Dalla cosoppressione ai non-coding RNA

Si distinguono due tipi di HDGS:• Transcriptional Gene Silencing (TGS)• Post Transcriptional Gene Silencing (PTGS)

• Entrambi i tipi di HDGS sono frequentemente associati con “sequence-specific de novo methylation”• Entrambi i tipi di HDGS possono essere associati con la presenza di IRs• HDGS puo’ dare inattivazione sia in cis che in trans

Transgene Silencing Phenomena

• Inattivazione Epigenetica:E’ dovuta a presenza di copie multiple di una data sequenza/gene nel genoma; dipende da interazione tra copie omologhe, i.e. Homology-Dependent Gene Silencing (HDGS)

TGSTGS come perdita dell’espressione di geni/transgeni

normalmente espressi• Assenza sia dei trascritti maturi che dei precursori• Lo stato silenziato è mantenuto ad ogni ciclo mitotico, ed è anche trasmesso alla progenie.• A bassa frequenza, si osserva riattivazione spontanea (reversione) del locus silenziato. Geni (endogeni e/o trans) silenziati sono caratterizzati da • pattern alterato di metilazione (strategia tipicamente vegetale)• struttura cromatinica alterata (come in Drosphila e lievito)

PTGS

PTGS come soppressione dell’espressione genica x degradazione del (trans)gene RNA

• Avviene nel citoplasma, ed è gene-specifico• Il livello di trascrizione è inalterato (run-on)• Caratterizzato da 3 punti: inizio, propagazione e mantenimento• Rappresenta un meccanismo di difesa dalle infezioni virali Geni (endogeni e/o trans) silenziati sono caratterizzati da: • Pattern alterato di metilazione (strategia tipicamente vegetale)• Struttura cromatinica alterata (come in Drosphila e lievito)

Caenorhabditis elegans RNAinterference

Drosophila

RNAinterference

Neurospora crassa Quelling

Plants PTGS

• Meccanismo comune e altamente conservato mediato da dsRNA

• RNA silencing è un meccanismo di degradazione di RNA sequenza-specifico

• Richiede attività di un set di geni altamente conservati

dsRNA sintetizzato sia nel nucleo che nel citoplasma:• trascrizione attraverso IRs, • sintesi parallela di senso/antisenso• replicazione virale• attività di cRdRP o vRdRP

dsRNA

senso/antisenso siRNAs (21/25 nt)

RNaseIII

RNA Silencing come meccanismo di difesa???

I virus possono indurre RNA silencing:VIGS (Virus Induced Gene Silencing) può colpire sia transgeni che geni endogeniMolti virus codificano per proteine soppressori del silencing (p25; HC-Pro)

PDR* (Pathogen-Derived Resistance) nelle piante dipende da silencing del transgene virale:Silencing del transgene e degli RNAs virali omologhi* la resistenza è indotta mediante trasformazione stabile delle piante con un trasgene virale

Esperimenti di grafting con piante di tabacco

transgeniche: • 35S-Nia 2 (nitrato reductase)• 35S-Nii1 (nitrito reductase)

Stock: pianta innestataScion: innestoS: SilenziatoNS: Non SilenziatoBeheaded: pianta decapitata

Fenotipo silenziato: clorosi delle foglie

S NS

NS scion/S stock

beheadedNS stock

S scion/S stock

NS shoot/NS stock

Analisi Northern dei livelli steady-state dei messageri

nelle piante transgeniche innestate e non:

• piante transgeniche per Nia

• piante transgeniche per Nii

• piante transgeniche per UidA

• * indica la parte dell’innesto da cui sono stati

estratti gli mRNA

PTGS trans-gene

specifico

PTGS trans-gene

specificoPresenza del transgene necessaria

Presenza del transgene necessaria

• de novo PTGS degli innesti NS con efficienza del 100%

• La trasmissione della co-soppressione dalle piante S agli

innesti NS è locus-indipendente:

• indipendente dal transgene utilizzato

• indipendente dal numero di copie del T-DNA

• indipendente dalla struttura del transgene

• indipendente dalla posizione genomica del T-DNA

• PTGS non è indotto/causato dalla tecnica dell’innesto:

innesti NS su piante WT non diventano S

• La trasmissione della co-soppressione è unidirezionale:

da pianta S ad innesto NS

• L’informazione che induce de novo PTGS può migrare

anche a distanza:

innesto a sandwich: pianta S/stelo WT 30cm/ innesto NS• La trasmissione del PTGS non necessita delle radici della

pianta S• Il segnale di silencing è (trans)gene-specifico

Modello x l’ RNA silencing

• Sia l’RNA-directed DNA methylation (RdDM) che il

PTGS/RNAi sono attivati da RNAds, digeriti da Rnase III (Dicer,

CAF) in piccoli siRNA, probabilmente sia nel nucleo che nel

citoplasma• Nel citoplasma i siRNA servono anche da inneschi x

digestione endonucleolitica e degradazione di mRNA

endogeni omologhi in associazione con l’ RNA-induced

silencing complex (RISC)• Nel nucleo i siRNA potrebbero mediare la metilazione di

