Piante transgeniche in ricerca…

•  Possibili mutazioni

•  Mutazioni avvengono continuamente nei genomi di tutti gli organismi

•  Il mutation breeding ha prodotto numerose cultivar oggi comunemente utilizzate

•  Comunque, tentativi ci sono per determinare a priori il sito di inserzione del transgene

•  Trasformazione plastidica è sito-specifica e avviene per ricombinazione omologa

Inserzione casuale del transgene

Ricombinazione omologa nella trasformazione plastidica

•  Trasferimento genico orizzontale di resistenza ad antibiotici a batteri patogeni

•  Trasferimento genico verticale (attraverso incrocio) a specie infestanti di resistenze ad erbicidi. Oppure la specie coltivata diventa essa stessa infestante

•  Procedure di trasformazione alternative (piante transgeniche marker-free)

Presenza del marcatore selettivo

•  Rinuncia al marcatore selettivo (efficiente metodo di trasformazione e screening PCR). Pochi casi in cui è economicamente conveniente

•  Utilizzo di marcatori che non siano geni di resistenza ad antibiotici o erbicidi (pertanto, quando si parla di marker-free, si fa normalmente riferimento ai marcatori di selezione tradizionali)

•  Rimozione del marcatore dopo la selezione di cellule/piante transgeniche

Strategie per piante transgeniche marker free

•  Es. sistema basato sulla fosfo-mannosio isomerasi (PMI)

•  Gene che consente alle cellule di vivere in un mezzo contenente mannosio come sola fonte di carbonio

Utilizzo di marcatori diversi da resistenze ad antibiotici/erbicidi

Rimozione del marcatore dopo la rigenerazione: co-trasformazione ¡  Marcatore di selezione e gene di interesse sono su due

T-DNA, all’interno dello stesso vettore o su due diversi vettori

¡  Selezione positiva con il marcatore di selezione

¡  Identificazione di piante contenenti anche il transgene in un altro locus non associato

¡  Selezione in una progenie segregante di piante con il solo transgene

¡  Meno efficiente e più costoso della normale trasformazione, non è possibile per specie che si riproducono vegetativamente o che hanno un ciclo molto lungo

Ricombinazione sito-specifica

¡  Ha luogo in corrispondenza di particolari siti di escissione (es. loxP del batteriofago P1, FRT di S. cerevisiae, Rs di Zygosaccharomyces rouxii)

¡  Necessarie ricombinasi (rispettivamente Cre, FLP, R) che riconoscono i siti di escissione

Rimozione del marcatore per ricombinazione sito-specifica

¡ Il marcatore selettivo è presente all’interno dei siti di escissione. Bisogna esprimere le ricombinasi

Ricombinasi


Es. vettore che sfrutta la ricombinazione sito specifica:

l  All’interno dei siti di escissione Rs vi è il gene per la ricombinasi R fusa ad un dominio (LBD) che la rende inattiva

l  All’interno dei siti di escissione si trovano anche nptII

(resistenza a kanamicina) e codA (citosina deaminasi), la cui espressione è letale in mezzi con fluorocitosina (FC)

l  Selezione positiva cellule trasformate, attivazione della ricombinasi con desametasone (DEX) e selezione negativa in mezzo con FC delle plantule contenenti il solo transgene. PCR conferma il genotipo delle piante ottenute da doppia selezione

3. Presenza di sequenze di origine batterica o virale

¡  Transgeni, marcatori selettivi, regioni promotore e terminatore, sequenze plasmidiche comprese tra LB e RB

¡  Produzione di nuovi vettori che abbiano quante più sequenze di origine vegetale

¡  Trasferimento genico che sfrutta la ricombinazione sito-specifica

¡  Trasformazione plastidica (soltanto la sequenza desiderata si integra nel genoma per ricombinazione omologa)

4. Trasferimento genico (piante non transgeniche o specie selvatiche)

¡  Introduzione di geni associati al gene di interesse che riducono la fitness delle piante che derivano da incrocio

¡  C o l t i v a z i o n e i n a m b i e n t e p r o t e t t o , sterilizzazione del polline

¡  Trasformazione plastidica ( impossibi le

contaminazione con polline)

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