Dal paziente al “gene malattia”:il clonaggio posizionale del gene Met

Una storia di interazione fra Medicina e Ricerca

a cura di Debora Angeloni, Ph.D., Settore di Medicina

Scuola Estiva di Orientamento

Volterra 2010

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Molte malattie hanno base genetica. Ciò significa che mutazioni o alterazionidell’espressione di uno o più geni sono alla base del danno alla salute riportato dalpaziente.La ricerca sulle malattie genetiche ha l’obiettivo di identificare i geni responsabili, ecorreggere il danno d’espressione causa della malattia.Questa vasta area della ricerca e della cura della salute richiede in maniera irrinunciabileuna stretta interazione fra il Medico ed il Ricercatore, a tal punto che si è venutaformando la figura del Medico-Ricercatore, un professionista con vocazione personale ecompetenze professionali che si collocano fra il medico che si occupa della cura delpaziente, ed il ricercatore interessato ad investigare i meccanismi biologici di base.

Si definisce “gene malattia” un gene la cui alterata funzione causa un danno alla salute.Come si va alla ricerca di un gene malattia?

Esistono diversi metodi di ricerca, basati su screening genetici. Il principale, che siimpiega quando non si conoscono assolutamente le funzioni normali del gene di cui si èin cerca, è il positional cloning o clonaggio posizionale.Il positional cloning rappresenta un tipico caso in cui la ricerca parte dall’osservazionedel paziente e dalla descrizione della malattia, fatte dal medico, per proseguire in unlaboratorio di ricerca, in cui la tecnologia del DNA ricombinante e dell’ingegneriagenetica vengono estensivamente impiegate per individuare il gene mutato.Il passo successivo è rappresentato dalla ricerca di una cura possibile, che sarà di nuovo ilmedico a portare al paziente.

Nel 1986 è stata descritta la scoperta del primo gene malattia identificato mediantepositional cloning: il gene CGD (Chronic Granulomatous Disease) localizzato sulcromosoma Xp21, responsabile della malattia granulomatosa cronica. Molti altri geni daallora sono stati scoperti con questo metodo.In che cosa consiste il positional cloning? 1 2 3 4 5

Fig. 1. Schema logico di positional cloning

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Il positional cloning è una strategia per clonare un gene attraverso la definizione via viapiu' precisa della sua posizione in mappe genetiche e fisiche, fino all'identificazione dellacorrispondente sequenza di DNA in cloni genomici e/o di cDNA.L’idea di fondo è semplice: se una certa malattia ricorre in un nucleo familiare attraversole generazioni, ci deve essere alla base un gene mutato la cui trasmissione è responsabiledella trasmissione della malattia. I vari marcatori presenti sul genoma, e trasmessi “inblocco” all’interno di una famiglia, possono aiutare a localizzare esattamente la posizionegenomica del gene mutato. La mutazione deve essere presente anche in pazienti in cui lamalattia rappresenta un caso “sporadico” e non ereditario.Per studi di questo tipo è fondamentale disporre della collaborazione di interi nucleifamigliari affetti dalla malattia in studio.

Il caso del gene Met nel carcinoma papillare renale ereditario(Met in HPRCC)

Il carcinoma papillare renale colpisce preferenzialmente il sesso maschile rispetto alfemminile, con un rapporto di 3:1 ed una maggiore frequenza tra i 60 e i 70 anni. Ognianno, vengono diagnosticati in Europa circa 86.000 nuovi casi e in Italia 8.200 (5.600uomini e 2.600 donne). Questi tumori rappresentano il 3% di tutte le neoplasie nellapopolazione italiana.L'eziologia è ignota. Esistono diversi fattori di rischio:FamiliaritàEsiste una predisposizione familiare genetica allo sviluppo del carcinoma renale. Unastoria familiare di cancro renale è associata ad un rischio 4 volte superiore rispetto aquello della popolazione generale. I tumori renali ereditari non sono più del 2%. Lesindromi di von Hippel Lindau e di Birth-Hodgg-Dube ed il carcinoma papillare renaleereditario riconoscono una predisposizione genetica. Questi tumori tendono a insorgere ingiovane età.TabaccoIl fumo di tabacco raddoppia il rischio di insorgenza di un carcinoma del parenchimarenale. Un terzo dei casi di carcinoma renale sarebbe attribuibile al consumo di tabaccoSovrappeso e dietaL’obesità è tra i fattori di rischio più importanti per il carcinoma renale

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Fig. 2. Schema logico adottato dai laboratori dell’NIH (USA), per identificare geniresponsabili di tumori renali.