DNA omologo. L’RdDM mediato da RNA può interagire con il

cromodominio della cromometilasi• Gli RNA virali in replicazione producono dsRNA attraverso

una RdRP virale

Systemic Silencing

RNA silencing indotto localmente, MA diffusibile

……….SILENCING SIGNAL???• contenente un acido nucleico come componente,

per conferire sequenza-specificità• il “silencing signal” può circolare attraverso i “sieve

element” del floema raggiunti dalle “cellule

compagne”

Il segnale di silencing è rappresentato dalle siRNA??

Evidenze a favore:• siRNA sono sempre associate con RNA silecing• abbastanza piccole da muoversi facilmente • abbastanza grandi da conferire specificità di sequenza • sufficienti x indurre silencing in sistemi animali

Evidenze contro:• la soppressione da HC-Pro elimina siRNA, ma non il silencing sistemico• i mutanti rde di C.elegans mancano di siRNA ma non di silencing sistemico

Altri candidati:• dsRNA lunghi, i precursori dei siRNA• RNA aberranti• un complesso RNA-proteine mobile non identificato

Modello per le modificazioni di DNA/cromatina indotte da siRNA, derivati da dsRNAdsRNA è prodotto da trascrizione

di IRs o hairpin di RNA e processato da Dicer in siRNAGli siRNA sono incorporati in un complesso RNAi effector (RNAi C), che recruta una Histone Metiltransferasi (HMT). RNAi C è recrutato sulle sequenze target che saranno metilate in Lys9 dell’istone H3 (Me). Proteine del tipo Crodomain (CD) sono recrutate sugli istoni modificati e questa interazione è necessaria per la diffusione dello stato silenziato. Lo stato silenziato può anche essere “bloccato” da successiva metilazione del DNA (DNA MT).

Modello per l’interazione tra la condensazione cromatinica e la metilazione

• Complessi proteici con funzione di repressori interagiscono con la regione transgenica a causa o della sequenza o della struttura secondaria

• Alcune di queste proteine inducono metilazione de novo

• Durante la replicazione, il complesso proteico si disassembla dal DNA ma il pattern di metilazione è mantenuto sul filamento parentale

• La metilazione sul filamento parentale funge da segnale x metilazione del nuovo filamento e riassociazione del complesso proteico

Induzione del“transgene silencing”

5’3’ 5’

3’

Complesso repressore

Condensazione cromatinica

5’3’ 5’

3’

Mantenimento del“transgene silencing”

5’3’ 5’

3’M M

M M

Metilazione del DNA

5’3’ 5’

3’M M

M M

Metilazione de novo

5’3’ 5’

3’M M

M M

5’3’ 5’

3’M M

M M

Metilazione de novo

5’

3’ 5’

3’

M M

5’

3’ 5’

3’M M

Replicazione DNA

Classe Lunghezza Biogenesi Meccanismo FunzionemiRNA ~22 taglio 2-step repressione trad sviluppo &

di hairpin taglio mRNA differenziam

(Drosha e Dicer)siRNA 21-22 taglio di lunghi taglio mRNA ??(ta-siRNA)endogeni dsRNA endogeni

(Dicer)

siRNA 24-26 taglio di lunghi Modificazioni Silencing diRepeatAssociated dsRNAderivati da IRs istoni/DNA virus, siRNA(ra-siRNA) (Dicer) geni ripetuti, trasposoni

Quanti e quali ncRNA???