Fig. 3. Rene affetto da HPRC.

1. Studi Sugli Alberi Genealogici

Il primo passo del positional cloning consiste nel coinvolgere nello studio quante piùfamiglie affette. Ciò è importante perchè permette di fare studi di legame genico (geneticlinkage) . Detto in breve, il genetic linkage descrive la tendenza di certi loci cromosomiciad essere ereditati insieme. Loci genici fisicamente vicini sullo stesso cromosomatendono a stare insieme (a segregare insieme) durante la meiosi (divisione cellulare). Inuna famiglia, molti marcatori sono ereditati “in gruppo”. Se si individuano marcatorianonimi che co-segregano con il gene malattia, la loro posizione suggerisce dove sialocalizzato fisicamente il gene malattia.

Fig. 4. Co-segregazione del tratto malattia con un marcatore anonimo M”, quirappresentato da prodotti di PCR.

Journal of Urology 151: 561-566, 1994.

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L’allele malattia (simbolo solido) co-segrega con il marcatore M”. Importante: di questomarcatore non si conosce la funzione, ma si sa che fisicamente si trova sul cromosoma 7!(vedremo fra poco come si ottengono le “bande” verdi della figura…).

Osservate l’albero genealogico di seguito, 1) da quale coppia parentale pensate siatrasmessa la mutazione? 2) Pensate si tratti di un gene autosomico o legato a cromosomasessuale? 3) Mutazione dominante o recessiva? (Se pensate di non avere tutti gli elementiper rispondere, provate comunque a ragionare sui dati che avete: anche i ricercatoriformulano ipotesi quando – quasi sempre! – si trovano davanti a dati incompleti).

1)............................................................................................................................................2)............................................................................................................................................3)............................................................................................................................................

Fig. 5. Albero genealogico di famiglia affetta da HPRC. = femmina, =maschio. = individuo affetto dalla malattia

2. La Mappatura Genomica

Una volta reclutati i pazienti ed eseguiti studi di linkage che diano indicazione su qualesia il cromosoma coinvolto (supponiamo di avere scoperto che si tratti del 7), si possonousare altri metodi per contribuire a definire più in dettaglio la zona d’interesse. Unapossibilità è data dall’analisi cito-genetica con sonde specifiche provenienti da unalibreria genomica. In breve, il tratto di cromosoma viene ricostruito attraverso una seriedi cloni che ne contengano interamente la sequenza, anche se ovviamente frammentata.La figura di seguito mostra una ibridazione su DNA di nuclei interfasici (la cromatina èdispersa, qui colorata in blu) con una certa sonda specifica per un determinato frammentodi cromosoma 7 (segnale in rosso). Il segnale in verde è dato da una sonda specifica per ilcentromero del cromosoma 7.

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Che cosa vi suggerisce la presenza di tanti puntini rossi e due (o pochi) puntini verdi pernucleo?………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

Fig. 6. Nuclei interfasici ibridati con sonde specifiche per un tratto di cromosoma 7.

3. La Mappatura Fisica

Una volta identificata, grosso modo, la regione cromosomica critica (vedi sopra), occorreprocedere più finemente. Si cammina sul cromosoma, letteralmente si fa un“chromosome walking”, utilizzando i vari marcatori anonimi localizzati sul cromosoma,come se fossero pietri miliari per identificare l’esatto “indirizzo” del nostro gened’interesse.I marcatori non sono altro che brevi sequenze, di vario tipo, che in precedenza sono stateesattamente localizzate sui vari cromosomi, con metodi fisici. I marcatori sono stati unostrumento fondamentale per il sequenziamento dell’intero genoma umano. Sono tuttoraimportanti per gli studi di positional cloning.

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Immaginate di conoscere la mappa fisica (e quindi la distribuzione dei marcatori) in unaregione del cromosoma 7. Il vostro scopo è sapere quanti geni si trovano in quellaregione.

Si procede costruendo a partire dalla libreria genomica, in cui cloni di varia grandezzadanno una rappresentazione ordinata del tratto di genoma di nostro interesse, una mappadei geni trascritti (una libreria di cDNA).

Fig. 7. Costruzione di una sequenza contigua (“contig”) che riproduce il trattocromosomico d’interesse.

Come ordinare questi frammenti? Diversi metodi sono possibili. Dato che conosceteesattamente la sequenza dei vettori nei quali sono clonati i frammenti di cui sopra, èpossibile sequenziare brevi tratti adiacenti degli inserti (a colori) contenuti nei vettoridella libreria (in nero, vedi figura 8).Grazie al sequenziamento adesso conoscete le estremità dei cloni della vostra collezione(la sequenza nota è indicata, in figura, dalle scatoline colorate).

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Fig. 8. Vettori contenenti alcuni cloni della libreria genomica (inserti colorati).Diamo per assunto che le estremità sono state sequenziate. La loro sequenza èpertanto nota allo sperimentatore (rappresentata dalle scatoline colorate).

Cosa fareste per ordinare fisicamente (“comporre il puzzle”) i frammenti (cioè i clonidella vostra libreria), in modo che rappresentino davvero il tratto di cromosoma da cuiprovengono?Soffermiamoci sulla tecnica della PCR (polymerase chain reaction), che può essere utileallo scopo.La PCR è una tecnica enzimatica in vitro che ha lo scopo di produrre grandi quantità diDNA a partire da quantità minuscule e quindi non manipolabili.E’ fondamentale conoscere almeno un breve tratto di sequenza ai due lati del tratto diDNA che si intende amplificare (lo stampo). Su di essa vengono disegnati i primers (inrosso e verde nella figura) che funzionano da innesco per l’enzima (una polimerasi, nonrappresentata) che utilizzando il substrato presente nella miscela di reazione, dirige lasintesi del nuovo DNA.

Fig. 9. Schema rappresentativo della reazione di PCR. In verde: primer sinistro, inrosso: primer destro.

Fra le miscele di reazione proposte, quale usereste? Perchè?

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Quindi, tornando alla nostra libreria, come combinereste le informazioni ricavate dalletecniche di sequenziamento e PCR?

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4. L’analisi dei geni candidati

Supponiamo che grazie ad un’altra notevole frazione di lavoro sperimentale (o allaconsultazione di banche dati bio-informatiche) – che qui per brevità diamo per assunte -abbiate adesso a disposizione una descrizione della regione d’interesse in termini dicontiguità fisica e catalogo dei geni qui localizzati, il passo successivo consistenell’analisi dei cosiddetti geni candidati.

L’approccio di solito prevede l’uso di diversi metodi sperimentali (analisi di sequenza,analisi di espressione, analisi di metilazione, confronto con modelli animali).

In questa fase, il lavoro sperimentale torna a coinvolgere i pazienti.L’analisi dei geni candidati infatti viene fatta sul DNA estratto dai loro campioni eprocede, di candidato in candidato, finche non viene identificato il gene che si presentamutato in un numero statisticamente significativo di pazienti, così da suggerire che sitratti del gene responsabile della malattia.

Supponiamo che vi troviate davanti a diversi geni candidati.

Che domande vi porreste sul loro conto al fine di decidere una scala di priorità prima diiniziare ad analizzarli?………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

In conclusione, il gene di cui siamo stati a caccia è ..............., ..............., si trova sulcromosoma 7 ed è .............. in reperti citogenetici provenienti da materiale tumorale.

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Al termine del positional cloning, il gene Met è risultato insieme ad altri candidati “vicinidi casa”. Tuttavia le informazioni sulla sua funzione, ottenute da progetti indipendenti, lohanno messo al primo posto della scala di priorità per la successiva analisi di sequenza.

* *Fig. 10. Rappresentazione schematica del cromosoma 7, che indica la localizzazionedel gene Met in 7q31.1-34 fra i marcatori D7S496 e D7S1837 (asterischi).

L’analisi di mutazione su un grande numero di pazienti, affetti sia da malattia ereditariache sporadica, ha mostrato che almeno 10 diverse mutazioni (tutte missense) colpisconola sequenza codificante del gene Met.

Fig. 11. Analisi di sequenza di una mutazione di Met.

Le mutazioni sono raccolte nella zona codificante per il dominio enzimatico dellaproteina MET e causano una attivazione deregolata della proteina stessa. Ciò ha l’effettodi promuovere la proliferazione cellulare in maniera deregolata.