Dicer-Like (DCL): 4 geni in Arabidopsis, caratterizzati da domini Rnase III in tandemArgonaute (AGO): 10 geni in Arabidopsis, caratterizzati da un dominio RNA binding (PAZ), ed un dominio Rnase-HRNA-Iinduced Silencing Complex (RISC): complesso citoplasmatico media sia il taglio endonucleolitico che l’inibizione traduzionaleRNA-induced Initiation of Transcriptional Silencing (RITS): complesso nucleare, media il silenziamento trascrizionaleRNA-Dependent RNA polymerase (RDR): 6 geni in Arabidopsis, di cui 3 ridondaanti (3,4,5); enzima che converte l’ssRNA in dsRNA, con modalità sia primer-dipendente che indipendentedsRNA Binding Proteins (DRB): cofattori che agiscono nel trasferimento di sRNA ai complessi effettoriHEN1: proteina DRB, con attività metiltransferasica al C-terSDE3: un’RNA elicasi

Gli attori della regolazione genica mediata da ncRNA

miRNAChromatin siRNA ta-siRNA

Pathways di Silencingin Arabidopsis

Taglio nucleolitico

dovuto a miRNA o siRNA

Repressione traduzionale

dovuta a miRNA o siRNA

Silenziamento trascrizionale

causato da siRNA

Modalità d’azione di diversi ncRNAs

miRNAs

• sono ssRNA di 22nt circa• derivano da regioni intergeniche del genoma • sono processati da strutture di tipo stem e loop parziali• originano da trascritti più lunghi endogeni, di tipo hairpin, di circa 70nt• sono processati da Dicer negli animali, DCL (Dicer-like)/CAF (Carpel Factory) nelle piante• alcuni miRNAs presentano loci multipli nel genoma• a volte sono organizzati in clusters• regolano geni diversi da quelli adiacenti alle regioni intergeniche che li codificano• molti miRNAs sono conservati tra specie diverse, suggerendo un ruolo evolutivo importante nella regolazione genica

In quanto piccoli regolatori a RNA, i miRNA sembrano molecole ad alta efficienza nella regolazione a livello genico. Possono svolgere lo stesso ruolo delle proteine regolative ed anche fornire svariati vantaggi rispetto a queste ultime. • L’accoppiamento delle basi fra i miRNA ed i targets a DNA/RNA permette un riconoscimento altamente specifico, un lavoro che riesce molto meglio all’RNA che alle proteine.• Quando necessari, i miRNA sono prodotti più rapidamente di eventuali proteine• Il processo è più economico della sintesi di proteine regolative• Esiste un numero enorme di miRNA ed ognuno ha diversi potenziali targets con dibverse regioni di acccoppiamento

miRNAs sono digeriti da Dicer dal precursore hairpin in forma di duplex, con 2-3nt overhangs e sono detti pre-miRNAs. Questi sono trasferiti ad un pre-miRNP, complesso che contiene Argo e l’RNA elicasi. Cofattori svolgono il pre-miRNA in ss-miRNAs ed il pre-miRNP è trasformato in mi-RNP. miRNA riconosce i suoi targets mentre è parte del miRNP. Diversi effettori portono il miRNA in diversi pathways.

Modello per il pathway di biosintesi e attività dei miRNAs

Similitudini e differenze tra miRNA e siRNA

Modello per la biogenesi e l’attività di miRNA e siRNA

Struttura e Funzione della famiglia DicerDicer contiene un putativo

dominio elicasi, un dominio PAZ, 2 domini tandem Rnase-III e un dominio dsRNA-binding (dsRBD).Un’attività efficiente di Dicer richiede la presenza di un minimo stem length. Il taglio di Dicer produce il miRNA maturo di 21/25 nt. Per l’attività endonucleolitica Dicer necessita dei domini Rnase-III dimerici (dimero intramolecolare)

Nelle piante la maturazione dei miRNA è necessariamente diverso da quella nel mondo animale. Infatti:• Nelle piante non c’è l’omologo di Drosha• La famiglia di Dicer ha un livello di complessità molto maggiore di quella del mondo animale• Esistono 4 omologhi di Dicer in Arabidopsis, di cui due (DCL1,4) contengono motivi NLSs• Quindi i miRNA in pianta sembrerebbero prodotti nel nucleo• Quindi, la presenza di diversi Dicer può spiegare la complessità delle diverse classi di siRNA nelle piante (lunghi 21-22 o24-5nt)

ta-siRNAs

• trans-acting siRNA, lunghi 21nt• derivano da regioni genomiche, sia sul filamento senso che su quello antisenso• presenti in clusters spaziati di 21nt• derivano da lunghi dsRNA • il loro accumulo dipende da RDR6• differiscono dagli altri siRNA, in quanto i loro geni target non sono altamente omologhi a quelli da cui originano• agiscono in trans mediante taglio endonucleolitico della sequenza target complementare (10/11°nt)• il loro pathway, post-trascrizionale endogeno, è dipendente da: RDR6,AGO1,DCL1,HEN1,HYL1,SGS3